实验四PCR扩增技术.ppt

实验四 PCR扩增技术,一实验目的及背景,多聚酶链式反应(polymerase chain reaction)简称技术，是年代中期发展起来的一种体外扩增特异片段的技术。此法操作简便， 可在短时间内在试管中获得数百万个特异的目的序列的拷贝，技术虽然问世仅数年时间， 但它已迅速渗透到分子生物学的各个领域，引起了生物技术发展的一次革命，目前它在分子克隆， 目的基础检测，遗传病的基因诊断，法医学，考古学等方面得到了广泛的应用。 技术实际上是在模板， 引物和种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于聚合酶的酶促合反应，技术的特异性取决于引物和模板结合的特异性。 反应分三步：变性（denaturation）；退火（annealing）；延伸（ex tension），反应过程见图。,模板在条件下变性形成单链； 在条件下根据目的基因两侧序列设计的引物分别与其同源序列结合；下在耐热性聚合酶Taq 酶催化下， 在种dNTP存在条件下延伸形成双链。完成一次循环。 接着又以新合成的为模板进行同样反应，如次往复循环30次，由于每次循环目标都以n次幂扩增，次循环后目的DNA的量增加倍。成功的反应要求反应有很好的特异性和相当的扩增效率。 要达此目的反应要注意以下问题：,模板：反应中量在ngng左右。且纯度较高， 以增加反应特异性。 dNTP:反应体系中达100M200M。 Mg2+：Mg2+是Taq酶的辅基,浓度在2.0mM左右，浓度太低Taq酶活力降低；太高反应特异性降低。 引物：根据目的基因两侧特定序列设计。引物约20碱基左右；含量在40 70之间；引物内部不能有回文序列；引物端不能互补。,Taq酶：它是从嗜热杆菌中提取的耐热性聚合酶，在时分钟还有活力。 变性温度：在之间使模板充分变性。 复性温度：左右，此温度选择是根据模板和引物配对结合强弱而定， 它是反应特异性的决定因素。 延伸温度：左右，为Taq酶最适反应温度。,buffer: 500mM KCl 100mM Tris-HCl (pH9.0) 0.1% 明胶 1% TritonX-100 MgCl2 2.5mM dNTP: 1mM 引物：actin上， actin下 模板： 20ng/l Taq酶： 5u/l PCR仪，凝胶成像系统，电泳系统,二实验试剂及仪器,PCR仪 凝胶成像系统,三. 实验方法,向无菌的200l Eppendorf管中依次加入以下溶液 反应物 体积 10buffer 2.5l *5 12.5 4dNTP(1mM) 2.5l *5 12.5 无菌水 18l *5 90 Taq酶 (1U/ul) 0.5l *5 2.5 混合，吸取24.5l 引物 上 0.5l *5 2.5 引物 下 0.5l *5 2.5 模板 (20ng) 0.5l 总体积 25l,反应体系混匀，离心 在仪上按以下方式循环 4变性 5分钟 4变性 45秒 30个循环 55退火 45秒 72延伸 1分钟 延伸反应10分钟。 取5l反应液加4l Loading buffer在.琼脂糖凝胶上120伏，电泳2小时。 在凝胶成像系统上观