《普通组织化学》PPT课件.ppt

第二章 细胞和组织化学方法,第一节 概念,组织化学（istochemistry） 是介于组织学、细胞学与生物化学之间的边缘学科,它是在保持组织或细胞基本上不改变其生活状态时细微结构的条件下采用显微镜对组织或细胞内的某些化学成分和酶活性进行定性、定位和定量研究，以便阐明它们在组织或细胞中存在和含量的机能意义。,组织化学源于组织学、细胞学和生物化学，又有别于这些学科。 组织化学与组织学和细胞学的不同在于，组织学和细胞学的着眼点是研究组织和细胞形态结构； 而组织化学的着眼点是研究组织和细胞内的化学组成及其含量；,生物化学技术中通常是将组织和细胞破坏制成均浆，然后进行化学沉淀，故其定位性能差； 而组织化学技术中是尽可能在组织或细胞内原位显示各种化学成分，故定位性能好。 生物化学技术中的化学反应是在试管内进行的，而组织化学技术中的化学反应通常是在组织切片或涂片中进行的。,组织化学在显微镜下能看到所 要检查的化学物质。 所看到的不是某种化学物质本 身，而是该物质在其存在的部 位经过化学反应后看得见反应 产物。 这种产物所在的位置和数量能 够代表该物质的位置和数量。,组织化学的基本原理是在组织切片或细胞内的拟检成分起化学反应。形成有颜色的终末反应产物，该产物沉淀在相应成分所在的位置上，用以研究糖类.脂类.蛋白质.酶类和核酸等物质在组织或细胞内的分布含量。,在组织切片或涂片上显示不同的化学物质，需要采用不同的组织化学处理程序. 就是应用某类方法处理之后所显示出的反应产物，只能代表相应的某类物质而不能代表其他。,原理：化学试剂+化学物质-变成有色反应产物,用显微镜观察其变化者称显微镜细胞组织化学，若用电镜观察者称电镜细胞组织化学，用免疫技术方法则称免疫组织化学或免疫电镜细胞化学。 用细胞和组织化学方法显示细胞组织结构中各种酶的定性、定位、定量则称酶组织化学。,TX 第二节 细胞和组织化学的基本技术 在应用 组织化学技术显示组织和细胞内化学物质及定位和定量以及代谢状态时，需要满足以下要求： 1、保持组织和细胞形态结构的良好状态，以便反应产物的定位精确。如果形态结构破坏而失真，则定位困难。,（一） 2、具备一定的特异性，以便获取正确的实验结果。 （ 3、具备一定的灵敏性，以便含量极微的物质也能被显示出来。,（4 4、生成的反应产物必须是有色沉淀，颗粒微细不溶，定位于原位。反应物沉淀的颜色深度与相应物质含量或酶的活性具有一定的量效关系。 （、 5、反应产物具有稳定性，以便于重复观察 （、 6、要有重复性。,7、选择的试剂必须是分析纯，对被检测物质或酶应无任何影响；实验所用器皿必须清洁无污染杂质，使用的蒸馏水应为双蒸水。 8、为了保证实验的可靠性、科学性，防止假阳性的发生，必须同时作对照实验。,一、动物的处死 1、麻醉 对小动物可将浸有乙醚棉球与小动物同时密封于玻璃容器。较大动物静脉注射4%戊巴比妥（1ml/kg体重）或腹腔内注射20%氨基甲酸乙酯（5ml/kg体重）。 2、空气栓塞 较大动物如兔，用较大空针从耳静脉将空气一次推入。 3、颈椎脱臼或断头 适用于小动物 4、股动物放血 将动物麻醉，切开股动脉放血。,二、取材 所取组织细胞必须越新鲜越好，防止组织变性、挤压、破碎，组织块不宜太大，光镜标本不超过1cm1cm0.3cm,电镜标本约在0.5mm左右，条件允许时应低温操作（04）。 冰冻切片材料取材后应立即用液氮速冻， -70或-40低温冰箱保存。,三、固定 将组织浸入某些化学试剂，使细胞内的物质尽量接近其生活状态时的形态结构和位置，这一过程称为固定。,1）、固定的意义,保持细胞与生活时的形态相似，防止自溶与腐败。 保持细胞内特殊的成分与生活状态时相仿：经过固定，细胞内的一些蛋白质等可沉淀或凝固，使其定位在细胞内的原有部位，有利于其后物质的确切定位，对于不同的物质应选用不同的固定剂和固定方法。 便于区别不同组织成分：组织细胞内的不同物质经固定后产生不同的折光率，对染料产生不同的亲和力，经染色后容易区别。 有利于切片：固定剂有硬化作用，使组织硬度增加，便于制片。,2）、固定的要求,既要保持这些物质的精确定位。又要保存它们的反应性。一般来说，新鲜未固定的组织，对于反应性的保持最好，但形态结构的保存差。可溶性物质易于弥散。而经过固定的组织，形态结构的保持较好，但其反应性却随固定程度而减弱，化学物质易丢失，特别是酶易失去活性,不同的固定剂和固定方法会引起不同程度的细胞内蛋白质、粘多糖、脂类、核酸和低分子量物质的损失，因此应根据研究目的的不同选择合适的固定剂和固定方法，以使所研究的物质损失达到最小。 固定液的量要足，一般应为组织块总体积的45倍，而且应在组织取下后立即或尽快放入适当固定液中。组织块的大小、固定时间、固定温度都应考虑。,3）、固定剂的种类和作用,用于固定组织的化学物质称为固定液或固定剂。 1、按组成分类 一般由单一化学物质组成者称为固定剂或单纯固定液。由多种化学物质混合组成者称为混合固定液或复合固定液。常用的单纯固定液和混合固定液介绍如下：,甲醛,是一种易挥发液体。市面上出售的为40%的甲醛水溶液，也称为福尔马林。一般作为固定剂使用的10%的甲醛，是用水和40%甲醛（9：1）混合而成，实际上是4%甲醛。 甲醛水溶液渗透能力强。固定均匀，组织收缩小，但经乙醇脱水后收缩较大。甲醛通过使蛋白质分子发生交联而产生固定作用。,重铬酸钾,红色结晶，具有毒性，常用其1%3%水溶液作为固定剂。 可以使蛋白质变为不溶性。保持其生活时的状态，对于细胞质的固定较好，并且可固定类脂类物质使其不溶于脂溶剂。,苦味酸,为黄色结晶，是一种强酸，易燃易爆，常用其饱和溶液作为固定剂。 能沉淀一切蛋白质，穿透慢，组织收缩明显，但组织无明显硬化。对脂肪为类脂无固定作用。,丙酮,为易挥发易燃的无色液体，可与水、醇、氯仿和醚等混合。 可使蛋白质沉淀，渗透力强，对核的固定差。广泛用于酶组织化学方法中各种酶的固定。,Bouin液,是一种常规用于外科活检标本固定的良好固定液。用于固定大多数器官和组织，固定效果好，组织细胞结构完整。细胞核着色鲜明，但细胞质着色较差。 配方：饱和苦味酸水溶液：甲醛水溶液：冰醋酸=15：5：1,Carnoy液,固定胞浆和细胞核，对于染色体固定佳，显示DNA和RNA效果好，也常用于糖原和尼氏体的固定。但不能保存脂类。 配方：冰醋酸10ml，氯仿30ml，无水酒精60ml。,Zenker液,为形态学研究常用的固定液。可用于固定多种组织，使细胞核和细胞质染色较清晰。 配方：储存液由重铬酸钾2.5g，升汞5g，蒸馏水100ml组成，用时加入冰醋酸5ml。,凝固性固定剂:如乙醇.甲 醇.醋酸和苦味酸等；固定剂分为： 非凝固性固定剂: 如甲醛、戊二醛、重铬 酸钾和锇酸等。,2、按作用分类,凝固性固定剂作用:于溶胶状的蛋白质，使其发生凝固并呈海绵状，在石蜡包埋时利于溶化的石蜡的浸入，但易使细胞器特别是线粒体受到破坏和形态改变。,非凝固性固定剂的作用:是增加溶胶状蛋白质的粘度，进而使细胞器变成不溶性凝胶状态。这种固定剂对细胞器的结构保持较好，但对包埋剂的浸透增强了阻力。,4）、固定液的选择 1、糖：组织细胞中最常见的多糖是糖原和粘液物质。冷饱和苦味酸的纯酒精溶液加甲醛（9：1）及冷carnoy液，被广泛采用。,2、脂类：除含有脂溶剂的固定剂外，其他的固定液均可应用。常用的是甲醛 。,3、核酸： 凝固性固定剂。如乙醇和醋酸等。能有效地保持核酸，carnoy固定液最为常用，但不宜时间过长。酸性固定液中固定过久，会发生核酸和脱氧核糖核酸被抽提出来。,4、酶： 在酶组织化学技术中，为了增强酶反应的敏感性，必须高效地保存酶活性。而为了正确判断反应结果，则必须使酶反应能在原位进行。丙酮和乙醇在很大程度上能使酶的反应在原位进行不会发生反应产物的扩散。冷丙酮和冷乙醇最好。经甲醛（固定24h）固定。碱性和酸性磷酸酶的活性也保持较好。,（一）石蜡切片法： 石蜡切片就是组织经固定、脱水后包埋在石蜡内，再切成组织切片可用来显示蛋白质、氨基酸、核酸和多糖等。 1. 脱水：乙醇取代组织内的水分，从50%低浓度乙醇开始。,2. 透明：二甲苯取代组织内的乙醇 3. 浸蜡与包埋：石蜡取代组织内的 二甲苯（软蜡：4550 ；硬蜡：5560） 4. 切片：4 10m 5. 展片与粘片：将切下的组织蜡片放 入盛有40 左右温水的水槽中，切片漂浮于水面并因受热而展开。蜡片即粘于载玻片上，置入37 烤箱内烤干以备反应显色。,（二）与冰冻有关的切片法 石蜡切片过程较复杂且浸蜡过程中的温度较高，易引起组织细胞内酶活性降低以及丧失和其它被检成分丢失。使组织化学反应性降低。为了克服这个缺点，获得理想的反应结果，通常采用与冰冻有关的制片技术，包括冰冻切片法、冰冻干燥法和冰冻替代法,1、冰冻切片法： 恒冷箱切片，一般可切出350m厚的切片。大部分组织在 -15 -20度条件下切片最易成功。组织块温度过低，切片易碎。组织块温度或防卷夹温度高，切片会因组织潮湿致粘附在切片刀上。,1. 2、冰冻替代法： 即组织经骤冷后立即置于低温（ （-40-70度）液体脱水剂。如丙酮中，使组织中的水被脱水剂替代，从而既起到组织脱水作用。可起到组织固定作用。组织替代脱水后逐渐恢复到室温，再进行石蜡包埋。 此法多用于水解酶。氧化酶和脱氧酶等的组织化学研究。,第三节 常用的组织化学定量术,组织化学是以反应产物做定位和定性研究，以往常用“”号表示，一般分为+ + + + + 五个等级，这种方法没有明确的客观指标，误差较大，特别是对于差别小的样品更无法准确判断。,随着生命科学研究的不断深入，定量技术的应用日益广泛，并取得了很大的进展。目前常用以下方法对组织和细胞形态结构及化学成分进行定量研究，以阐明组织和细胞的生长、发育、分化、代谢和功能的变化以及对各种因素的反应。,.显微分光光度定量术,是应用显微分光光度计对组织和细胞内化学成分进行定量分析的技术。 基本原理是细胞内某种物质的含量不同，其染色反应的深浅不一，对一定波长的光吸收也不同，可通过测定其光密度值(OD值)进行定量分析比较 。,2.图像分析仪,组织化学和免疫组织化学染色、荧光素染色、放射自显影以及原位杂交等标本均可应用图像分析仪测定其光密度值进行定量分析。这些数值以“量”的概念阐述了结构与功能的关系及病理状态下的变化。,第四节 若干组织化学染色原理,组织学切片所需的组织，除一部分可取自人体外（如外科手术活检组织或尸检的新鲜材料），大部均取自动物。,一、脂类显示,脂类物质包括脂肪与类脂。标本可用甲醛固定、冷冻切片、用油红、苏丹、苏丹、苏丹黑B、尼罗蓝等脂溶性染料染色；亦可用饿酸固定兼染色，脂类呈黑色。,二、核酸显示法,显示DNA的传统方法为Feulgen反应。切片先经稀盐酸处理后， 使细胞内DNA水解，打开DNA分子中脱氧核糖核酸和嘌呤碱之间的连接按键，使其释放出醛基，再用Schiff试剂处理，形成紫红色反应产物。 如用甲基绿-派若宁反应，可同时显示细胞内的DNA和RNA甲基绿与细胞核中的DNA结合呈蓝绿色，派若宁与核仁及胞质内的RNA结合呈红色。,三、 酶类显示,细胞内含有多种酶,每一种酶可催化一定的化学反应。酶的显示法是通过显示酶的活性来表明酶的存在，而不是酶的本身。将具有酶活性的组织放入含有一定底物的溶液中孵育，底物经酶的作用形成初级反应产物，它再与某种捕捉剂相反应,形成显微镜下可视性沉淀,即最终反应产物。,如欲显示细胞内酸性磷酸酶,先将切片放入含有酶底物(常用-甘油磷酸钠)的溶液（PH5.0) 中孵育，底物经酶的作用，水解并释放出磷酸；用捕捉剂硝酸铅与磷酸反应，形成微细的磷酸铅沉淀，此时，可在电镜下检出；如再用硫化铵处理时，磷酸铅被置换成硫化铅沉淀，可在光镜下见到。,第五节显示多糖的高碘酸Schiff(PAS)反应 1、反应原理： 高碘酸是一种强氧化剂，通过高碘酸 的氧化作用，打开糖分子结构内乙二醇 中的碳-碳（CC）键形成醛基：,H OH H O,OH H 高碘酸 O H,C - C - - C C -,形成的醛基与Schiff试剂中无色的亚硫酸品红起反应，生成紫红色化合物沉淀，有此沉淀物的部位即表示有多糖的存在。 高碘酸 Schiff 多糖 形成醛基 生成紫红色沉淀 氧化 无色,（1）Schiff试剂的配制 改良法 1）配方: 碱性品红 1g 偏重亚硫酸钠(Na2S2O5) 2g 浓盐酸 2ml 蒸馏水 200ml 活性碳 0.3g,2) 2） 配法: 将颗粒状的碱性品红研磨成细粉状以便溶解 将蒸馏水煮沸，移开酒精灯冷至700C时将碱 性品红加入，充分摇动，再让其冷至室温； 加入浓盐酸，充分混匀； 加入偏重亚硫酸钠，摇动至充分混匀，避光 静置24h; 加入活性碳，摇动2min,过滤应如水般清亮 ，无色或微黄色。此滤液即为Schiff试剂， 且可立即使用。,注：Schiff试剂若暂时储存应将其置于棕色瓶 内，并将瓶盛满，不留或少留空间，且 用玻璃塞塞紧，以防SO2 跑掉。置冰箱 内保存备用。,（2）Graumaun标准法 1）配方： 碱性品红或对品红 0.5g 1N盐酸 15ml 偏重亚硫酸钠 0.5g 蒸馏水 85ml 活性碳 0.3g,2 )配法: 将碱性品红或对品红溶于1N盐酸中; 将偏重亚硫酸钠溶于蒸馏水中; 将液立即加到液中去,充分混匀,但不 要摇荡,入紧塞的棕色玻