基因构建的一些知识.ppt

酶切、连接与质粒构建,何彰华 赢润生物技术,WWW.YRBIO.COM,2011年7月23日,,连接酶 作用模式 连接产物 连接体系 产物的转化,质粒载体 重组质粒构建策略,酶切,连接,质粒构建,2011年7月,本节讨论内容,内切酶的简介 内切酶的选择 常用酶切体系 酶切的应用 常见问题,,第一部分：限制性内切酶及酶切,1.1 限制性内切酶的简介 1.2 限制性内切酶的选择 1.3 常用酶切体系 1.4 酶切的应用 1.5 酶切常见问题及对策,2011年7月,,1.1 限制性内切酶的简介,来源：原核生物。 限制性内切酶是DNA操作过程中所使用的基本工具。限制酶特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列之内或其附近的特异位点上，并在此切割双链DNA。分子克隆中常用的为II类限制酶，其识别位点长度为4、5或6个核苷酸的反向重复序列。,2011年7月,,限制性内切酶可分为三类,2011年7月,,1）用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄主菌的物种名称，如E. coli 用Eco表示，所以用斜体字。 EcoRI， EcoRV。 2）用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌(Heamophilus influenzae)Rd菌株用d，即Hind。 3）如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制酶，则以罗马数字表示，如Hind, Hind，Hind等。,限制性核酸内切酶的命名,2011年7月,,（1）粘性末端： 如EcoRI的识别顺序为： 5 GAATTC 3 3 CTTAAG 5 在双链上交错切割的位置切割后生成： 5G AATTC3 3CTTAA G5,切割后产生的末端,2011年7月,,例如EcoRV 的识别位置是： 5 GATATC 3 3 CTATAG 5 切割后形成 5 GAT ATC 3 3 CTA TAG 5,（2）平头末端：,2011年7月,,回文序列与非回文序列,DraIII的识别顺序,5 CACNNNGTG 3 3 GTGNNNCAC 5,5 GAATTC 3 3 CTTAAG 5,5 GATATC 3 3 CTATAG 5,EcoRI,EcoRV,2011年7月,,酶切位点的查询,2011年7月,Vector NTI,,酶切位点的查询,2011年7月,,同裂酶,来源于不同物种但能识别相同DNA序列的限制性内切酶，切割位点可以相同也可以不同。 同序同切酶 同序异切酶,5 CCCGGG 3 3 GGGCCC 5,SmaI和XmaI,5 CCCGGG 3 3 GGGCCC 5,SmaI,XmaI,2011年7月,,同尾酶,识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能酶切产生相同的黏性末端。,XbaI与SpeI; XhoI与SalI; BamHI与BglII,5 TCTAGA 3 3 AGATCT 5,5 ACTAGT3 3 TGATCA 5,5 TCTAGT3 3 AGATCA 5,XbaI,SpeI,XbaISpeI,2011年7月,,1.2 限制性内切酶的选择,根据实验的目的 结合载体和基因的特性选择合适的酶切位点； 根据酶本身的属性 酶的酶切效率； 双酶切共用缓冲液； 选择何种公司的产品：Fermentas、TaKaRa、NEB。,2011年7月,,1.3 常用酶切体系-单酶切,2011年7月,必要的时候添加BSA；温度 37 ；反应时间 1-2 h。,,1.3 常用酶切体系-双酶切,必要的时候添加BSA；温度 37 ；反应时间 1-2 h。,,双酶切buffer,,1.4 酶切的应用,构建质粒 鉴定 图谱,2011年7月,,1.5 酶切常见问题及对策,1）DNA完全没有被内切酶切割,2011年7月,A. 内切酶失活； B. DNA不纯，含有SDS，酚，EDTA等内切酶 抑制因子； C. 条件不适（试剂、温度）。 D. ?,, 如果DNA底物是从表达 Dam 或 Dcm 甲基化酶 的菌株中分离而得； 且其甲基化识别位点与内切酶识别位点有重叠。 例如，从 dam+ E.coli 中分离的质粒 DNA 完全不能被识别序列为 GATC 的 MboI 所切割。,2011年7月,Dam、Dcm和CpG甲基化,,2）DNA切割不完全,A. 内切酶活性下降； B. 内切酶稀释不正确； C. DNA不纯，反应条件不佳； D. 内切酶识别的DNA位点上的碱基被甲基化或存 在其它修饰； E. 由于反应溶液、温度、强烈振荡使内切酶变性。,2011年7月,,3）DNA片段数目多于理论值,A. 其它内切酶污染； B. 底物中含其它DNA杂质； C. 内切酶星号活性。,2011年7月,,星号活性,在非理想的条件下，内切酶切割与识别位点相似但不完全相同的序列，这一现象称星号活性。,2011年7月,内切酶的用量过大； 甘油浓度大于12%； 盐离子浓度过低或过高； Mn2+ 的存在。,,第二部分：DNA的连接反应,2.1 连接酶 2.2 连接酶作用模式图 2.3 连接产物的形态 2.4 常用连接体系 2.5 连接产物的转化,2011年7月,,2.1 连接酶,原理：催化两条双链DNA分子的互补粘性末端或平末端的5磷酸基团与3羟基形成磷酸酯键。 功能：将两条双链DNA片段连接起来，实现 DNA的体外重组。 注意：DNA连接酶催化平末端连接要比粘性末端 效率低得多。,2011年7月,,（1） 连接粘性末端,2.2 连接酶作用模式图,连接酶,2011年7月,,（2） 连接平末端,连接酶,2011年7月,2.2 连接酶作用模式图,,2.3 连接产物的形态,载体,基因,酶A,酶B,酶A,酶B,2011年7月,,2.3 连接产物的形态,载体,基因,酶A,酶B,酶A,酶B,2011年7月,无意义的连接，干扰正常连接。,,2.4 常用连接体系,连接体系中载体与插入片段的摩尔比控制在1/3至1/10之间，体系在循环水浴中16连接。,2011年7月,,2.5 连接产物的转化,连接好的DNA产物可直接转化感受态细胞，用抗性平板筛选阳性克隆。,2011年7月,,第三部分：质粒构建,目的基因进入原核或真核细胞并高效复制和表达蛋白质，需要装入表达载体才能实现。 作为基因工程表达载体所需具备的基本条件： A. 含复制起始，能自我复制； B. 带有抗性基因，便于筛选和鉴定； C. 有多克隆位点，便于重组操作； D. 带有强启动子。,2011年7月,,多克隆位点,抗性标记,T7 启动子,pET-28a：原核细胞表达质粒,2011年7月,复制起始,,,pcDNA3.1：真核细胞表达质粒,2011年7月,,3.1 重组质粒构建-粘性末端连接,2011年7月,,2011年7月,3.2 重组质粒构建-平末端连接,,2011年7月,3.3 重组质粒构建-分步连接,,2011年7月,3.4 重组质粒构建-连接、酶切、再连接,,2011年7月,3.5 重组质粒构建-接头连接,,2011年7月,3.6 重组质粒构建-同尾酶连接,w