核酸的提取与纯化

核酸的提取与纯化一 DNA的提取与纯化（一） 实验目的与主要原理DNA存在于细胞核中。通过裂解组织与细胞，使细胞膜破碎，暴露出DNA与蛋白质的混合物。此时，通过蛋白酶的消化，使DNA与蛋白质进行分离，而后利用硅胶柱或者酚：氯仿法，去除蛋白质，从而提取高纯度DNA。（二） 实验材料蛋白质K（20mg/ml）,裂解液（100mmol/l Tris(pH 8.0),500mmol/L EDTA(pH 8.0),20mmol/l NaCl,10% SDS）,硅胶柱，TE（10mmol/l Tris-HCl,1mmol/L EDTA(pH 8.0),0.5*TAE (20mmol/l Tris-乙酸，0.5mmol/l EDTA,pH 8.0),10*Loading buffer(50mmol/l EDTA,60%甘油，0.25%溴酚蓝，pH 7.0)。（三） 实验方法DNA提取的方法目前主要有两种，一种是利用酚：氯仿抽提的方法，另一种是利用硅胶柱吸附的方法。其中酚：氯仿抽提法由于试剂具有较强的腐蚀性和毒性，且对环境污染较大,目前使用者较少。而硅胶柱的方法操作比较简单，且毒性很低，对环境的影响较少，故而被广大实验者所使用。目前硅胶柱的生产厂家较多，以沉淀方法较为多见，主要步骤如下。1 样本前处理哺乳动物细胞：提前准备55冰浴。（1） 对于贴壁细胞，用胰蛋白酶或其他方法收集细胞，对于悬浮细胞，直接收集细胞。用PBS洗3次。（2） 加入3倍体积的裂解液，加入蛋白液K终浓度达到500ug/ml，37孵育46小时。动物组织：提前准备55，70水浴。（1） 将25mg动物组织切碎，置于一无菌的1.5ml离心管中（注意，尽量越碎越好）。（2） 加入150200ul的裂解液（含500ug/ml的蛋白酶K），55孵育直至完全裂解，（因组织不同而异，鼠尾68h,可以过夜裂解，每小时颠倒23次）。（3） 如果需要去除RNA，可以加入适量Rnase A于样品中，室温孵育2min。（4） 12000r离心5min，转移上清于一无菌的离心管。 2 DNA提取过程（1） 利用2倍体积无水乙醇和1/10体积的3mmol/L醋酸钠沉淀DNA（注意沉淀为DNA，不能弃去）（2） 将上述混合物加入硅胶柱中，12000r离心1min，后用75%的乙醇清洗杂质，洗23次。（3） 将硅胶吸附柱置于干净的离心管中，在柱的中央加入200ul预热TE（60），或去离子水（pH）7.0），室温静置1min，12000r离心1min，洗脱。洗脱出的置于保存。3 琼脂糖凝胶电泳 （1）1%琼脂糖的配制：例如：0.15g琼脂糖+15ml 0.5*TAE微波炉加热至沸腾，待降低至70加入Gold view染料（5ug/100ml），倒入小型胶槽中（其他规模胶槽按此比例配制）。室温静置40min。（2）取50100ng DNA,用去离子水补充体积至10ul，加入1ul 10*DNA loading Buffer，进行电泳。电泳 120V 2030 min（电泳液 5*TAE）（四）注意事项1 裂解液与样品的比例要适当，过少的裂解液可能导致样本裂解不完全，而过多的裂解液也会影响提取效果。2 尽量切碎组织，以免影响裂解效果；完全裂解后可以呈粘稠状。3 组织标本一般要保存在-80冰箱或液氮中，且避免反复冻融；使用无菌离心管和枪头，避免酶污染。一 RNA的提取与纯化（一） 实验目的与实验原理RNA的提取方法有很多种，其中Trizol试剂提取RNA是目前常用的方法之一。Trizol是由苯酚和异硫氰酸胍配制而成，在匀浆和裂解过程中，Trizol可以裂解细胞、降解细胞其他成分，但同时保护RNA，抑制RNA酶活性。在氯仿抽提后，RNA存留在水相中，用异丙醇可以将其沉淀，最后得到RNA。（二） 实验材料Trizol，氯仿，DEPC水，DEPC水配制75%乙醇，10*MOPS缓冲液（0.2mol/L MOPS,80mmol/l NaAc,10mmol/l EDTA Na2）,1*MOPS电泳缓冲液（10*MOPS 150ml,37%甲醛80ml,加水至1500ml）,10*RNA上样缓冲液（50%甘油，1mmol/l EDTA,0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青）。（三） 实验步骤1 RNA的提取（1）25cm*25cm培养瓶细胞+1mlTrizol（吹打使之充分裂解）；100ml组织+1mlTrizol（超声破碎仪破碎细胞使之充分裂解），注：6孔板：加0.5mlTrizol。（2）收集后转入0. 5mlEP管，加200ml氯仿。（3）颠倒混匀至氯仿完全混匀，室温23min（发现液面分为两层，上层为清亮，下层为红色）。（4）离心：4，12000r,10min.(5) 转上层水相到1.5EP管，尽量避免吸取中层蛋白质层。注：上层为RNA；中层为蛋白；下层为DNA。（6）等体积异丙醇(400500ul),充分混匀，冰浴10min。注：如果组织很少，为了增加RNA提取的量，可以将异丙醇-20预冷。（7）离心：4，12000r,15min.(8)弃上清，管底可见白色沉淀，即为RNA。（9）加1ml75%乙醇（DEPC水配制），离心：4，12000r,5min。（10）弃上清，加1ml 75%乙醇（可根据实验要求省略）。（11）离心：4，12000r,5min,弃上清。（12）短暂离心1min，吸出残留乙醇，室温晾干5min（2025）。（13）加入3040ul DEPC水，立即用于逆转录或置于75%乙醇中保存于-80冰箱。2 RNA甲醛变性琼脂糖凝胶电泳（1） 配置1.2%甲醛变性琼脂糖凝胶（20ml）琼脂糖0.24g无Rnase水17.4ml10*MOPS2.0ml37%甲醛0.6ml 将琼脂糖加热融化后，加入10*MOPS，待胶冷却至60左右，加入甲醛倒入胶板。65 5min，冰上骤冷，加入0.51.0ul的溴化乙锭（1.0mg/ml）,将配好的1.2%甲醛变性胶先在1*甲醛变性胶电泳缓冲液中预电泳15min。RNA样品在5