色谱柱的选择-博纳艾杰尔科技.ppt

液相色谱柱的选择,杨定忠 博纳艾杰尔科技 156119833289；dz_ 客 服：400-606-8099 2010年11月12月 广东,影响C18色谱柱性能的主要因素,色谱柱与色谱填料的特性 1、 柱填料 硅胶纯度 粒径 比表面积 孔径 2、 色谱柱的构型 色谱柱直径 色谱柱长度 3、 固定相 键合类型 残余硅羟基的影响 反相键合相的保留行为 键合硅胶的稳定性,物理因素,化学因素,柱填料对色谱柱性能的影响,柱填料对C18色谱柱性能的影响：硅胶纯度I,2.3-二羟基萘,2.7-二羟基萘,TF=1.31,Brand W, AQ Column 5m, 4.6mm150mm,Brand Z,C18 Column 5m, 4.6mm150mm,Venusil MP C18 5m, 4.6mm150mm,Brand H, C18 Column 5m, 4.6mm150mm,Brand U,C18 Column 5m, 4.6mm150mm,！,TF=1.42,TF=1.39,TF=1.69,TF=？,流动相： 甲醇：水=65：35 流速： 1 mL/min 温度： 35 检测波长： 230 nm 进样量： 20 L,硅胶纯度金属含量,柱填料对C18色谱柱性能的影响：硅胶纯度II,硅胶纯度金属含量,d,柱填料对C18色谱柱性能的影响：粒径,硅胶粒径和类型对柱效的影响,d,硅胶粒径和类型对压力的影响,柱填料对C18色谱柱性能的影响：粒径II,目前市场主要可供选择的填料粒径 1.7m，1.8m，2.2m 快速液相色谱柱：匹配快速色谱仪 2.7m 多孔壳层：在常规液相色谱仪上实现快速分离(Halo) 3.0m，3.5m 普通快速分析 5.0m 常规分析,颗粒越小，柱效越高, 但是耐污染性能下降，柱压升高.,柱填料对C18色谱柱性能的影响：比表面积,每克填料的表面积，与粒度，孔径有关 比表面积大，保留增加，载样量增加，平衡时间增加(梯度洗脱尤为注意) 根据需要选择合适的比表面积,柱填料对C18色谱柱性能的影响：孔径I,多孔材料的95%以上表面在孔内部 样品分子直径小于平均孔径，才能进入微粒内部 孔径至少是样品流体学直径的4倍 300孔径用于：超过50个氨基酸的肽或25个残基的低聚寡核苷酸,样品分子直径小于平均孔径，才能进入微粒内部,柱填料对C18色谱柱性能的影响：孔径II,小生物分子的保留值在小孔径填料通常更大,条件： C8色谱柱，4.6150mm， 3.5um， A溶剂，0.1%TFA水溶液； B溶剂，0.1%TFA于80%乙腈 水中； 20min梯度，10 30%B；60C， 1.5ml/min,色谱柱的构型对色谱柱性能的影响,色谱柱的构型对色谱柱性能的影响：长度和直径,色谱柱尺寸 对色谱分离的影响： 短柱 (15-100mm) - 运行时间短, 柱压低 长柱 (150-250mm) - 分辨率高, 运行时间长 窄径柱 ( 2.1mm) - 检测器灵敏度高 宽径柱 (3-21.2mm) - 载样量高,固定相对色谱柱性能的影响,固定相对色谱柱性能的影响：键合类型,A 纵向交联：保留和选择不稳定 B 横向交联：宽pH适用，Durashell， C 单体键合：重现性好，柱效高 D 单体（空间保护）：低pH稳定（Venusil ASB）,固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响,残余硅羟基的影响 普通硅胶当流动相的 pH 值大于 4.5-5.0 时，表面的硅羟基会带负电荷，碱性化合物拖尾。 解决方法 封尾 双层表面修饰,固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响,封尾 键合填料与小硅烷进行后续反应，如三甲基氯硅烷，反应掉部分残余硅羟基，以增加表面覆盖率。 缺点： 不能完全反应（仍有50%的硅羟基未被反应） 在pH3时，TMS易流失，耐用性，稳定性不好,TMS,固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响,不同长度和体积的键合相对表面覆盖率的影响,固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响,双层表面修饰 降低表面硅羟基活性，硅胶表面更加均匀,固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响,硅胶双层表面修饰后 新增加表面层硅羟基活性更低新硅羟基pH=5.2， 普通硅羟基pH约为3.5 更对称的峰型 硅胶表面更均匀硅胶微晶形成过程中的不光滑表面被覆盖 重现性更好 表面纯度更高硅胶金属杂质被覆盖 极性化合物保留和分离更好,固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响,双层表面修饰 代表产品： Venusil MP C18，Venusil ASB C18，Venusil HILIC,0.01 ng/mL Pseudoephedrine,Agela Venusil ASB C18, 2.150mm, 5m,Brand A C18 2.150mm, 5m,Phenomenex Luna C18, 2.050mm, 5m,固定相对色谱柱性能的影响：反相键合相的保留行为,同一厂家相同硅胶基质的反相柱： 保留值随含碳量的增加而增加 比表面积越大，保留值越大 键合碳链越长，保留越大 C18 C8C3C1，长链之间差别不大,固定相对色谱柱性能的影响：反相键合相的保留行为,不同厂家色谱柱的 保留值，选择性与峰型 色谱柱：4.6*150mm，流动相：乙腈0.05M磷酸钾缓冲液，pH3.2(65:35);流速：1ml/min，,拖尾峰,T0（尿嘧啶）,P: 吡啶 L: 苯酚 N: N,N-二甲基苯胺 B: 4-丁基苯甲酸 J: 甲苯,固定相对色谱柱性能的影响： 键合硅胶的稳定性,键合硅胶的稳定性 低pH值，键合相流失 高pH值，硅胶溶解 影响色谱柱寿命，方法不重现,固定相对色谱柱性能的影响： 键合硅胶的稳定性,低pH值，键合相流失,固定相对色谱柱性能的影响： 键合硅胶的稳定性,空间位阻保护，延缓键合相流失,空间位阻键合代表产品： Venusil ASB C18 Zorbax SB C18,固定相对色谱柱性能的影响： 键合硅胶的稳定性,高pH值，硅胶基质溶解,pH9时，色谱柱的稳定性,固定相对色谱柱性能的影响： 键合硅胶的稳定性,碳杂化，延硅胶缓高pH值水解,表面碳杂化 Agela Durashell RP,表面碳杂化示意图,博纳艾杰尔为您提供全面的LC解决方案,2010版药典LC方法开发服务 全面的色谱柱选择 低pH条件色谱柱（pH=0.8） Venusil ASB C18 高pH条件色谱柱（pH=1-12） Durashell C18 亲水色谱柱