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双歧杆菌的检测与鉴定,食科0503 唐逸甜 朱凯艳,特征性酶 F6PPK鉴定法 聚合酶链式反应(PCR)方法 分离培养 生化法 气相色谱法 离子色谱法 DNA探针杂交法,双歧杆菌是目前较常用的益生菌之一，其特征性酶的识别对于属及种的鉴定具有重要意义。果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶 (Fructose-6-phosphate phosphoketolase,F6PPK) 在双歧杆菌己糖代谢中起关键作用，它裂解果糖-6-磷酸，使双歧杆菌发酵糖类的终产物乙酸和乳酸呈3:2的比例。因此检测出F6PPK可作为鉴定双歧杆菌属细菌的重要特征之一。 菌体细胞经超声波破碎后，F6PPK游离出来，使果糖-6-磷酸盐最终生成乙酞磷酸盐，乙酞磷酸盐与FeCl3,结合形成它的氧酸盐，显示红褐色或红紫色而被检测出来。 因此经以上程序测定如显色则F6PPK为阳性，否则为阴性。,特征性酶 F6PPK 鉴定法,将从样品中分离出的菌种培养于厌氧液体改良MRS培养基中37生长24 h。 将菌液4400 rpm离心10 min,收集菌体，缓冲液洗涤2次，最后溶于约4 mL缓冲液中，制成细菌悬液。 用超声波粉碎仪，400 W条件下；每处理5 s、间隔5 s,超声粉碎8 min，至菌体溶液呈半透明。 破碎后，取0.5 mL于离心管中，加试剂和各125 L,37保温30 min。 加试剂 0.750mL,室温10 min。 加试剂和 各500 L,室温5 min。 加试剂 500 L,显色。红褐色或红紫色为阳性，黄色为阴性。,试剂：0.5 g/100 mL FeCl36H2O溶于0.1 MHCl。,检测步骤：,利用果糖-6-磷酸盐对从生物制剂中分离得到的菌种进行果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶(F6PPK)的测定，初步确定菌种是否为双歧杆菌属。F6PPK测定的操作如下：,缓冲液：现用现配。取0.05 M Na2HPO4 31.5 mL 和0.05 M NaH2PO4 68.5 mL,再加500 mg/L半胱氨酸-盐酸盐。,试剂：6 mg/mL氟化钠加10 mg/mL碘乙酸钠。 试剂：果糖-6-磷酸盐80 mg/mL水溶液。,试剂：现用现配。盐酸羟胺139 mg/mL。用氢氧化钠中和至pH6
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