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文档简介

实验七 聚合酶链式反应（PCR）技术,1. 实验目的 2. 实验原理 3. 实验仪器、材料与试剂 4. 实验步骤 5. 实验结果与讨论,实验目的,掌握PCR反应的原理及技术。,实验原理,聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）简称PCR技术，是一种体外扩增特异DNA片段的技术。 利用PCR技术可在短时间内获得数百万个特异的DNA序列的拷贝。PCR技术在分子克隆、遗传病的基因诊断等方面得到广泛的应用。 PCR技术实际上是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。 PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。,PCR：变性退火延伸,PCR,反应分为三步： 1.变性：在高温条件下，DNA双链解离形成单链DNA； 2.退火：当温度突然降低时引物与其互补的模板在局部形成杂交链； 3.延伸：在DNA聚合酶、dNTPs和Mg2+存在的条件下，聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。 以上三步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，几十个循环之后，介于两个引物之间的特异性DNA片段得到了大量复制，数量可达到1067个拷贝。,PCR技术的参数主要有7个： 聚合酶、引物、dNTPs、反应buffer、二价离子、模板、一价离子。,实验仪器、材料与试剂,（一）仪器 1. PCR仪 2. 台式离心机 3. 微量取液器,（二）材料 模板DNA,（三）试剂 1. 10x PCR buffer 2. dNTPs 2.5mM 3. Taq 酶 5u/l 4. 引物1和2( 2mol/L) (T3,T7) 5. 模板,实验步骤,1. 在0.2ml Eppendorf管内配制50l反应体系 ddH2O： 33.5ul 10x PCR buffer： 5ul dNTPs（2.5mM）： 4ul 引物1 (2uM)： 1ul 引物2 (2uM)： 1ul MgCl2 3ul Taq 酶： 0.5ul 模板： 2ul 共50ul 体系,2. 按下述循环程序进行扩增 94 5分钟，1个循环； 94 30秒，52 30秒，72 30秒，30个循环； 72 延伸10 分钟。 4保温。,3. 扩增结束后取50l扩增产物，利用琼脂糖电泳检测DNA扩增情况,并切胶用于回收.,实验结果与讨论,PCR
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