中药药理实验方法学.ppt

药理学实验基础知识,开课目的：培养科学思维方法，严肃的科学态度，提高分析问题解决问题的能力。掌握基本实验操作技能和实验方法，为今后科学研究打下基础。 要 求：工作服、仪器领取、卫生打扫、动物处理。,实验动物分类： 按种系分三种情况 A、按遗传学控制方法分为4类：近交系动物、突交系动物、F1杂种动物、封闭群动物。 B、未经遗传学控制的杂种动物。 C、按微生物学控制方法分5类：无菌动物、悉生动物、无特殊病原体动物、清洁动物、普通动物。,我国将实验动物分为四级： 一级动物：普通动物（CV）-普通自然环境中饲养繁殖的健康带菌动物。（教学和一般实验用） 二级动物：清洁动物（CL）-用于一般动物实验，除一级标准外，还需要不带有动物传染病病原体。,三级动物：无特殊病原体动物（SPF），在CL基础上还需不带有干扰实验的微生物。 按纯系动物的要求进行繁殖，在隔离器内或层流室内饲养，只有一些不致病的细菌丛，没有致病的病原体。,四级动物：无菌动物（GF）和悉生动物（GN）。 GF：全封闭无菌条件下饲养的纯系动物，体内不带任何微生物和寄生虫（包括绝大部分病毒）； GN：要求在无菌动物体内植入一种或数种已知的微生物。 三、四级动物要求高，价格贵，适用于特殊目的和要求的实验。,实验动物的选择： a.选对与人的机能、代谢、结构、疾病特点和机能反应相近似的实验动物。药物的反应与人的反应相似的动物。 b.选用遗传背景明确，模型指标显著且稳定，解剖、生理特点符合实验目的的实验动物。,NIH小鼠,BALB/c小鼠,远交系小鼠，国际上广泛通用的实验动物，已选为某些生物制品检定的法规动物。,近交系小鼠，毛色黑色；补体活性高；较易诱发免疫耐受性；对结核杆菌敏感；干扰素产量高。是肿瘤学、生理学、免疫学、遗传学研究常用的品系。,C57BL/6J小鼠：近交系小鼠，乳腺肿瘤发生率低，但对致癌因子敏感。肺癌发病率雌性26，雄性29。对放射性照射极为敏感。用于肿瘤学、生理学、免疫学、核医学和单克隆抗体等研究。,BALB/c-nu裸鼠 ：无毛，裸体，T淋巴细胞缺损，可研究免疫功能和病毒细菌寄生虫感染机制等。,SD大鼠,Wistar大鼠,大鼠：远交系大鼠， 对呼吸道疾病抵抗力强，对性激素刺激性高，多用于生理、营养、安全性试验。,Wistar大鼠：远交系大鼠，抗病力强，自发性肿瘤发病率低，多用于肿瘤、免疫、药理、内分泌。,豚 鼠,对各种致病菌和病毒敏感，对组胺类药物有高度敏感性，自身不能合成维生素，易于过敏，耳蜗管对声波敏感，缺氧耐受性强，血清中补体丰富，皮肤对毒物刺激敏感等。,新西兰兔,家 兔,血清量较多，胸淋巴结明显，耳血管粗大，诱发性排卵，眼球大，发热反应典型恒定，对许多致病菌和病毒敏感，颈部神经血管和胸腔适合做急性心血管实验 ，皮肤对刺激反应敏感等。,Beagle犬,果 蝇,蚕,猴,小鼠：常用于药物筛选、急性毒性实验。价格便宜，繁殖周期短，易得。（1822g） 大白鼠：常用于抗关节炎实验、利胆实验、子宫实验、长期毒性实验（150200g）,豚鼠：研究平喘药和抗组胺药常用，对组胺特别敏感。毒理学中过敏实验（300500g） 家兔：常用于观察药物对呼吸、心脏、血管、肠肌运动的影响，热源检查、解热实验；雌兔用于避孕药研究和子宫实验。（1.52.5Kg）,犬：常用于慢性实验如高血压、胃瘘、肠瘘、冠脉流量，还有长期毒性实验。 其他动物：鸽子、蛙类、果蝇、蚕、猴、猫、鸭等。,分组方法： 分层分组法-按性别、体重、测定指标（如基础体温、痛阈）先分层，再分组； 随机数字表法：按随机数字表来分组。 编号：标记常用苦味酸（3%5%）、中性品红（0。5%）、硝酸银（2%）；方法见书，较大的动物如犬、猫等，可用号码牌挂在动物颈部或将特制的铝牌固定在耳壳上。,取血方法： 小鼠、大鼠-断尾、眼底（内眦球后静脉丛，小鼠可取0.20.3cc,大鼠可取0.51cc)、断头、颈动脉取血。 兔-耳缘静脉，心脏，股动脉 犬-后肢外侧小隐静脉，前肢背侧皮下头静脉，耳缘静脉 豚鼠-耳缘切割，心脏穿刺。,常用抗凝剂 草酸钾 饱和液2滴于试管中，80度以下烘箱烘干，可抗凝35ml血液。若测定钾、钙含量的不用。 肝素 1%肝素0.1ml于试管中，80100度烤干，可抗凝510ml血液 枸橼酸钠 3.8%枸橼酸钠1份，可抗凝9份血液。 血压实验用57%的枸橼酸钠抗凝。,实验报告或论文的书写,实验报告格式： 题目、目的、材料、方法、结果（表或图）、讨论、结论。 论文书写格式 题目、文摘、关键词、序、实验材料、方法、结果（表或图）、讨论（含结论）。参考文献,常用动物的捉拿和给药方法,捉拿 小鼠、大鼠、豚鼠的捉拿方法基本一致。家兔抓背部皮肤，另一只手托起臀部。狗用狗头夹夹住颈部后再抓。,给药： 途径-口服或灌胃、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、静脉注射。 静脉注射：家兔（耳缘静脉）、狗（后肢小隐静脉）、豚鼠（后脚掌外侧的静脉或颈外静脉）,给药剂量： 根据单位体重给药。,处死和处理方法,小鼠、大鼠、豚鼠：颈椎脱位法处死。 兔、狗、猫：静脉注射空气（1030ml）致死。 实验完毕后，动物按要求处死，送到指定地点焚烧。没有焚烧条件的，用袋子装好，送至指定垃圾站。,影响中药药理作用的因素,三大因素：药物因素、机体因素、环境因素 药物因素-品种、产地、采集时节、贮藏、炮制、制剂（剂型）、不同入药部位 机体因素-年龄、性别、体质、情志、病理状态、个体差异（种族、高敏、耐受、特异质、肠道微生物环境等） 环境因素-气候、季节、时辰。,为减少差异，应注意：,鉴定品种、一次性计算出实验用药物量后购买药物进行制剂加工（排除品种、产地、采集时节、贮藏、炮制、制剂等带来的影响）选择和临床用药一致的剂型（给药途径）（排除因给药途径不同导致的差异-生物利用度不同）。 选择年龄相同、批次相同、性别体重均衡的动物，遵循随机分组的原则，减少动物带来的差异。 动物连续给药时每天应在基本相同的时间进行。,药效学研究注意事项,新药申报资料中，和药理学实验内容相关的是药效学和毒理学两大项内容。 药效学：药物对机体的作用研究。按新药研究指南的要求，根据功能主治来设计实验项目。,注意点： 主要指标确定，按新药指南要求或咨询药审中心确定。 如抗癌中药研究 模型的选择：有文献依据、符合中医临床“证”的模型，方法要注意体内、体外相结合。,体外：重复性好，用药量少，节省动物。但干扰因素多。 体内：结果接近临床，必须做。 原则-体内、体外实验相结合。 药品： 品种鉴定（赤芍）、稳定工艺，现在要求用中试产品。量的问题。, 剂量：一般设三个剂量 低剂量-临床等效量 中剂量-临床等效量的2倍 高剂量-临床等效量的4倍,剂量换算,按人和动物的体表面积折算的等效剂量比值换算 小白鼠（20g）：人用量*0.0026*50 大白鼠（200g）：人用量*0.018*5 按“每公斤体重占有体表面积相对比值”换算 小鼠：人用量*1（小白鼠比值）/0.08（50Kg人的比值） 大鼠:人用量*0.47（大白鼠比值）/0.08（50Kg人的比值）,临床常用剂量折算法, 组的设置 一般设6个组：空白组、模型组、模型+小剂量组、模型+中剂量组、模型+大剂量组、模型+阳性对照组。 阳性组设置的目的：检验实验方法是否正确、比较同类产品的优劣。 阳性药：功效主治和实验药物一致，剂型尽量一致；必须是药典记载的、公认的疗效确切的药物。,数据处理 药理实验数据必须进行统计学处理。实验数据分为计量资料和计数资料。,计量资料：尿量、时间、次数、心率、血压等 计数资料（发生率）：死或活、惊厥或不惊厥、翻正反射消失或不消失、扭体或不扭等 。 不同资料统计方法不同，现在多用统计软件包处理。 结果： P0.05,说明两组间无显著性差异 P0.05,说明两组间有显著性差异 P0.01,说明两组间有非常显著性差异 举例:黄南星搽剂,药理实验设计三原则 -随机、对照、重复,随机分组-将受试样本随机遇而分组，以减少主观因素的影响和避免偏性误差。 对照：组间对照、自身对照 重复：实验的重复。如条件不允许，可增加每组的样本数。,一般药理学研究： 神经系统：行为、流涎、肌颤、瞳孔、自发活动等； 心血管系统：血压、心率、心电图。 呼吸系统：呼吸的频率、深度。 剂量-选用产生主要药效作用的23个剂量。区别毒理学实验的剂量。,毒理学研究主要内容,急性毒性实验 实验目的：观察药物一次性给药对动物带来的毒性和死亡情况。 通常测定半数致死量。如果求不出（毒性低），可测最大给药量。 半数致死量-指一群动物中半数动物死亡的剂量。 计算方法：比利氏法、孙氏改良蔻氏法等。,最大给药量测定方法,合格动物(小白鼠)分成2批，第一批分2组，药物组和对照组，药物组用最大浓度、最大体积给药，23次/24小时。第二天停药，连续7天，观察小鼠的体重、行为、分泌物、毛色及死亡情况。如有动物死亡，尸检肉眼观察并与对照组小鼠进行比较。必要时做组织学观察。 为何要观察7天？有可能是代谢产物中毒或迟发性中毒，几个小时看不出毒性。 结论：把一日累计量除以人临床用量求出相当于临床人用量的多少倍。,慢性毒性实验 实验目的：观察动物因连续用药对机体造成的损害、中毒开始的时间及停药后组织受损的发展和恢复情况。 实验动物：大白鼠（啮齿类）、犬（非啮齿类）。国际上要求大鼠要SPF级，犬用Beagle。 大鼠：56周龄；犬：612月龄。均雄、雌各半。 分组：低、中、高剂量组、对照组。（大鼠为每组至少20只，犬、猴为雌雄各36只）,给药时间：临床疗程的23倍。最长不超过半年。 给药途径：同临床给药途径。 观察指标：末次给药24小时后，处理一批动物。 一般观察：体重、进食量、外观、行为活动、粪便性状、分泌物（眼、鼻、肛门等），计算脏器系数。 脏器重量 脏器系数= 体 重,血液检查 血常规 血液生化 血常规：Hb、RBC、WBC、Pt、白细胞分类、凝血酶原时间。 血液生化：天门冬氨酸氨基转换酶、丙氨酸氨基转换酶、碱性磷酸酶、尿素氮、总蛋白、白蛋白、血糖、总胆红素、总胆固醇、肌酸磷酸激酶、甘油三酯等。还可测Na+、Cl-、K+浓度。,系统尸解和病理组织学检查 测量脏器系数 病理切片：心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、甲状腺、胸腺、睾丸、附睾、前列腺、卵巢、子宫、脑、胃、肠等。 附报告、照片。,可逆性观察（恢复期） 第一批动物处理后，停止给药，继续饲养观察，半个月或一个月后处死，观察指标同第一批鼠。把第二批检测指标和第一批检测指标进行统计对比，可看出停药后损害的恢复和发展情况。 犬的长毒：检测指标多一个心电图。,特殊毒理研究-刺激性、过敏性实验,皮肤用药：急毒、长毒、刺激性实验、过敏性实验。动物用兔或豚鼠。 黏膜用药：眼刺激性实验。用兔。 滴鼻剂、吸入剂：毒性和刺激性实验，用豚鼠或大白鼠。 直肠、阴道给药：毒性和刺激性实验。用兔或大白鼠。（药物接触至少4小时，观察24小时、48小时段全身症状和局部刺激）,三致-致畸、致癌、致突变,基因突变