GB 5009.128-2016 食品安全国家标准 食品中胆固醇的测定.pdf

中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准G B5 0 0 9.1 2 82 0 1 6食品安全国家标准食品中胆固醇的测定2 0 1 6 - 1 2 - 2 3发布2 0 1 7 - 0 6 - 2 3实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国 家 食 品 药 品 监 督 管 理 总 局发 布G B5 0 0 9.1 2 82 0 1 6 前 言 本标准代替G B/T5 0 0 9.1 2 82 0 0 3 食品中胆固醇的测定 、G B/T2 2 2 2 02 0 0 8 食品中胆固醇的测定 高效液相色谱法 和G B/T9 6 9 5.2 42 0 0 8 肉与肉制品 胆固醇含量测定 。本标准与G B/T5 0 0 9.1 2 82 0 0 3相比, 主要变化如下: 标准名称修改为“ 食品安全国家标准 食品中胆固醇的测定” ; 增加了气相色谱法作为第一法, 高效液相色谱法作为第二法; 比色法改为第三法; 修改了G B/T9 6 9 5.2 42 0 0 8气相色谱法的前处理方法中提取溶剂、 无水乙醇的添加量和定容体积。G B5 0 0 9.1 2 82 0 1 61 食品安全国家标准食品中胆固醇的测定1 范围本标准规定了食品中胆固醇的测定方法。本标准适用于食品中胆固醇的测定, 第一法气相色谱法适用于肉及肉制品、 蛋及蛋制品、 乳及乳制品等各类动物性食品以及植物油脂中胆固醇的测定; 第二法高效液相色谱法适用于肉及肉制品、 蛋及蛋制品、 乳及乳制品等各类动物性食品中胆固醇的测定; 第三法比色法适用于肉及肉制品、 蛋及蛋制品等动物性食品中胆固醇的测定。第一法 气相色谱法2 原理样品经无水乙醇-氢氧化钾溶液皂化, 石油醚和无水乙醚混合提取, 提取液浓缩至干, 无水乙醇溶解定容后, 采用气相色谱法检测, 外标法定量。3 试剂和材料除非另有说明, 本方法所用试剂均为分析纯, 水为G B/T6 6 8 2规定的一级水。3.1 试剂3.1.1 甲醇(CH3OH) : 色谱纯。3.1.2 无水乙醇(C2H5OH) 。3.1.3 石油醚: 沸程3 06 0。3.1.4 无水乙醚(C4H1 0O) 。3.1.5 无水硫酸钠(N a2S O4) 。3.1.6 氢氧化钾(KOH) 。3.2 试剂配制3.2.1 6 0%氢氧化钾溶液: 称取6 0g氢氧化钾, 缓慢加水溶解, 并定容至1 0 0m L。3.2.2 石油醚-无水乙醚混合液(1+1, 体积比) : 将石油醚和无水乙醚等体积混合均匀。3.3 标准品胆固醇标准品(C2 7H4 6O,C A S号:5 7 - 8 8 - 5) : 纯度9 9%。3.4 标准溶液配制3.4.1 胆固醇标准储备液(1.0m g/m L)称取胆固醇标准品0.0 5g( 精确至0.1m g) , 用无水乙醇溶解并定容至5 0m L, 放置04密封G B5 0 0 9.1 2 82 0 1 62 可贮藏半年。3.4.2 胆固醇标准系列工作液分别吸取标准储备液(1 .0m g/m L)2 5L、5 0L、1 0 0L、5 0 0L、20 0 0L, 用无水乙醇定容至1 0m L,该标准系列工作液的浓度分别为2.5g/m L、5g/m L、1 0g/m L、5 0g/m L、2 0 0g/m L。现用现配。4 仪器和设备4.1 气相色谱仪: 配有氢火焰离子化检测器(F I D) 。4.2 电子天平: 感量为1m g和0.1m g。4.3 匀浆机。4.4 皂化装置。5 分析步骤5.1 试样制备5.1.1 肉及肉制品等各类固体试样取样品的可食部分2 0 0g进行均质。将试样装入密封的容器里, 防止变质和成分变化。试样应在均质化2 4h内尽快分析。5.1.2 植物油脂、 乳品等液体试样取混匀后的均匀液体试样装入密封容器里待测。5.2 样品处理5.2.1 皂化称取制备后的样品0.2 5g 1 0g( 准确至0.0 0 1g, 胆固醇含量约为0.5m g 5m g) , 于2 5 0m L圆底烧瓶中, 加入3 0m L无水乙醇,1 0m L6 0%氢氧化钾溶液, 混匀。将试样在1 0 0磁力搅拌加热电热套皂化回流1h, 不时振荡防止试样黏附在瓶壁上, 皂化结束后, 用5m L无水乙醇自冷凝管顶端冲洗其内部, 取下圆底烧瓶, 用流水冷却至室温。5.2.2 提取定量转移全部皂化液于2 5 0m L分液漏斗中, 用3 0m L水分2次3次冲洗圆底烧瓶, 洗液并入分液漏斗, 再用4 0m L石油醚-无水乙醚混合液(1+1, 体积比) 分2次3次冲洗圆底烧瓶并入分液漏斗,振摇2m i n, 静置, 分层。转移水相, 合并三次有机相, 用水每次1 0 0m L洗涤提取液至中性, 初次水洗时轻轻旋摇, 防止乳化, 提取液通过约1 0g无水硫酸钠脱水转移到1 5 0m L平底烧瓶中。5.2.3 浓缩将上述平底烧瓶中的提取液在真空条件下蒸发至近干, 用无水乙醇溶解并定容至5m L, 待气相色谱仪测定。不同试样的前处理需要同时做空白试验。G B5 0 0 9.1 2 82 0 1 63 5.3 测定5.3.1 仪器参考条件a) 色谱柱:D B - 5弹性石英毛细管柱, 柱长3 0m, 内径0.3 2mm, 粒径0.2 5m, 或同等性能的色谱柱;b) 载气: 高纯氮气, 纯度9 9.9 9 9%; 恒流2.4m L/m i n;c) 柱温( 程序升温) : 初始温度为2 0 0, 保持1m i n, 以3 0/m i n速率升至2 8 0, 保持1 0m i n;d) 进样口温度2 8 0;e) 检测器温度:2 9 0;f) 进样量:1L;g) 进样方式: 不分流进样, 进样1m i n后开阀;h) 空气流量:3 5 0m L/m i n;i)氢气流量:3 0m L/m i n。5.3.2 标准曲线的制作分别取胆固醇标准系列工作液注入气相色谱仪, 在上述色谱条件下测定标准溶液的响应值( 峰面积) , 以浓度为横坐标、 峰面积为纵坐标, 制作标准曲线。5.3.3 测定试样溶液注入气相色谱仪, 测定峰面积, 由标准曲线得到试样溶液中胆固醇的浓度。根据保留时间定性, 外标法定量。胆固醇标准溶液的色谱图见图A.1。6 分析结果的表述试样中胆固醇的含量按式(1) 计算:X=Vm10 0 01 0 0(1) 式中:X 试样中胆固醇含量, 单位为毫克每百克(m g/1 0 0g) ; 试样溶液中胆固醇的浓度, 单位为微克每毫升(g/m L) ;V 试样溶液最终定容的体积, 单位为毫升(m L) ;m 试样质量, 单位为克(g) ;10 0 0、1 0 0 换算系数。计算结果应扣除空白。结果保留三位有效数字。7 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的1 0%。8 其他当称样量为0.5g, 定容体积为5.0m L, 方法的检出限为0.3m g/1 0 0g, 定量限为1.0m g/1 0 0g。G B5 0 0 9.1 2 82 0 1 64 第二法 高效液相色谱法9 原理样品经无水乙醇-氢氧化钾溶液皂化, 石油醚和无水乙醚混合提取, 提取液浓缩至干, 无水乙醇溶解定容后, 采用高效液相色谱仪检测, 外标法定量。1 0 试剂和材料除非另有说明, 本方法所用试剂均为分析纯, 水为G B/T6 6 8 2规定的一级水。1 0.1 试剂1 0.1.1 甲醇(CH3OH) : 色谱纯。1 0.1.2 无水乙醇(C2H5OH) 。1 0.1.3 石油醚: 沸程3 06 0。1 0.1.4 无水乙醚(C4H1 0O) 。1 0.1.5 无水硫酸钠(N a2S O4) 。1 0.1.6 氢氧化钾(KOH) 。1 0.2 试剂配制1 0.2.1 6 0%氢氧化钾溶液: 称取6 0g氢氧化钾, 缓慢加水溶解, 并定容至1 0 0m L。1 0.2.2 石油醚-无水乙醚混合液(1+1, 体积比) : 将石油醚和无水乙醚等体积混合均匀。1 0.3 标准品胆固醇标准品(C2 7H4 6O,C A S号:5 7 - 8 8 - 5) : 纯度9 9%。1 0.4 标准溶液配制 1 0.4.1 胆固醇标准储备液(1.0m g/m L) : 称取胆固醇标准品0.0 5g( 精确至0.1m g) , 用无水乙醇溶解并定容至5 0m L, 放置04密封可贮藏半年。1 0.4.2 胆固醇标准系列工作液: 分别吸取标准储备液(1.0m g/m L)2 5L、5 0L、1 0 0L、5 0 0L、20 0 0L, 用无水乙醇定容至1 0m L, 该标准系列工作液的浓度分别为2 .5g/m L、5g/m L、1 0g/m L、5 0g/m L、2 0 0g/m L。现用现配。1 1 仪器和设备1 1.1 匀浆机。1 1.2 高效液相色谱仪: 配有紫外检测器或相当的检测器。1 1.3 电子天平: 感量为1m g和0.1m g。G B5 0 0 9.1 2 82 0 1 65 1 2 分析步骤1 2.1 试样制备1 2.1.1 肉及肉制品等各类固体试样样品取可食部分2 0 0g, 使用绞肉机或匀浆机将试样均质。将试样装入密封的容器里, 防止变质和成分变化。试样应在均质化2 4h内尽快分析。1 2.1.2 乳品等液体试样取混匀后的均匀液体试样装入密封容器里待测。1 2.2 样品处理1 2.2.1 皂化称取制备后的样品0.2 5g 1 0g( 精确至0.0 0 1g, 胆固醇含量约为0.5m g 5m g) , 于2 5 0m L圆底烧瓶中, 加入3 0m L无水乙醇,1 0m L6 0%氢氧化钾溶液, 混匀。将试样在1 0 0磁力搅拌加热电热套皂化回流1h, 不时振荡防止试样黏附在瓶壁上, 皂化结束后, 用5m L无水乙醇自冷凝管顶端冲洗其内部, 取下圆底烧瓶, 用流水冷却至室温。1 2.2.2 提取定量转移全部皂化液于2 5 0m L分液漏斗中, 用3 0m L水分2次3次冲洗圆底烧瓶, 洗液并入分液漏斗, 再用4 0m L石油醚-无水乙醚混合液(1+1, 体积比) 分2次3次冲洗圆底烧瓶并入分液漏斗,振摇2m i n, 静置, 分层。转移水相, 合并三次有机相, 用水每次1 0 0m L洗涤提取液至中性, 初次水洗时轻轻旋摇, 防止乳化, 提取液通过约1 0g无水硫酸钠脱水转移到1 5 0m L平底烧瓶中。1 2.2.3 浓缩将上述平底烧瓶中的提取液在真空条件下蒸发至近干, 用无水乙醇溶解并定容至5m L, 溶液通过0.4 5m过滤膜, 收集滤液于进样瓶中, 待高效液相色谱仪测定。不同试样的前处理需要同时做空白试验。1 2.3 测定1 2.3.1 仪器参考条件a) 色谱柱:C1 8反相色谱柱, 柱长4.6mm, 内径1 5 0mm, 粒径5m, 或同等性能的色谱柱;b) 柱温:3 8;c) 流动相: 甲醇;d) 流速:1.0m L/m i n;e) 测定波长:2 0 5n m;f) 进样量:1 0L。1 2.3.2 标准曲线的制作分别取1 0L胆固醇标准工作液注入高效液相色谱仪, 在上述色谱条件下测定标准溶液的响应值( 峰面积) , 以浓度为横坐标、 峰面积为纵坐标, 制作标准曲线。G B5 0 0 9.1 2 82 0 1 66 1 2.3.3 测定将1 0L试样溶液注入高效液相色谱仪, 测定峰面积, 由标准曲线得到试样溶液中胆固醇的浓度。胆固醇标准溶液的色谱图见图A.2。1 3 分析结果的表述试样中胆固醇的含量按式(2) 计算:X=Vm10 0 01 0 0(2) 式中:X 试样中胆固醇的含量, 单位为毫克每百克(m g/1 0 0g) ; 试样溶液中胆固醇的浓度, 单位为微克每毫升(g/m L) ;V 试样溶液定容体积, 单位为毫升(m L) ;m 试样质量, 单位为克(g) ;10 0 0、1 0 0 换算系数。计算结果应扣除空白。结果保留三位有效数字。1 4 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的1 0%。1 5 其他当称样量为1g, 定容体积为5m L, 方法的检出限为0.6 4m g/1 0 0g, 定量限为2.1m g/1 0 0g。第三法 比色法1 6 原理样品进行脂肪提取后的油脂, 经无水乙醇-氢氧化钾溶液皂化, 用石油醚提取, 浓缩后加入冰乙酸,以硫酸铁铵试剂作为显色剂, 采用分光光度计, 在5 6 0n m5 7 5n m波长下检测, 外标法定量。1 7 试剂和材料除非另有说明, 本方法所用试剂均为分析纯, 水为G B/T6 6 8 2规定的三级水。1 7.1 试剂1 7.1.1 无水乙醇(C2H5OH) 。1 7.1.2 石油醚: 沸程3 06 0。1 7.1.3 硫酸(H2S O4) 。1 7.1.4 冰乙酸(C2H4O2) : 优级纯。1 7.1.5 磷酸(H3P O4) 。G B5 0 0 9.1 2 82 0 1 67 1 7.1.6 硫酸铁铵F e NH4(S O4)2H2O 。1 7.1.7 钢瓶氮气(N2) : 纯度9 9.9 9%。1 7.1.8 海砂。1 7.1.9 氢氧化钾(KOH) 。1 7.1.1 0 氢氧化钠(N a OH) 。1 7.1.1 1 盐酸(HC l) 。1 7.1.1 2 乙醚(C2H5O) 。1 7.2 试剂配制1 7.2.1 铁矾储备液: 称取4.4 6 3g硫酸铁铵F e NH4(S O4)2H2O 于1 0 0m L磷酸中( 如果不能充分溶解, 超声后取上清液) , 贮藏于干燥器内, 此液在室温中稳定。1 7.2.2 铁矾显色液: 吸取铁矾储备液1 0m L, 用硫酸定容至1 0 0m L。贮藏于干燥器内, 以防吸水。1 7.2.3 5 0%氢氧化钾溶液: 称取5 0g氢氧化钾, 用水溶解, 并定容至1 0 0m L。1 7.2.4 5%氯化钠溶液: 称取5g氯化钠, 用水溶解, 并定容至1 0 0m L。1 7.2.5 盐酸溶液(1+1) : 将盐酸与水等体积混合均匀。1 7.2.6 氢氧化钠溶液(2 4 0g/L) : 称取2 4g氢氧化钠, 用水溶解并定容至1 0 0m L。1 7.2.7 海砂: 取用水洗去泥土的海砂或河砂, 先用盐酸溶液(1+1) 煮沸0.5h, 用水洗至中性再用氢氧化钠溶液(2 4 0g/L) 煮沸0.5h, 用水洗至中性, 经1 0 05干燥备用。1 7.3 标准品胆固醇标准品(C2 7H4 6O,C A S号:5 7 - 8 8 - 5) : 纯度9 9%。1 7.4 标准溶液配制1 7.4.1 胆固醇标准储备液(1.0m g/m L) : 称取胆固醇标准品0.1 0g( 精确至0.1m g) , 用冰乙酸溶解并定容至1 0 0m L。放置4密封可贮藏半年。1 7.4.2 胆固醇标准工作液(1 0 0g/m L) : 吸取胆固醇标准储备液(1.0m g/m L)1 0m L, 用冰乙酸定容至1 0 0m L。现用现配。1 8 仪器和设备1 8.1 匀浆机。1 8.2 分光光度计。1 8.3 电子天平: 感量为1m g和0.1m g。1 9 分析步骤1 9.1 胆固醇标准曲线的制作吸取胆固醇标准工作液0.0m L、0.5m L、1.0m L、1.5m L、2.0m L分别置于1 0m L试管中, 在各管内加入冰乙酸使总体积均达4m L。沿管壁加入2m L铁矾显色液, 混匀, 在1 5m i n9 0m i n内, 在5 6 0n m5 7 5n m波长下比色。以胆固醇标准浓度为横坐标, 吸光度为纵坐标制作标准曲线。1 9.2 测定1 9.2.1 食品中脂肪的提取与测定根据食品种类分别用索氏脂肪提取法, 研磨浸提法和罗高氏法提取脂肪。并计算出每1 0 0g食品G B5 0 0 9.1 2 82 0 1 68 中的脂肪含量。1 9.2.2 食品中胆固醇的测定将提取的油脂3滴4滴( 约含胆固醇3 0 0g 5 0 0g) , 置于2 5m L试管中, 准确记录其质量。加入4m L无水乙醇,0.5m L5 0%氢氧化钾溶液, 混匀, 装上冷凝管, 在6 5