动物生物化学实验指导

动物生物化学实验指导（修订版）武汉工业学院生物化学实验室规则1每个同学都应该自觉遵守课堂纪律，维护课堂秩序，不迟到，不早退，不大声谈笑。2实验前必须认真预习，熟悉本次实验的目的、原理、操作步骤，懂得每一操作步骤的意义和了解所用仪器的使用方法，否则不能开始实验。3实验过程中要听从教师的指导，严肃认真地按操作规程进行实验，并把实验结果和数据及时、如实记录在实验记录本上，文字要简练、准确。完成实验后经教师检查同意，方可离开实验室。4实验台面应随时保持整洁，仪器、药品摆放整齐。公用试剂用完后，应立即盖严放回原处。勿使试剂、药品洒在实验台面和地上。实验完毕，仪器洗净放好，将实验台面抹拭干净，才能离开实验室。5使用仪器、药品、试剂和各物品必须注意节约。洗涤和使用仪器时，应小心仔细，防止损坏仪器。使用贵重精密仪器时，应严格遵守操作规程，发现故障须立即报告教师，不得擅自动手检修。6实验室内严禁吸烟！加热用的电炉应随用随关，严格做到：人在炉火在，人走炉火关。乙醇、丙酮、乙醚等易燃品不能直接加热，并要远离火源操作和放置。实验完毕，应立即拨去电炉开关和关好水笼头，拉下电闸。离开实验室以前应认真、负责地进行检查水电，严防发生安全事故。7废液体可倒入水槽内，同时放水冲走。强酸、强碱溶液必须先用水稀释。废纸屑及其他固体废物和带渣滓的废物倒入废品缸内；不能倒入水槽或到处乱扔。8要精心使用和爱护仪器，如使用分光光度计时，不能将比色杯直接置于分光光度计上，并注意拿放比色杯时，不要打碎。仪器损坏时，应如实向教师报告，并填写损坏仪器登记表，然后补领。9实验室内一切物品，未经本室负责教师批准，严禁带出室外，借物必须办理登记手续。实验一 唾液淀粉酶活性的观察原理酶是指化学本质为大分子的生物催化剂。在一定条件下，酶促化学反应进行的能力即酶活性。影响酶活性的因素是多方面的，如温度、pH及某些化学物质等都会影响酶的催化活性。在一定条件下，能使酶活性达到最高时的温度即酶的最适温度，而能使酶活性达到最高时的PH即酶的最适PH。例如，唾液淀粉酶的最适温度是37，而其最适PH是6.8。能增高酶活性的物质称为酶的激活剂，能降低酶活性却又不使酶变性的物质叫酶的抑制剂。凡能使蛋白质变性的因素都可以使酶因变性而丧失活性。酶活性通常是通过测定酶促化学反应的底物或产物量的变化来进行观察的。本实验用唾液淀粉酶为材料来观察酶活性受理化因素影响的情况，唾液中含有唾液淀粉酶，唾液淀粉酶的底物是淀粉。淀粉在该酶的催化作用下会随着时间的延长而出现不同程度的水解，从而得到各种糊精乃至麦芽糖、少量葡萄糖等水解产物。而碘液能指示淀粉的水解程度淀粉遇碘呈紫色、暗褐色与红色，而麦芽糖与葡萄糖遇碘则不呈颜色反应，如图所示：淀 粉 淀粉酶 糊 精 淀粉酶 麦芽糖+少量葡萄糖加碘后： （蓝色） （紫红色、暗褐色或红色等） （棕黄色、碘本身颜色）试剂及器材：1.试剂（1）0.5%（w/v）淀粉溶液：称取0.5g可溶性淀粉，加少量预冷的蒸馏水，在研钵中调成糊状，再徐徐倒入约90mL沸水，同时不断搅拌，最后加水定容为100mL即成。要求新鲜配制。（2）稀碘溶液：称取1.2g I2、2g KI，加少量蒸馏水溶解后，再加蒸馏水至200mL。保存于棕色瓶中，用前5倍稀释。（3）不同pH溶液：A液-0.2mol/L Na2HPO4溶液：称取35.62g Na2HPO4.12H2O，将之溶于蒸馏水后定容至1000Ml。B液-0.1mol/L柠檬酸溶液：称取19.212g无水柠檬酸，将之溶于蒸馏水后定容至1000Ml。 pH5.0缓冲液-取A液10.3ml、B液9.7mL混合而成。 pH6.8缓冲液-取A液14.55ml、B液5.45mL混合而成。 PH8.0缓冲液-取A液19.45ml、B液0.55mL混合而成。配好缓冲液后应用酸度计验证。（4）0.5%（w/v）蔗糖溶液：称取蔗糖0.5g，将之溶于蒸馏水后定容至100mL。（5）斑氏试剂：A液-称取无水CuSO417.4g，将之溶于100mL预热的蒸馏水中，冷却后用蒸馏水稀释至150ml。B液-称取柠檬酸钠173g、Na2CO3100g，再加蒸馏水600mL，加热溶解后冷却，用蒸馏水稀释至850mL。将A液与B液混合即得斑氏试剂。（6）1%（w/v）NaCl溶液：称取NaCl 1g，将之溶解后用蒸馏水稀释至100mL。（7）1%（w/v）CuSO4溶液：称取无水CuSO41g，将之溶解后用蒸馏水稀释至100Ml。2.器材（1）白瓷板（或比色板）（2）恒温水浴锅（3）电炉操作1、唾液淀粉酶应用液的制备（1） 每人取一个干净的饮水杯，装上蒸馏水。（2） 先用蒸馏水漱口，将口腔的食物残渣清除干净。（3） 口含约20mL蒸馏水，做咀嚼动作1-2分钟，以分泌较多的唾液。然后将口腔中的唾液吐入一个干净的小烧杯中。（4） 取一块干净的白瓷板，按表1-1进行实验。表1-1穴号试剂（滴）1234567蒸馏水222222弃去唾液2222220.5%淀粉222222碘液（滴）111111结果（颜色）以呈棕红色者浓度为准，稀释原唾液作应用液。2、温度对酶活性的影响（1） 取3支试管，按表1-2进行实验。表1-2试管编号1230.5%淀粉（mL）555PH6.8缓冲液（mL）0.50.50.5稀释唾液（mL）0.50.50.5不同温度（）置冰水浴中置37水浴中置沸水浴中将各管中的试剂加好后混匀，然后及时在上述温度下分别进行处理。（1） 在干净的比色板上，于各孔穴中分别滴加2滴碘液。（2） 每隔1分钟从第2支试管取反应液1滴，与比色板孔穴中的碘液混合，观察颜色的变化。（3） 待第2支试管中的反应液与比色板孔穴中的碘液混合后颜色不再变化时，取出试管，并将在沸水浴中处理的试管用冷水冷却，然后向各试管中滴加碘液1-3滴。摇匀后观察并记录各管颜色，比较各管中淀粉水解的程度，说明温度对酶活性的影响。3、pH对酶活性的影响（1） 取3支试管，按表1-3编号后进行实验。表1-3管号0.5%淀粉（mL）123222不同浓度pH缓冲液（mL）PH5.02-PH6.8-2-PH8.0-2稀释唾液（滴）101010摇匀后，将各管置于37水浴中处理。（2） 每隔1分钟从pH6.8的试管中取出1滴反应液滴于白瓷板上，随后滴加稀碘液1滴，观察其颜色变化。（3） 待颜色呈棕色时，向各管中加稀碘液1-3滴。观察各管颜色，比较各管中淀粉水解的程度，解释pH对酶活性的影响。4、酶反应的特异性（1） 取2支试管，按表1-4编号后进行实验。表1-4试管号120.5%淀粉（mL）2-0.5%蔗糖（mL）-2稀释唾液（mL）11（2） 摇匀后，将各管置于37水浴中处理10min。（3） 取出试管，分别加入斑氏试剂2mL，混匀。（4） 将各管置于沸水浴煮沸2-5min。观察并解释结果。5、激活剂与抑制剂对酶活性的影响（1）取3支试管，按下表编号后进行实验。试管号1230.5%淀粉1.51.51.5PH6.8缓冲液（ml）0.250.250.251%NaCl溶液（ml）0.51%CuSO40.5蒸馏水（ml）0.5稀释唾液0.50.50.5摇匀后，将各管置于37水浴中处理。（2）每隔1分钟从第1支试管中取出1滴反应液滴于白瓷板上，随后滴加稀碘液1滴，观察其颜色变化。（3）待颜色呈棕色时，取出3支试管，向各管中加稀碘液1-3滴。观察各管颜色，并解释之。实验二 血清总蛋白的含量测定原理本法所用试剂因能与双缩脲(H2NOCNH-CONH2)产生紫红色反应而被称为双缩脲试剂。实际上凡分子内含有两个氨基甲酰基(-CONH2)的化合物，不论是直接相连或是通过一个氮或碳原于间接连接，均能与双缩脲试剂发生反应。蛋白质分子内含有许多肽键(CONH)，因此可用双缩脲法作比色测定。不含CONH2，但含有-CSNH2、-C(NH)NH2或CH2NH2等基团而具类似结构的化合物对双缩脲试验亦呈阳性，所以本反应并非为蛋白质所特有。但在体液中，除蛋白质外实际上不存在可与双缩脲试剂显色的物质。各种血浆蛋白质，包括病理的和正常的，呈色的程度基本相同，因此在血浆蛋白的比色测定中，双缩脲反应是较为理想的方法。紫红色铜双缩脲复合物分子结构为：试剂和器材一、试剂 双缩脲试剂：称取硫酸铜(CuSO45H2O，AR或CP)150g、酒石酸钾钠(NaKC4H4064H2O， AR或CP)6.0g，分别用蒸馏水约250ml溶解后，全部转移于1L容量瓶中，混和，再加入10氢氧化钠溶液300ml，随加随摇匀。最后用蒸馏水稀释至1L。保存于塑料试剂瓶中或内壁涂一层纯净石蜡的普通试剂瓶中。如无红色或黑色沉淀出现，此试剂可长期使用。二、标准和待测蛋白质溶液1. 标准蛋白溶液10mg/ml牛血清白蛋白溶液或相同浓度的酪蛋白溶液（用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制）。作为标准用的蛋白质要预先用微量克氏定氮法测定蛋白质含量，根据其纯度称量，配制成标准溶液。2. 待测蛋白质溶液血清（稀释10倍）。测试其他蛋白质样品应稀释适当倍数，使其浓度在标准曲线测试范围内。三、器材试管，试管架，恒温水浴，721型分光光度计。操作方法1、取7只试管，按下表加入试剂：管号0123456酪蛋白标准液/ml0.20.40.60.81.0-蛋白浓度/(mg/ml)2.04.06.08.010.0-未知样品液（ml）-1.0蒸馏水/ml1.00.80.60.40.20.0-双缩脲试剂/ml4.04.04.04.04.04.04.02、摇匀，室温（1525）下，放置30min。3、以0管调零，在540nm波长处将各管溶液进行比色，读取各管光密度值（重复三次）。4、取测定的A540值的平均值，即A540为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。5、6号管从标准曲线上查出待测样品蛋白质含量，即为样品液的蛋白质含量（mg/ml）。注意事项（1）本实验方法测定范围110mg蛋白质。（2）须于显色后30min内比色测定。30min后，可有雾状沉淀发生。各管由显色到比色的时间应尽可能一致。（3）有大量脂肪性物质同时存在时，会产生浑浊的反应混合物，这时可用乙醇或石油醚使溶液澄清后离心，取上清液再测定。实验三 氨基酸的纸上层析与氨基酸移换作用原理层析分离技术是一种物理的分离法。利用待分析混合物中各组分的物理化学性质（如吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、分配系数等）的差别，使各组分以不同程度分布在两相中。所谓“相”是指一个系统中的某一均匀部分。一般来说，其中一相是固定的，称为固定相，另一相是流动的液体或气体，称为流动相，两相互相接触。待分析混合物的各组分以不同的速度移动，从而分离。纸上层析是以滤纸作为支持物，滤纸总保持一些水分（约2030），使水称为层析中的“固定相”。另一种和固定相不能混合或部分混合的溶剂则为“移动相”。把欲分离的物质加在纸的一端，并使流动相借重力及滤纸的毛细现象移动，此时，待分离溶质因分配系数不同而逐渐分布于滤纸的不同部位。层析结束时，用显色剂使被分离的物质显出颜色，成为一个个色斑。分配在固定相中趋势较大的成分在纸上随流动相移行的速度就小，色斑距原点的位置就较近。反之，分配在固定相内趋势较小的成分移行就远，色斑位置离原点也远。溶质在纸上的移动速率可用比移（Rf）表示之。 各种氨基酸在一定的溶剂、一定的纸质及其他有关条件（湿度、PH等）固定情况下，各有其特有的，不变的Rf值。氨基酸纸上层析常用的溶剂系统是：水和酚，水和乙酸-丁醇，或水和二甲基吡啶等。决定各氨基酸在两相溶剂系统中的分配系数的是氨基酸的化学结构。例如，水是极性溶剂，而酚、丁醇或二甲基吡啶则是极性较低的溶剂。因此，极性基团较多的氨基酸（如二羧基氨基酸）或极性基在整个分子中占比例较大的氨基酸和水的亲和力大，移动较慢，非极性基（如烃基、芳香基）所占比例较大的则和酚、丁醇等的亲和力大，移动也较快。同一氨基酸在不同的溶剂系统中Rf值也不同，因此为了彻底分离某一混合氨基酸溶液，常用更换溶剂系统或双向层析的方法。氨基酸一般为无色物质，所以通常在层析结束后，用茚三酮使之显色。将色斑图谱及Rf值或标准的层析图谱及Rf值比较，可确定所分离氨基酸的种类。如欲做定量测定，可把色斑剪下，溶于适当的溶液中于标准比色，也可直接在纸上用光密度计读数。本实验结合转氨基作用来观察氨基酸的纸上层析。转氨基作用是氨基酸代谢的一个重要反应。在转氨酶作用下，将氨基酸的氨基转移到-酮酸上。每种转氨基反应均由专一的转氨酶催化。转氨酶广泛分布于机体各器官、组织，例如肝细胞中存在的谷丙转氨酶，能催化-酮戊二酸与丙氨酸之间的转氨基作用。试剂和器材1、试剂 0.01mol/L pH7.4磷酸缓冲液：0.2mol/L Na2HPO4溶液81ml与0.2mol/L NaH2PO4溶液19ml混匀，蒸馏水稀释20倍。 0.1mol/L丙氨酸溶液：称取丙氨酸0.819克先溶于少量0.01mol/L pH7.4磷酸缓冲液中，以1mol/L NaOH仔细调节pH至7.4后，用磷酸缓冲液加至100ml。 0.1mol/L-酮戊二酸溶液：称取-酮戊二酸1.461克先溶于少量0.01mol/L pH7.4 0.1mol/L谷氨酸溶液：称取谷氨酸0.735克先溶于少量0.01mol/L pH7.4磷酸缓冲液中，以1mol/L NaOH仔细调节pH至7.4后，用磷酸缓冲液加至50ml。 层析溶剂：正丁醇:水:冰乙酸=4:3:1 0.1%的茚三酮的无水丙酮溶液。2、器材 瓷研钵 小试管二支 刻度吸管 层析滤纸 毛细吸管 培养皿，小表面皿 电吹风 剪刀、镊子 圆规、直尺、铅笔（学生自备）操作1、肝匀浆的制备：称取新鲜的兔子肝脏1克，在研钵中用剪刀尽量剪碎，加入1ml预冷的0.01mol/L pH7.4磷酸缓冲液，将肝组织研磨制成匀浆，再加入8ml 上述磷酸缓冲液，混匀。2、保温：取干燥试管两支，分别标明测定管与对照管，按下表操作：试剂测定管对照管肝匀浆（ml）0.1mol/L丙氨酸（ml）0.1mol/L-酮戊二酸（ml）0.01mol/L pH7.4磷酸缓冲液（ml）237预热2分钟0.50.51.52沸水浴5分钟0.50.51.5两管混匀后，置37水浴保温3040分钟。保温完毕，立即将测定管在火焰上加热煮沸2分钟终止反应。冷却后，分别取两管的上层清液于白瓷比色盘小池中。3、层析：取直径12cm的圆形层析滤纸一张，用圆规作半径1cm的同心圆，通过圆心作两条垂线，用铅笔在交点处轻轻作一点样记号（见图）。在1，3两点处分别点测定管和对照管上清液各56滴，在2，4两点处分别点0.1mol/L丙氨酸和0.1mol/L谷氨酸各1滴。注意点样斑点不可太大（一般直径为0.20.5cm）。吸取层析剂，加入直径35的表面皿中，再将表面皿置于一直径为10cm的培养皿正中。在点样后的层析滤纸圆心处打一小孔，直径约为0.3cm。另取同样滤纸一小片（约12 cm2），下一半用剪刀剪成须状，卷成圆筒如灯芯，插入小孔中固定（勿突出滤纸平面）。将滤纸平放在培养皿中，灯芯浸入层析溶剂中，反盖上另一培养皿。这时可见层析溶剂沿灯芯上升到滤纸上，再向四周扩散。层析约30分钟后，将滤纸取出，用铅笔在溶剂前缘处轻轻作一记号，用电吹风将滤纸吹干。4、显色：将上述滤纸用喷雾器喷上0.1%的茚三酮溶液，再用电吹风吹干，此时可见紫红色同心圆弧色斑出现。计算各色斑的Rf值，将测定液和对照液中各色斑的Rf值与标准品的Rf值进行比较分析。实验四 血糖的测定原理葡萄糖在热醋酸溶液中与邻甲苯胺缩合生成兰绿色西夫氏碱（Schiff base），其颜色的深浅与葡萄糖含量成正比。与同样处理的葡萄糖标准液比色（或根据其光密度查标准曲线）可求得待检血样品中葡萄糖的含量。试剂和器材1、试剂 邻甲苯胺试剂：称取硫脲（AR）2.5g，溶于冰醋酸（AR）750ml中。将此溶液转移入1L容量瓶内，加邻甲苯胺150ml，2.4%硼酸溶液100ml，再加冰醋酸至1L刻度，置棕色瓶中，至少可应用两个月。 葡萄糖贮存标准液（50mmol/L）：将少量无水葡萄糖（AR或CP）置于硫酸干燥器内一夜。精确称取此葡萄糖0.900g，以饱和苯甲酸溶液溶解并转移入100ml容量瓶内，再以饱和苯甲酸溶液稀释至100ml刻度。置冰箱中可长期保存。 葡萄糖应用标准液(1.25mmol/L)：准确吸取葡萄糖贮存标准液2.5ml，置100ml容量瓶内，以饱和苯甲酸溶液稀释100ml刻度。 饱和苯甲酸溶液：称取苯甲酸2.5g，加入蒸馏水1L中，煮沸使溶解。冷后盛于试剂瓶中。 2、器材 试管及试管架 吸量管 水浴锅 721型分光光度计 方格坐标纸标准曲线和回收试验1、标准曲线：配制一系列已知不同浓度的测定物标准溶液，按样品测定同样的方法处理显色，分别测得它们的光密度，再以光密度为纵坐标，浓度为横坐标，在方格坐标纸上作图，所得的曲线即标准曲线。制作标准曲线的意义在于：（1）作为校正曲线，从浓度光密度的直线特性，可判断某方法中化学反应产生的颜色物质是否符合或遵守朗伯特比尔定律。（2）可判断在测定操作过程中，操作、仪器等误差的大小，从而确定方法的可靠性。（3）作为工作曲线，在大量进行样品中测定物含量分析时，通常用作计算的基础，即从曲线上可直接找到测定液的光密度所相当的浓度。2、回收试验：比色法中测定液除含待测成分外，还含有许多非测定成分而与标准液不一致，它们是否影响显色反应引起误差，常借回收试验来检查。在待测样品中加入已知浓度的标准物质，在按样品测定的条件和方法进行测定，然后计算测出标准物质量占加入标准物质量的百分率，这种试验即回收试验，算出的百分率即回收率。回收率愈接近100%愈好，一般认为达到1005%即较为理想。回收率的好坏在一定程度上说明测定结果的准确度，也可反映干扰物质存在与否，影响程度如何，以及这种影响与浓度有无关系；此外，还可以检查操作误差和仪器误差。操作取洁净干燥试管8支，编号，按下表操作：试 剂（ml）空白管（1）标准管（2） （3） （4） （5） （6）测定管 （7） 回收管（8）血浆（或血清） 0.050.05葡萄糖标准液(1.25mmol/L)0.1 0.2 0.3 0.4 0.50.2蒸馏水0.60.5 0.4 0.3 0.2 0.10.550.35邻甲苯胺试剂5.05.0 5.0 5.0 5.0 5.05.05.0混匀后置沸水浴中加热15分钟。取出，用流水或冷水浴冷却。用630nm波长进行比色，以空白管校正光密度到零点，读取各管光密度读数。计算及作图1、选择与测定管接近的标准管的光密度值，列出计算公式，计算出血浆（或血清）中葡萄糖的含量（mmol/L）。2、将以上各标准管的光密度值为纵坐标，相应的各标准管的葡萄糖的浓度（依次相当于2.5mmol/L， 5.0mmol/L， 7.5mmol/L， 10.0 mmol/L， 12.5mmol/L）为横坐标，在座标纸上作图，绘制成标准曲线。3、从标准曲线中查出血浆或血清的葡萄糖含量，并与计算结果作比较。4、回收率的计算： 选择与回收管接近的标准管的光密度值，列出计算公式，计算出回收管的葡萄糖含量（mmol/L）。 计算回收量：回收量（mmol/L）=回收管葡萄糖含量（mmol/L）测定管葡萄糖含量（mmol/L） 计算回收率：注：加入量在本次实验中为5.0mmol/L。正常值3.89mmol/L 5.89mmol/L临床意义血糖超过正常最高值，称为高血糖症，常由糖尿病、甲状腺机能亢进、脑垂体前叶机能亢进、肾上腺皮质和髓质机能亢进等疾病引起。血糖低于正常最低值，称为低血糖症，多见于胰岛素分泌过多、肾上腺机能减退、脑垂体机能减退、甲状腺机能减退等。实验五 组织DNA与RNA的分离和提纯一、原理脱氧核糖核蛋白(DNP)在0.14 mol/L NaCl中溶解度很低，而核糖核蛋白(RNP)却较易溶解，故用0.14 mol/L NaCl洗涤组织匀浆，可得到DNP，再用氯仿-异戊醇除蛋白即可得到DNA。RNA的分离提纯目前多用苯酚法。组织匀浆在酚与十二烷基硫酸钠存在下，RNA与蛋白质分离。酚使蛋白质变性凝固，RNA溶解在水相中，用乙醇使RNA从水相中沉淀而达到分离。二、操作(一)DNA的提纯1.取小鼠剪断颈动脉，放血处死。立即开腹，取其脾脏及两肾脏(约0.3 g)，浸于预冷至0的0.14 mol/L NaCl-0.01 mol/L EDTA中，洗去其血液，剥去周围的脂肪及结缔组织，用滤纸吸干水分。2.将组织剪碎，转入玻璃匀浆器中，加入0.14 mol/L NaCl-0.01 mol/L EDTA液7 ml，旋转上下匀浆，至绝大部分细胞破碎为止。3.离心，2 500 r/min，15 min。吸弃上层液体，向沉淀中再加0.14 mol/L NaCl-0.01 mol/LEDTA液混匀，离心洗涤之(如欲获取掺杂RNA较少的纯DNA时，此步离心洗涤应重复多次)。4.经洗涤后的沉淀，加入3 ml 0.14 mol/L NaCl-0.01 mol/L EDTA，在搅拌下缓缓滴入250g/L SDS 0.4 ml，转入匀浆器内匀浆，使沉淀悬浮均匀，再加入2 mol/L NaCl 4 ml，这时由于大分子脱氧核糖核蛋白的溶出，溶液粘度骤然升高，再匀浆一次，使之均匀。5.转入三角烧瓶，加等容积的氯仿-异戊醇8 ml，剧烈振摇10 min。将此混合液离心3 000r/min，10 min。上层为水液，下层为氯仿，变性蛋白质在氯仿与水层的界面上。吸出上层水液(如欲获取掺杂蛋白质较少的DNA，此氯仿振摇、离心的操作可重复多次，直至界面完全见不到变性蛋白层为止)。氯仿层液体不要废弃，可倒入收集瓶内，以便蒸馏回收再用。6.上层水液边摇边加入等积95%乙醇，即可见有长纤维线状DNA析出，用玻棒搅之，DNA纤维即粘缠在玻璃棒上，在玻璃壁上尽量将水分挤干。7.缠在玻璃棒上的DNA纤维溶于1 ml 0.1 mol/LNaCl溶液中留作定量、电泳用。(二)RNA的提取1.饥饿一日的小白鼠，放血处死。立即剖腹，取出其肝脏，浸于预冷至0的0.05 mol/L醋酸钠缓冲液(pH5.0)中，剥去肝门处的结缔组织，洗去血液，用滤纸将水分吸干，称取0.3g。2.取0.3 g肝脏，加入0.05mol/L醋酸缓冲液(pH5.0)3 ml、250 g/L SDS 0.5 ml，移入匀浆管，匀浆后，再加入等体积80%酚，再匀浆一次。3.移入三角烧瓶内，置65水浴中继续振摇58 min。取出流水冷却。4.离心，3 000 r/min，1015 min，上层为稍混浊含有RNA的水相，中层为变性蛋白质，下层为酚液，管底残渣含有DNA。吸出上层水液(若要提高RNA的收获量，可向中、下层液中再加1/2体积的醋酸缓冲液，同样在65水浴中振摇提取一次，离心后所收得上层水液，可与上述水液合并)。5.用量筒测水液的量，加入1/10体积的2 mol/L醋酸钠，混匀。再加入2.5倍体积预冷的95%乙醇，混匀，冷处放置至絮状沉淀充分形成。6.离心，3 000 r/min，10 min。倾出上清(不要废弃，可倒入收集瓶中，作蒸馏回收乙醇用)。离心管倒置滤纸片上，尽量使液体流干。7.沉淀用蒸馏水1ml溶解(慢慢向沉淀中加蒸馏水，至沉淀完全溶解即可)，再作定量及电泳用。三、注意事项1.在DNA和RNA的提取操作中，有条件应在04进行。2.手指上有RNA酶，在提取RNA的过程中应尽量避免RNA酶污染。3.酚有腐蚀性，操作时应小心，若沾洒在皮肤上立即用水或用70%酒精棉球擦洗。4.提取DNA时，须待纤维状DNA大分子充分析出后，再用玻棒轻轻将其缠捞出来四、试剂和器材1. 0.14 mol/L NaCl-0.01 mol/L EDTA: 称NaCl 8.18 g，乙二胺四醋酸二钠盐3.72 g，加蒸馏水溶解，调pH至7，稀释至1 000 ml，贮放冰箱中。2. 250 g/L SDS: 称取十二烷基硫酸钠25 g，溶于50%乙醇中至100 ml，室温存放。3. 2 mol/L NaCl: 称11.7 g NaCl，用蒸馏水配成100 ml溶液。4. 氯仿-异戊醇: 氯仿24份与异戊醇1份混合。5. 80%酚: 取苯酚80份，加蒸馏水20份，混匀后装棕色瓶中。6. 0.05 mol/L醋酸缓冲液(pH5.0):0.5 mol/L醋酸钠35 ml，0.2 mol/L醋酸15 ml，加蒸馏水稀释至1 000 ml，混匀后测pH应为5.0。7. 2 mol/L醋酸钠: 取无水醋酸钠16.4 g，用蒸馏水溶解后配成100 ml。8. 95%乙醇9. 器材 超低温冰箱，生物安全柜，电热恒温水槽，台式高速冷冻离心机实验六 紫外分光光度法定量检测DNA与RNA 一、原理具有共轭双键的有机分子，对紫外光有强烈的吸收，核酸分子中的碱基就有共轭双键，因此也强烈吸收紫外光。核酸的最大吸收波长为260 nm，吸收低谷在230 nm。核酸的这一物理特性为测定核酸溶液的浓度提供了基础。在波长为260 nm的光程为，一个吸收单位(1A 260)相当于双链DNA浓度为50g/ml，单链DNA为33g/ml，单链RNA为40g/ml，寡核苷酸为2030g/ml。所以测出核酸溶液的A260值后，即可据此计算出它的浓度。二、试剂和器材超纯水紫外可见光分光光度计三、操作待测核酸以水为溶剂并作适当稀释，使用1 cm光程的石英比色杯，以水调好仪器的零点，然后测定并记录样品液的A 260值。根据上述核酸的吸收系数，计算出样品液中核酸的浓度。计算(RNA定量举例)RNA样品体积:100l稀释:10lRNA样品+490l蒸馏水(50倍稀释)稀释后样品的A 260值(1 cm光程)=0.55 RNA浓度=40g/mlA 260稀释倍数=40g/ml0.5550=1100g/ml RNA总量=浓度样品体积(ml)=1=100g/ml0.1 ml=110g RNA。四、注意事项1.待测核酸样品，必须是纯净(即无显著的蛋白质、酚、琼脂糖或其他核酸、核苷酸等污染物)的制品。若样品中有污染物，则无法用紫外分光光度法测准其浓度。要使用与样品相同的溶剂调仪器的零点，样品读数应在0.11.0之间，以保证读数的可靠性。2.前述吸收系数是以水为溶剂的。以缓冲液为溶剂的吸收系数可能与以水为溶剂时略有不同。3.测定RNA浓度时，要确保比色杯无RNase污染。为此可用0.1mol/LNaOH-1mmol/LEDTA液清洗比色杯，然后以无RNase的蒸馏水淋洗。4.为判断核酸的纯度，可在低盐缓冲液中，测定A260/A280的比值。在缓冲溶液中，可获得比在水中更为正确、可靠的测定值，这是因为A260/A280比值受pH的影响很大，pH较低时引起A260/A280值的降低，并且降低了对蛋白污染的灵敏度。纯DNA在pH8.5的10mmol/LTrisCl中，其A260/A280比值为1.82.0。纯RNA在pH7.510mmol/LTrisCl中，其A260/A280比值为1.92.1。5.如在280nm有强吸收则A260/A280比值降低，表明有污染物(如蛋白质)的存在;270275nm的强吸收，提示有污染的酚存在。实验七 DNA的琼脂糖凝胶电泳原理琼脂糖凝胶电泳以琼脂（糖)为电泳支持物。天然琼脂（agar）是一种多聚糖。主要由琼腊糖（agarose，约占80）及琼脂胶（agaropectin）组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。DNA的琼脂糖凝胶电泳多采用平板型水平电泳装置。其特点是制胶、电泳、染色等操作简单方便、省时、样品用量少、分离效果好，电泳时，常用溴酚蓝（在1%胶中迁移率与 500 bp的DNA相当）和（或）二甲苯青临（在1胶中迁移率相当于200bp的DNA）为指示剂。通常用EB染色，可以在凝胶中加人终浓度为0.5g/mL的EB，或电泳结束后将凝胶浸入0.5g/mL EB的水溶液中染色10min，电泳结果可在紫外灯照射下观察和拍照。试剂和器材1.试剂（1）5TBE：54g Tris、27.5g硼酸、4.65gEDTANa2H2O溶于水，定容至 100 mL，pH8.3，用时稀释10倍。（2）溴酚蓝指示剂：50g溴酚蓝溶于100 mL 50甘油中。（3）EB: EB 10mg加水2mL成5mg/mL水溶液，EB为强致癌物，配制时要戴一次性手套。（4）标准相对分子质量DNA；（5）样品DNA：25mg DNA溶于100mL 0.5TBE。2.器材 水平电泳槽，多功能电泳仪，微量加样器，层析冷柜，凝胶成像系统含工作站操作（l）洗净有机玻璃制胶内槽，两端用胶带封严，置水平位置备用。（2）根据制胶槽大小，称取一定量的琼脂糖。置三角瓶中，按1的浓度加入0.5TBE。三角瓶口上倒扣1个小烧杯，置微波炉加热使琼脂糖溶解，冷却至约60时，加入EB液，使EB终浓度为0.5g/mL（戴手套！），将之倒入制胶模糟，厚度一般为35mm，放好梳子，排除梳齿间或梳齿下的气泡（一般轻轻抖动梳子即可）。（3）室温下置3040min使琼脂糖完全凝固，小心取出梳子，撤除胶槽两端胶带，将胶槽置于电泳槽中，加入0.5TBE，使液面高于胶面1mm。注意，电泳槽中缓冲液和配制凝胶的缓冲液应完全一致，最好为同一次配制的溶液。（4）样品液和标准相对分子质量DMA各40g，加入10L溴酚蓝指示剂，混匀后，用微量加样器（移液枪或注射器）将样品加入样品孔中，枪头不可碰孔壁。0.5cm0.5cm0.15 cm的标准孔最大上样容积为37.5L，单一分子DNA每孔可加DNA100500ng，DNA的混合物每孔可加2030ug，测相对分子质量时，两侧均应加标准DNA，盐分过高的样品需脱盐。（5）接通电泳槽和电泳仪，注意DNA向正极移动，加样端要接负极。电压选择为 15 Vcm，溴酚蓝移动到距胶板正极端约1cm时停止电泳。（6）在254nm紫外光灯下观察电泳结果，并可将凝胶置于紫外透射仪的玻板上，打开紫外灯，用配有近摄接圈和红色滤光片的照相机，采用全色胶卷，5060cm距离，5.6光圈，根据条带深浅，曝光 1020 s。有条件时，可用凝胶自动成像仪处理实验结果。注意：EB为强致癌剂，使用时一定要戴手套。加在凝胶中的EB电泳时向负极移动，使DNA迁移率下降约15，对带型有一定的影响。故可在凝胶中不加EB。电泳结束后，将凝胶置于0.5ug/mL的EB中染色30min。EB废液要经过处理才能丢弃，较容易的方法是：用水将EB浓度稀释至0.5gmL以下，加入1倍体积0.5mol/L KMnO4混匀，再加1体积2.5mol/L HCl混匀，室温放置数小时，再加入1倍容积的2.5mol/L NaOH混匀即可废弃。实验八 血浆IgG的分离制备一、血液样品的处理血液是生化分析中十分重要的样品之一。血液中各成分的生化分析结果是了解机体代谢变化的重要指标。为此，必需掌握正确处理血液样品的方法。（一）血液的采取 动物采血法 采集血液是进行常规检查或某些生物化学分析的需要，采血方法的选择，主要决定于实验的目的、所需血量及动物种类。凡用血量较少的检验可刺破组织取毛细血管的血。当需血量较多时可作静脉采血。静脉采血时，若需反复多次，应自远心端开始，以免发生栓塞而影响整条静脉。常见动物的全身总血量和一次允许采血量见表3。表3 动物血容量和允许采血量单位：mL/kg 动物小鼠大鼠家兔鸡猫狗猴猪山羊绵羊乳牛马V74.558.069.495.584.692.675.069.471.058.057.472.0v7.75.57.79.97.79.96.66.66.66.67.78.8注：V全血量平均值，v一次最大安全采血量兔的采血 方法有多种，需血量较少时可从耳缘静脉采血，需血量在几毫升可从耳中央动脉采血，更多时用颈静脉采血或心脏采血。耳缘静脉采血方法是：将兔固定，拔（或剪）去耳缘静脉局部的被毛，消毒，用手指轻弹兔耳，使静脉扩张，用针头刺入耳缘静脉末端，血液即流出。耳缘静脉采血为兔最常用的采血方法，可多次重复使用。手术法分离颈静脉，可用注射器直接采血，或安置导管，反复采血。耳中央动脉采血：在兔耳中央有一条较粗的、颜色较鲜红的中央动脉。用左手固定兔耳，右手持注射器，在中央动脉的末端，沿着与动脉平行的向心方向刺入动脉，即可见血液进入针管。由于兔耳中央动脉容易痉挛，故抽血前必须让兔耳充分充血，采血时动作要迅速。采血所用针头不要太细，一般用6号针头，针刺部位从中央动脉末端开始，不要在近耳根部采血。心脏采血：将兔仰卧保定，穿刺部位在第三肋间胸骨左缘3cm处，选心跳最明显的部位把注射针刺入心脏，血液即流入针管。穿刺部位也可以选在左侧面水平方向进针，左手在胸骨两侧向下按压，使心脏位置受限，右手持注射器在兔胸腔前后壁中点的第三肋间刺入。心脏采血时所用的针头应细长些，以免发生采血后穿刺孔出血。也可从胸骨剑突尾端和腹部平面成30角向头端刺入。由于血液中许多化学成分在血浆（清）和血细胞内的分布不同，有的差别很大，因而在血液分析中常需分别测定血浆（清）和血细胞中的成分含量。为此，在采血时要避免溶血，因为溶血造成成分混杂，引起测定误差。为避免溶血，在采血时所用的注射器、针头及盛容器要干燥清洁；采出的血液要沿管壁慢慢注入盛容器内。若用注射器取血时，采血后应先取下针头，再慢慢注入容器内。推动注射器时速度切不可太快，以免起气泡造成溶血。盛血的容器不能用力摇动。（二）血清的制备1.血清的制备：血清是全血不加抗凝剂自然凝固后析出淡黄清亮液体。其所含成分接近于组织间液，代表着机体内环境的物理化学性状，比全血更能反映机体的状态，所以血清是常用的血液样品。操作 将刚采集的血液直接注入试管，将试管倾斜放置，使血液形成一斜面。夏季于室温下放置，待血液凝固后，即有血清析出；冬季，因室温较低，室温下放置时血液凝固缓慢，不易析出血清，故需将血液置于37水浴或温箱中促进血清析出。血清析出后，用吸管吸取上层血清置于另一试管，若不清亮或带有血细胞，应离心，将上清移于另一试管中，加盖冷藏备用。二、免疫球蛋白的提取原理 IgG是免疫球蛋白的主要成分之一，分子量约为15万16万，沉降系数约为7s。IgG是动物和人体血浆的重要成分之一。血浆蛋白质的成分多达70余种，要从血浆中分离出IgG，首先要进行尽可能除去其他蛋白质成分的粗分离程序，使IgG在样品中比例大为增高，然后再纯化而获得IgG。盐析法是粗分离蛋白质的重要方法之一。许多蛋白质在纯水或低盐溶液中溶解度较低，若稍加一些无机盐则溶解度增加，这种现象称为“盐溶”。而当盐浓度继续增加到某一浓度时，蛋白质又变得不溶而自动析出，这种现象称为“盐析”。由于各种蛋白质分子所带的电荷数目不同，它们在蛋白质表面上分布情况也不一样，因此将不同蛋白质“盐析”出来所需的盐浓度也各异，盐析所需的最小盐量称为盐析浓度。盐析法就是通过控制盐的浓度，使蛋白质混合溶液中的各个成分分步“盐析”出来，达到分离目的蛋白质。盐析法所使用的盐有硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠和硫酸铵等中性盐，其中运用最广的是硫酸铵。因为硫酸铵有许多其他盐所不具备的优点，如在水中化学性质稳定；溶解度大，25时能达到4.1mol/L的浓度；溶解度的温度系数变化小，在030范围内溶解度变化不大，如，25时饱和溶解度为4.12mol/L，即767g/L，0时饱和溶解度为3.9 mol/L，即676 g/L。而且硫酸铵廉价易得，分段效果比其他盐好，性质温和，即使浓度很高时也不会影响蛋白质的生物学活性。因此，现在所指的盐析法实际上多为硫酸铵盐析法。用硫酸铵分级盐析蛋白质时，盐析出某种蛋白质成分所需的硫酸铵浓度一般以饱和度来表示。实际工作中将饱和硫酸铵溶液的饱和度定为100或1。盐析某种蛋白质成分所需的硫酸铵数量折算成100或1饱和度的百分之几，即称为该蛋白盐析的饱和度。饱和度可以根据情况用下述两种方法计算。饱和硫酸铵溶液法 在蛋白质溶液的总体积不大，要求达到的饱和度在50%以下时，可选用此方法。在已知盐析出某种蛋白质成分所要达到的饱和度时，可按下列公式计算出应加入饱和硫酸铵溶液的量：V=V0（C2-C1）/(100-C2) 或V=V0（C2-C1）/(1-C2)式中 V0蛋白质溶液的原始体积； C2所要达到的硫酸铵饱和度； C1原来溶液的硫酸铵饱和度； V应加入饱和硫酸铵溶液的体积。将计算所得体积的饱和硫酸铵溶液加入到混合蛋白质溶液中，即可达到盐析的目的。严格讲，混合两种不同溶液时，混合后的总体积并不等于前两种体积之和，而上式中按相等于计算的，所以会产生误差。但试验证明所造成的误差一般小于20，故可忽略不计。试剂与器材（1） 饱和硫酸铵溶液：取化学纯（NH4）2SO4800g,加蒸馏水1000ml，不断搅拌下加热至50-60，并保持数分钟，趁热过滤，滤液在室温中过夜，又结晶析出，即达到100饱和度，试验时用浓NH4OH调至pH7.0。（2） 0.01mol/L，pH7.0，磷酸盐缓冲溶液：取0.2 mol/L Na2HPO4溶液61.0ml与0.2 mol/L NaH2PO4溶液39.0ml，混合，用酸度计检查pH应为7.0。取该混合液50ml，加入7.5gNaCl，用蒸馏水稀释至1000ml。（3） 0.0175 mol/L，pH6.7，磷酸盐缓冲溶液：取0.2 mol/L Na2HPO4溶液43.5ml与0.2 mol/L NaH2PO4溶液56.5ml相混合，用酸度计检查pH应为6.7。取该混合液87.5ml，用蒸馏水稀释至1000ml。操作（1） 在1支离心管中加入5ml血浆和5ml0.01 mol/L，pH7.0磷酸盐缓冲液，混习。用皮头滴管吸取饱和硫酸铵溶液，边滴加边搅拌于血浆溶液中，使溶液的最终饱和度为20（应加入饱和硫酸铵溶液多少毫升？），用滴管边加边搅拌，是为防止饱和硫酸铵溶液1次性加入和搅拌不均匀造成局部过饱和的现象，使盐析达不到预期的饱和度，得不到目的的蛋白质。搅拌时不要过急以免产生过多泡沫，致使蛋白质变性。加完后应在4放置15min，使之充分盐析（蛋白质样品量大时，应放置过夜）。然后以3000r/min离心10min。弃去沉淀（沉淀为纤维蛋白质），在上清液中为清蛋白、球蛋白。（2