生物工程下游技术大纲汇总

生物工程下游技术大纲汇总第一章 绪 论（3学时）【掌握】1、 生物技术与生物分离的基本概念；2、生物分离的特点和原理；3、生物分离的一般流程【熟悉】1、 生物分离效率的概念【掌握】1 生物技术与生物分离的基本概念生物技术：是有机体的操作和应用有机体生产有用物质、改善人类生存环境的技术。生物分离：生物工程中生物产品如生化制品、蛋白质、多核苷酸和细胞等的分离和纯化。是生物技术的重要组成部分。2生物分离的特点和原理（一）生物分离的特点： 产物浓度低的水溶液 (原因：a 氧传递限制；b 细胞量; c 产物抑制） 发酵液：0.1-10g/L；动物细胞培养液：5-50mg/L 组分复杂 (a 大分子;b 小分子;c 可溶物;d 不可溶物;e 化学添加物） 大分子物质：核酸、蛋白质、多糖、类脂等 小分子物质：代谢产物，如氨基酸、有机酸、生物碱、可溶性与不可溶物质 产物稳定性差 产物失活（化学和微生物降解） a. 化学降解(pH , 温度); b. 微生物降解（酶作用， 染菌） 质量要求高 （药品或食品）： 安全性：除去热原 纯度：蛋白类药物中杂蛋白2%，胰岛素中 10。 第七章 液相色谱分离技术与理论（9学时）【掌握】1、色谱原理与分类；2、色谱过程理论基础【熟悉】1、分离度；2、凝胶过滤色谱；3、离子交换色谱；4、液相色谱应用实例【了解】1、 羟基磷灰石色谱；2、超临界流体色谱【掌握】1、色谱原理与分类1色谱原理色谱法是一种分离技术，是混合物最有效的分离、分析方法。 试样混合物的分离过程也就是试样中各组分在称之为色谱分离柱中的两相间不断进行着的分配过程。 其中的一相固定不动，称为固定相； 另一相是携带试样混合物流过此固定相的流体（气体或液体），称为流动相。 当流动相中携带的混合物流经固定相时，其与固定相发生相互作用。由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中流出。与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。2色谱分类 1)、按应用的目的A、制备性色谱(preparation Chromatography)：工业规模，实验室规模B、分析性色谱(analytical Chromatography)：GC、LC、HPLC、TLC等。2)、按流动相A、GC:气-固色谱法(固定相为固体)气-液色谱法(将不挥发的液体固定在适当的固体载体上作为固定相)B 、LC 液-固色谱(固定相为固体)液-液色谱(液体固定相固定在适当的固体上)3)、按色谱的展开形式A、柱色谱法B、毛细管色谱法C、平板色谱法：硅胶板色谱、纸色谱4)、按操作压力A、低压色谱（0.5 MPa）分离的装置比较简单，操作费用低，但流动相流动速率慢，分离时间长，常常使生物活性物质活性降低。B、中压色谱分离（0.55 MPa）C、高压色谱（550 MPa）分离技术的特点是，流动相流动速率高， 分离时间短，分辨率高。缺点是设备费昂贵，此外在高压作用下有 些生物物质有变性的可能。5) 、按分离操作方式A)、洗脱法（elution chromatography）B)、迎头法 迎头分析法与一般的固定床吸附操作相同，大量料液连续输入到色谱柱中，直到在出口处发生溶质穿透（breakthrough）。迎头分析中各个溶质按其在固定相和流动相间分配系数的大小次序穿透，只有最先穿透的（分配系数最小）的组分能以纯粹的状态得到部分回收，之后的流出液均为双组分或双组分以上的混合物。C)、置换法 与洗脱展开相似，唯一不同之处是：顶替展开所采用的洗脱液（流动相）中含有与固定相的亲和力比料液中各个组分都大的物质，这种物质称为顶替剂（displacer）。顶替剂将料液中所含溶质按其与固定相亲和力的大小不同从柱中次序顶替（洗脱）出来。顶替展开法可使溶质区带得到浓缩，适于大量处理稀溶液。6)、按原理分类2色谱过程理论基础7.2.1 洗脱曲线及有关术语1. 基线：图中的O t 表示只有平衡液通过检测器时响应信号的记录。在条件稳定时为一直线。2. 保留值：表示试样中各组分在色谱柱内停留的时间数值。保留时间 tR：指待测组分从进样到柱后出现浓度最大值时所需的时间, 如图中的O B。死时间tM：指不与固定相作用的气体（如空气、甲烷等）的保留时间，如图中OA所示。调整保留时间 t R：指扣除了死时间的保留时间，如图中的AB。 即：tR = tR tM 注意：当固定相一定，在确定的实验条件下，任何物质都有一定的保留时间，它是色谱分析法的基本定性参数。保留体积VR：指从进样到柱后出现待测组分浓度极大值时所通过的流动相体积。 VRtR F0 F0流动相体积流速(ml/min)死体积VM：指色谱柱内除了填充物固定相以外的空隙体积、色谱仪中管路和连接头间的空间及检测器的空间的总和。 VMtMF0 调整保留体积VR：指扣除了死体积后的保留体积。相对保留值 r21： 指组分2和组分1调整保留值之比，是一个无因次量。 r21 = tR2 /tR1 = VR2 /VR1 注意：相对保留值只与柱温及固定相性质有关，与其他色谱操作条件无关，它表示了色谱柱对这两种组分的选择性。分配比k, 即容量因子：色谱柱对组份保留能力的重要参数标准偏差： 1/2EF1/4IJ（1/4Wb）即0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半。峰高 h 是色谱峰顶到基线的距离。h、是描述色谱流出曲线形态的两个重要参数 。半峰宽Y1/2: 峰高一半处色谱峰的宽度。如图中的GH。 半峰宽与标准偏差的关系为：峰基宽度Wb：即通过流出曲线的拐点所作的切线在基线的截距，Wb与的关系：Wb 4（1）分配系数Kp：定温定压下物质在固定相和流动相中的浓度比。 KPAs / Am （s固定相； m流动相） （2）容量因子K：分配系数与两相体积有关的参数，表示溶质A在两相中的质量之比。 K=mAs / mAm =KPVS/Vm分配系数Kp和体积保留值VR的关系VR = VM + KpVs 即：VR = VM（1+ K） 或：K（VRVM）/ VM当流动相流速一定时有： K（tRtM）/tM tR/tM 从上两式可以看到，色谱分析法中各组分保留值随K 而变化，而tM 、tR都可以从色谱图上测得，从而可以求出K。容量因子K是描述溶质保留行为的一个重要参数。（3）分离比a色谱分析法中A、B两种物质的分离效率可用分离比表示。当两相体积一定时，分离比与保留值的关系为： aKp(B)/Kp(A)K(B)/K(A)tR(B)/ tR(A)B，A 在色谱法中，分离比等于被分离两种物质的调整保留值之比。 tR(B)/ tR(A)B，A也称相对保留值。1. 塔板理论（plate theory）色谱柱长：L， 虚拟的塔板间距离：H， 色谱柱的理论塔板数：N，则三者的关系为： N = L / H理论塔板数与色谱参数之间的关系为：保留时间包含死时间，在死时间内不参与分配!2.有效塔板数和有效塔板高度单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高。用不同物质计算可得到不同的理论塔板数。组分在tM时间内不参与柱内分配。需引入有效塔板数和有效塔板高度：由于同一色谱柱对不同物质的柱效能不同，故用H、n、H有效、n有效等指标表示柱效能时应注明被测物质和色谱条件。 (1)当色谱柱长度一定时，塔板数 n 越大(塔板高度 H 越小)，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越高，所得色谱峰越窄。 (2)不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。(3)柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数K相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。(4)塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下柱效不同的实验结果，也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。【熟悉】1分离度分离度的表达式：R=0.8：两峰的分离程度可达89%；R=1：分离程度98%；R=1.5：达99.7%（相邻两峰完全分离的标准）。（1）分离度与柱效 分离度与柱效的平方根成正比， r21一定时，增加柱效，可提高分离度，但组分保留时间增加且峰扩展，分析时间长。（2）分离度与r21 增大r21是提高分离度的最有效方法，计算可知，在相同分离度下，当r21增加一倍，需要的n有效 减小10000倍。 增大r21的最有效方法是选择合适的固定液。2凝胶过滤色谱gel filtration chromatogratography (GFC)定义：利用凝胶为固定相，根据料液中溶质相对分子质量的差别进行分离的液相色谱法。凝胶特性参数排阻极限（exclusion limit） 凝胶过滤介质的排阻极限是指不能扩 散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子质量。 例如Sephadex G50的排阻极限是30 kD, 即相对分子质量大于该数值的分子不能进入到凝胶网络中，其洗脱体积为V0。分级范围（fractionation range） 能被凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离的溶质的相对分子质量范围。Sephadex G50的分级范围为1.530kD溶胀率溶胀后每克干凝胶所吸收的水分的百分数。Sephadex G50的溶胀率为500土30。凝胶粒径凝胶一般为球形，其粒径大小对分离度有重要影响。粒径越小，HETP越小，分离效率越高。凝胶粒径多用筛目或微米表示。软凝胶：50150 m(100200目)； 硬凝胶：550 m 。床体积（bed volume）1g干燥凝胶溶胀后所占有的体积。 Sephadex G50的床体积为911cm3/g干胶。空隙体积（void volume） 指色谱柱中凝胶之间空隙的体积，即V0值。空隙体积可用相对分子质量大于排阻极限的溶质测定，一般使用平均相对分子质量为2000 kD的水溶性蓝色葡聚糖（blue dextran）。3离子交换色谱ion exchange chromatography （IEC）定义：利用离子交换剂为固定相，根据荷电溶质与离子交换剂之间静电相互作用力的差别进行溶质分离的洗脱色谱法。离子交换层析的基本步骤平衡 上样吸附 洗脱 再生4液相色谱应用实例第八章 亲和色谱（4学时）【掌握】1亲和色谱原理；2亲和色谱介质【熟悉】亲和色谱的应用【了解】其他亲和分离技术【掌握】1亲和色谱原理8.1 生物亲和作用8.1.1 生物亲和作用的本质v 生物分子间的特异性相互作用称为生物亲和作用（bioaffinity）或简称亲和作用（affinity）。v 利用生物分子间的这种特异性结合作用的原理进行生物物质分离纯化的技术称为亲和纯化（affinity purification）。v 亲和作用的分子（物质）对可以是：大分子-小分子，大分子-大分子，大分子-细胞，细胞-细胞。v 具有亲和作用的分子对之间具有“钥匙”和“锁孔” 的空间结构关系。v 亲和结合作用，至少存在3个对应官能团相结合： v 静电作用 v 氢键 v 疏水相互作用v 配位键 v 弱共价键 原理及过程配基固定化：亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂吸附样品：当含有混合组份的样品（流动相）通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附，其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出样品解析：然后改变流动相成份，将结合的亲和物洗脱下来8.1.2 影响亲和作用的因素1. 离子强度v 离子强度影响静电引力、氢键作用、疏水相互作用等。 2. pHv a-羧基的pKa3.43.8v b-羧基的pKa3.94.0 v a-氨基的pKb7.47.5v e-氨基的pKb10.010.4 3. 抑制氢键形成的物质v 脲和盐酸胍（guanidinohydrochloric acid）的存在可抑制氢键的形成。 4. 温度v 温度升高，静电作用、氢键及金属配位键减弱；疏水性相互作用增强 。5. 离液离子v 在SCN，I和ClO4等离液阴离子存在下，疏水相互作用降低。 6. 螯合剂8.1.3 亲和作用体系v 将亲和体系中的一种分子与固体粒子共价偶联，可特异性结合另一种分子（目标产物） ，使其从混合物中高选择性地分离纯化。v 一般将被固定的分子称为其亲和结合对象的配基（ligand），用L表示。v Keq越大，亲和结合作用越强。Keq一般为104108 L/mol，最高可达到1015 L/mol 。 8.2 亲和色谱 亲和色谱的特点选择性高、特异性极强操作条件温和回收率高v 亲和色谱的局限性普遍性、通用性不够费用高8.2.1 亲和色谱填料(自学)8.2.2 亲和色谱洗脱方法特异性洗脱法v 利用含有与亲和配基或目标产物具有亲和结合作用的小分子化合物溶液为洗脱剂，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合，脱附目标产物。v 例如：Lys和Arg均为t-PA的抑制剂，利用固定化Lys为配基亲和分离t-PA时，可用Arg溶液进行洗脱。v 利用con A为配基的目标产物可用葡萄糖溶液洗脱。v 特异性洗脱法的洗脱条件温和，有利于保护目标产物的生物活性，另外，由于仅特异性洗脱目标产物，对于特异性较低的亲和体系（例如，用三嗪类色素为配基时）或非特异性吸附较严重的物系，特异性洗脱法有利于提高目标产物的纯度。 非特异性洗脱法v 非特异性洗脱通过调节洗脱液的pH值、离子强度、离子种类或温度等理化性质降低目标产物的亲和吸附作用，是使用较多的洗脱方法。 9.2.3 应用举例 1. t-PA的纯化v 组织纤溶酶原激活剂（t-PA）是一种糖蛋白，具有激活纤溶酶原、促进血纤维蛋白溶解的作用，是治疗血栓等心脑血管疾病的蛋白药物。v 赖氨酸、精氨酸、氨基苄脒和纤维蛋白与t-PA具有亲和结合作用，常用做亲和色谱纯化t-PA的配基。 v 图5-3是利用精氨酸-Sepharose 4B亲和色谱法纯化猪心组织t-PA的结果。原料为猪心丙酮粉经醋酸钾抽提、硫酸铵沉淀。 2. 干扰素的纯化v 干扰素（interferon，IFN） 对癌症、肝炎等疾病具有特殊疗效。v IFN主要分、和三种类型，可通过动物细胞培养或重组DNA大肠杆菌发酵大量生产。v 色素亲和色谱、固定化金属离子亲和色谱和免疫亲和色谱可用于IFN的纯化。v 如图5-3是利用单抗免疫亲和色谱法纯化源于大肠杆菌的重组人白细胞干扰素（rhIFN- ）的操作条件和结果。rhIFN- 的比活提高了1150倍，收率达95。 二、亲和色谱的应用1.免疫亲和色谱（immunoaffinity chromatography）利用抗体作为配基的亲和色谱。Keq:107-1012L/mol优点：高效缺点：单抗昂贵；多抗特异性低2.色素亲和色谱（dye-ligand affinity chromatography ）利用色素作为配基的亲和色谱。三嗪类色素(Triazine dyes)是一类分子内含有三嗪环的合成染料，与NAD的结合部位相同，又称为生体模拟色素(biomimetic dye)。除脱氢酶和激酶外，三嗪类色素还与血清白蛋白、干扰素、核酸酶和糖解酶等具有很高的亲和力。3.t-PA的纯化-酶的抑制剂为配基4.固定化金属离子亲和层析（immobilized metal affinity chromatograp