Production of the Promoter of Le(Length gene) in Garden Pea---（豌豆Le启动子的功能研究）.docx

豌豆Le启动子的功能研究Production of the Promoter of Le(Length gene) in Garden Pea摘要 用PCR的方法从豌豆总DNA中克隆了Le基因（length gene）的启动子，命名为Le启动子。Northern 杂交的结果证明，Le基因主要在豌豆的根、茎中表达，在花和叶中的表达量很少，而果实中几乎没有表达。根据Le基因伸长组织特异的表达图式，推测Le基因的启动子为伸长组织特异的启动子。GFP基因作为报告基因，由Le启动子调控，在转基因烟草中表达。对转基因烟草叶片的荧光显微镜观察结果，以及用GFP基因作为探针，转基因烟草的Northern杂交的结果，证实了Le启动子的组织特异性。利用Le启动子，可以实现目的基因的组织特异表达，在理论研究和生产实践上都有重要的应用价值。Abstract Stem length is one of the seven traits of garden pea from which Gregor Mendel established the laws of inheritance. The length gene (Le) encodes 3-hydroxylase, which controls the GA1 biosynthesis from GA20 in pea. GA1 is the major gibberellin (GA) controlling stem elongation in pea (Pisum sativum L.). The Northern Blotting analysis showed the tissue-specific expression of Le gene in roots and shoots, using the coding sequence of Le gene as a probe. Based on the result, the promoter of Le gene shoLd have tissue-specificity. Using PCR (Polymerase Chain Reaction), we cloned the promoter of Le gene (Le promoter) from the genomic DNA of G2 pea. Under the control of the Le promoter, the GFP gene was expressed in tobacco. Using the GFP gene as a probe, the Northern Blotting analysis of transgenic tobacco showed that the GFP gene expressed specifically in roots and shoots, especially in younger roots and shoots. The result identified the Le promoter is an elongating-tissue-specific promoter. Using the promoter, we can realize the elongating-tissue-specific expression of the foreign genes.关键词Le基因，Le启动子，GFP基因, 伸长组织特异前言Le 基因孟德尔在建立遗传法则的过程中研究了豌豆的七个表型性状（种子的形状，种子和花的颜色，子叶的颜色，豆荚的形状，豆荚的颜色，花的位置，茎的高矮），茎的高矮（stem length）是其中之一。1917年，White发现茎的高矮决定于一种高度因子是否存在，并引入基因符号Le（Length）。隐性等位基因le的纯合体植株，与野生型Le的纯合体植株相比，茎节间距较短，植株矮小，高度只有Le植株的1/4 -1/5。Brain和Hemming第一次将豌豆茎的高矮和赤霉素的作用（GA，gibberellins）联系在一起，给豌豆芽施加GA3，可刺激原本矮小的豌豆茎干伸长。Brain认为高茎豌豆中通常会产生与赤霉素相似的内源物质，并通过实验得以证实。赤霉素作为一种重要的植物激素，在茎干的伸长，种子的萌发和发育过程中，发挥着重要的作用。豌豆中控制茎干伸长的赤霉素主要是GA1，由GA20经过3-羟化酶的羟化作用形成。1984年Ingram等人通过放射性标记的方法，发现GA20向GA1的转化作用在le（矮干）植株内比在Le（高干）植株内大大降低了；同时发现，le植株内GA20的含量很高，而Le植株内GA1的含量很高；由此认为，Le基因编码了赤霉素3-羟化酶（3-hydroxylase）。1997年David等克隆了赤霉素3-羟化酶基因的cDNA，同年，Diane等人通过筛选豌豆的亚基因组文库，得到了Le基因及其两侧的序列。David等人对Le基因的研究证明它的表达具有组织特异性，在正在萌发的豌豆中，Le基因在根、茎和子叶中特异表达；在萌发后的豌豆中，Le基因在幼根、幼茎和节间中特异表达。根据Le基因组织特异的表达模式，可以推断它的启动子是一个伸长组织特异的启动子。植物基因启动子启动子是基因5末端与RNA聚合酶及一些反式作用因子结合的区域。一般情况下，基本启动子含有转录起始位点和TATA-box结构。转录起始点一般为A, TATA-box的序列为TATAA/TAA/T，位于转录起始位点-25-30bp之间。RNA聚合酶II和启动子结合后开始转录。由于启动子中的顺式作用元件在基因的特异表达中发挥着重要的作用，可使目的基因在不同的生长发育阶段或特定的环境条件下得到表达。因此，可通过连入特异启动子，获得基因表达的时空特异性。特异启动子的类型主要有：环境相应启动子，如：光响应启动子、温度响应启动子等；激素响应启动子，如：GA响应启动子、ABA响应启动子等；组织特异启动子，如：种子特异性表达启动子、维管束特异表达启动子等。研究植物启动子常用的报告基因有GUS（-glucuronidase），CAT（chloramphenical acetyl transferase），LUC（luciferase）和GFP（green fluorescent protein）。用于启动子-报告基因表达特异性检测的系统有原生质体转化检测，基因枪轰击后的瞬时表达检测和转基因植物的稳定表达检测。 烟草和水稻是常用的模式植物，分别代表双子叶和单子叶植物。通常启动子的分离和分析在不同的植物中进行，因此分析发现的结果可能不能完全代表它在原植物中的特性，但在双子叶或是单子叶植物中间，启动子的组织特异性无明显变化。本实验采用GFP作为报告基因，通过转基因烟草，验证了Le 启动子的伸长组织特异性。GFP报告基因绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）最早是由Shimomura等（1962年）在海洋生物水母（Aequorea victoria）中发现的（Chalfie etal，1994）。GFP蛋白的多肽链中含有特殊的生色团结构，可在紫外光源下发出稳定的绿色荧光。GFP的这种荧光发射无需外加辅助因子或进行任何特殊处理，作为报告基因和分子探针有很大的优越性，所以目前被广泛地用于生化和细胞生物学的各个领域。GFP基因表达产物只需长波紫外和蓝光激发即可显示荧光，对它的检测不会影响对细胞生长和功能的检测，所以可以方便地进行活体和生长状态的观察。转化的受体组织细胞和整个个体都可以用手持紫外灯观察，对亚细胞水平的观察利用普通的荧光显微镜即可。材料和方法实验材料1. 植物材料G2豌豆（Pisum sativum L）：由PJ Davies教授（Cornell University）赠种，实验室培育。2. 菌株和质粒大肠杆菌（Escherichia coli）DH5，农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101：实验室保存。植物表达中间载体pCAMBIA 3300：澳大利亚国际农业分子生物学应用中心惠赠（Center for the Application of MolecLar Biology to International AgricLture）。中间载体pAVA120：由PJ Davies教授惠赠。3. 酶和试剂盒植物总RNA提取试剂盒（RNeasy Plant Mini Kit），植物核DNA提取试剂盒（DNeasy Plant Mini Kit）：QIAGEN公司产品。pGEM-T Easy Vector Systems：Promega 公司产品。质粒DNA提取试剂盒（Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System）：Promega 公司产品。DNA回收试剂盒（QIAquick Gel Extraction Kit）：QIAGEN公司产品。核酸限制性内切酶，T4 DNA连接酶，DNA Polymerase I Large (Klenow) Fragment：Promega公司产品。Taq DNA Polymerase：鼎国，华美公司产品随机引物DNA标记试剂盒（Random Primer DNA Labeling Kit）：Takaba公司产品。4. Northern Blotting 试剂Loading Dye （20mL）：80mg Bromophenol Blue（0.4%），80mg Xyiene Cyanole（0.4%），40L 0.5M EDTA（1mM），10mL Glyceol（50%），10mL H2O。10MSE（1升，pH7.0）：41.8g MOPS(free acid)，3.72g Na2EDTA2H2O，6.8g NaAcetate3H2O，加水定容至1000mL。20SSC（1升，pH7.0）：175.3g NaCl，88.2g NaCitrate，加水定容至1000mL。杂交液：1% BSA，1mM EDTA，0.5M NaPhosphate(pH7.2)，7% SDS。Washing medium 1：1% BSA，1mM EDTA，40mM NaPhosphate(pH7.2)，5% SDS。Washing medium 2：1mM EDTA，40mM NaPhosphate(pH7.2)，1% SDS。5. 烟草转化试剂1/2 MS 培养液 (1000ml，pH5.8)：2.2g MS，15g sucrose，加水定容至1000mL。MS 固体培养基 (1000ml，pH5.8)：4.4g MS，30g sucrose，8g Agar，加水定容至1000mL。T1培养基（pH5.6-5.8）：MS 固体培养基，1mg/L 6-BA，0.1mg/L NAA。T2培养基：T1培养基，500mg/L Carb。T3培养基：T1培养基，10mg/mL PPT。T4培养基：MS培养基，10mg/mL PPT。6-BA母液（1mg/mL）：1mol/mL HCl 溶解，用水定容。NAA母液（1mg/mL）：95% 乙醇溶解，用水定容。6. PCR引物均由GIBCO BRL公司合成，序列如下：LP（Le Promoter，Le 启动子）合成引物LP1（5 Primer）38bpATGGT ACCGT CGTAA AGAAT GGTTG AAGAT GGTTG ATGLP2（3 Primer）38bpGCTCT AGAGT AAAAG TAGTA GCTAT AGAGA AAATA ATGLGP（Le Gene Probe，Le基因探针）合成引物LGP1（5 Primer）25bpTAGTG AAAGT GACAT AGCAA ATTTGLGP2（3 Primer）24bpGAATA GTAAT TTTGG CATTA ATTG7. 溶液和培养基各种溶液和培养基配方见分子克隆。实验方法1. 提取G2豌豆总核DNA用植物核DNA提取试剂盒（DNeasy Plant Mini Kit）。称取100mgG2豌豆叶片，用液氮将其研磨成粉末后，迅速转入1.5mL离心管，使液氮挥发。加入400L Buffer AP1和4L RNase A stock solution（100mg/mL），剧烈振荡至看不到明显的组织块。65水浴10min，间或颠倒混合2-3次。加入130L Buffer AP2，混合，冰浴5min。将悬液（连同生成的沉淀）上柱（QIAshredder spin column），最大转速离心2min。将清液移入1.5mL离心管，加入0.5倍体积的Buffer AP3，1倍体积的无水乙醇，混匀。转移650L混合液上柱（DNeasy mini spin column），10，000rpm离心1min，弃下清。加入500L Buffer AW，10，000rpm离心1min，弃下清。加入500L Buffer AW，最大转速离心2min。把柱子转到1.5mL离心管上，加入100L65预热的Buffer AE洗脱，室温下放置5min，10，000rpm离心1min。2. 准备Le 基因的探针1) PCR扩增Le基因片断根据Le 基因的全序列设计引物，序列见实验材料部分。以提取的G2豌豆的核DNA为模板，PCR克隆Le基因部分编码序列，作为Northern Blotting分析的探针。50L PCR反应混合液，37L ddH2O，1L dNTP，5L 10Buffer（含MgCl2），1L LGP1，1L LGP2，4L G2核DNA，1L Taq DNA polymerase。PCR反应条件，94预变性5min；94变性45s，55退火1.5min，72延伸1min，循环30次；72再延伸10min。2) PCR产物回收8%琼脂糖凝胶电泳PCR产物，用DNA回收试剂盒（QIAquick Gel Extraction Kit），回收600bp的DNA片断。在紫外灯下切下含有DNA片断的胶块，称重（每100mg重量对应于100L体积）。加入3倍体积的Buffer AW，65水浴10min，间或颠倒混匀。加入1倍体积的异丙醇，混匀后吸取800L上柱。13，000rpm离心1min，倒去滤液。加入750L Buffer AP，13，000rpm离心1min，倒去滤液，13，000rpm再离心1min。将柱子转至1.5mL离心管上，加入30L Buffer EB，室温放置1min后，最大转速离心1min。3) 连入T vector用pGEM-T Easy Vector Systems将回收的PCR产物和T vector相连。短暂离心pGEM-T Easy Vector，使用0.5mL离心管，制备10L连接反应混合液，5L 2Rapid Ligation Buffer，1L pGEM-T Easy Vector，3L PCR产物，1L T4 DNA Ligase。4连接过夜（18小时）。4) 转化制备DH5感受态。100L DH5感受态加入10L连接产物，冰上放置30min，42热激2min，冰上放置5min。加入800L LB液体培养基，37保温30min。12,000rpm离心1min，倒去大部分上清，用剩余的100L左右的LB液体培养基悬浮细菌沉淀，涂板（涂有40L X-Gal和4L IPTG）。转化产物在LB固体培养基（含有氨苄青霉素）上，37培养14小时。5) 提质粒，酶切鉴定挑取单个菌落，接种于3mL LB液体培养基(含氨苄青霉素)，37振荡培养16小时。提取质粒，酶切鉴定后得到阳性克隆。6) 酶切得到Le基因片断用EcoRI酶切质粒，反应混合液，2L 10酶切缓冲液，2L BSA，1L EcoRI，6L质粒DNA，9L ddH2O。37酶切6小时，电泳回收酶切片断，即为Le基因探针DNA。3. Le 基因的Northern Blotting 分析1) 提取植物各组织总RNA用植物总RNA提取试剂盒（RNeasy Plant Mini Kit）提取豌豆各组织的RNA。称取G2豌豆的叶片，茎，根，花，果实各100mg，分别用液氮研磨成粉末后，迅速转入1.5mL离心管，使液氮挥发。加入450L Buffer RLT，剧烈振荡。56水浴1-3min。裂解液上柱QIAshredder spin column，最大转速离心2min，转移清液至1.5mL离心管。加入0.5倍体积（约225L）无水乙醇，枪头混匀。将675L样品（包括生成的沉淀）上柱RNeasy mini spin column，10，000rpm离心15s，弃下清。加入700L Buffer RW1，10，000rpm离心15s洗涤，弃下清（连同收集管）。把柱子转移到新的收集管上，加入500L Buffer RPE，10，000rpm离心15s，弃下清。加入500L Buffer RPE，最大转速离心2min，弃下清（连同收集管）。把柱子转到1.5mL离心管上，加入30L RNase-free的水，10，000rpm离心1min，重复5次，每种样品各得到150LRNA溶液。取出15L，稀释50倍，测定光吸收。其余样品加入3倍体积无水乙醇，-70保存。2) 电泳准备用去污剂、自来水和蒸馏水顺序洗涤电泳槽、梳子和胶板，无水乙醇干燥后，用3%H2O2浸泡，然后用RNase free的水清洗。称取1.2g琼脂糖加入100mL1MSE，熔化后水浴冷却至65。加入1L EB，1.8mL甲醛，混匀后倒胶（厚度不超过4mm），凝胶40min。3) RNA样品准备保存的RNA样品，加入1倍体积的0.3M NaAC，-20沉淀30min。4 12，000rpm离心15min，加入750L 70%乙醇洗涤，4 12，000rpm离心5min，冷冻干燥后，溶解于5L RNase free的水中。每种样品取相应体积（保证总RNA量相同），加入2L 10MSE，3.5L甲醛，10L甲酰胺，65水浴15min，加入2L Loading Dye。4) 电泳加样电泳3小时左右，电泳距离6-8cm。电泳缓冲液为1MSE，电泳中间，每隔0.5小时将正负两极缓冲液混合一次。电泳后将胶浸入ddH2O中，紫外灯下检查RNA的完整性。5) 转膜根据胶的大小，剪出相应大小的NC膜，把膜浸入ddH2O中5min，取出浸入20SSC中5min。同时，把“stack tray”放在桌面上，调水平；放上20张干燥的GB004滤纸，其上放置4张干燥的GB002滤纸，其上放置1张在20SSC中润湿的GB002滤纸，在润湿的GB002滤纸上平铺润湿的NC膜，在它的上面平铺电泳胶（GB002滤纸，NC膜和电泳胶之间不要有气泡）。在胶的上面加上20SSC，放上3张润湿的GB002滤纸；放上“buffer tray”，槽内加入125mL 20SSC，放上“buffer wick”，转膜2小时。在2SSC中洗膜5min，把膜放在滤纸上，吸去残余的溶液。紫外交联仪中自动交联。滤纸包膜，外加锡箔纸，80烘烤2小时，4保存。6) 预杂交，标记探针用2mL注射器，装G50的柱子。用RNase-free的水洗杂交瓶，用杂交液润洗杂交瓶3次，放入膜，加入100mL杂交液，预杂交0.5小时。同时，准备用标记反应液，2L Le基因探针DNA（200ng），2L Random Primer,10L TE Buffer；95水浴3min后迅速置于冰中冷却，放置5min；加入2.5L 10Buffer，2.5L dNTP Mixture，5L 用于标记的dCTP（50uCi），加水定容至24L，加入1L Exo-free Klenow Fragment；37反应15min。加入3L溴芬兰，混匀，上柱（G50），加入800L TE洗脱，收集溴芬兰前的溶液，95加热3min后迅速置于冰中冷却，立即用于杂交。7) 杂交在杂交瓶中加入25mL 65预热的杂交液，加入探针后混匀，65杂交16-24小时。8) 洗膜65预热洗液，用Washing medium 1洗2次，每次5min；用Washing medium 2洗3-5次，每次5min，用计数器监测膜的放射性强度变化，决定洗膜的次数。9) 压片洗膜后室温下将膜自然晾干（30-60min），包上一层保鲜膜，和x光片一起放入压片夹中，-70压片16-72小时。洗片前将压片夹于室温晾干1-2小时后，暗室洗片。4. Le 启动子的克隆1) PCR克隆Le启动子根据Le基因及其上游序列设计引物LP1、LP2，见实验材料部分。PCR克隆Le基因上游1.1kb的DNA片断，分析表明含有Le基因的启动子。50L PCR反应混合液，34L ddH2O，1L dNTP，5L 10Buffer，3L MgCl2溶液，1L LP1，1L LP2，4L G2核DNA，1L Taq DNA polymerase。 PCR反应条件，94预变性5min；94变性45s，60退火1.5min，72延伸1min，循环30次；72再延伸10min。2) 连接，回收，转化用pGEM-T Easy Vector Systems将回收的PCR产物和T vector相连，连接产物转化DH5，转化产物涂板，蓝白斑筛选和抗性筛选得到阳性斑，提取质粒，酶切鉴定得到阳性克隆，质粒命名为pGEM-LP。六合通公司测序鉴定。5. 植物表达中间载体的构建1) 酶切，回收用XbaI，EcoRI限制性内切酶双切pGEM-LP载体，EcoRI端补平。首先用0.5L EcoRI酶切质粒，65加热终止反应；冷却后加入1L Klenow酶，1L dNTP，室温下放置30min，65加热终止反应；冷却后加入0.5L XbaI酶切质粒。电泳回收1.1kb酶切片断。使用XbaI，SmaI限制性内切酶双切pCAMBIA3300质粒，电泳回收酶切后的质粒片段。2) 连接将Le启动子的酶切回收产物和pCAMBIA3300质粒酶切回收产物混合，加样如下：1L 10连接缓冲液，1L T4连接酶，4L Le启动子回收产物，4L pCAMBIA3300，16连接过夜。3) 转化，鉴定制备DH5感受态。转化连接产物，涂板。转化产物在LB固体培养基（含卡那霉素）上，37培养14小时。挑取单个菌落，接种于3mL LB液体培养基（含卡那霉素），37振荡培养16小时。提取质粒，酶切鉴定后得到阳性克隆，新合成的载体命名为pLP。4) 构建中间载体pLP-GFP用EcoRI，PstI限制性内切酶双切pAVA120载体，EcoRI端补平。电泳回收1kb的酶切片断。使用XbaI，PstI限制性内切酶双切pLP质粒，电泳回收酶切后的质粒片段。连接，转化，培养，酶切鉴定后得到阳性克隆，新的中间载体命名为pLP-GFP。6. 冻融法转化农杆菌1) 制备农杆菌感受态28，在LB液体培养基（含有庆大霉素）中振荡培养农杆菌（GV3101）24小时。1：100转接，28振荡培养6-7小时，至OD600为0.6。制备感受态。取1.5mL菌液，13，000rpm离心30s，弃上清。用800L 250mMCaCl2重悬菌体沉淀，13，000rpm离心30s，弃上清。用100L 250mM CaCl2重悬沉淀，冰上放置4小时。2) 冻融法转化农杆菌。在100L农杆菌感受态中加入6L pLP-GFP质粒，冰上放置30min，浸入液氮中5min，37水浴5min。加入4-6倍体积的LB液体培养基， 28温育3-5小时后，涂板，在LB固体培养基（含卡那霉素和庆大霉素）上，28培养24小时。3) 鉴定阳性克隆挑取单个菌落，接种于3mLLB液体培养基（含卡那霉素和庆大霉素），28振荡培养24小时。提取质粒，酶切鉴定后得到阳性克隆。7. 转基因烟草的获得1) 制备农杆菌悬液将转化的农杆菌接种于LB液体培养基（含庆大霉素和卡那霉素）中，28振荡培养24-36小时，取5ml菌液4，000g离心10min，用1/2MS培养液洗涤菌体，再离心，菌体悬浮于20-40ml 1/2MS液体中（OD600=0.5）。2) 叶盘法转化烟草取培养好的无菌烟草小苗的叶片，剪成1cm2左右的小块，放入准备好的农杆菌悬液中，浸泡3-5min。取出叶块，用灭菌滤纸吸干多余的菌液，放在铺有一层无菌滤纸的T1培养基上，在28暗培养48小时后，将叶块转入T2培养基中，25-28光下培养24 小时。将叶块转入T3培养基中，25-28光下培养，约15天后叶块切口处有愈伤生成，25-28继续培养，每10天左右换一次新鲜培养基，愈伤逐渐分化形成芽点，2-3月后，芽长成3-5cm高的小苗。切下较大的植株，转入T4培养基中，10天左右开始有根生成，待根系发达时，将苗转入灭菌土中，置温室培养。8. PCR鉴定提取转基因烟草和野生型烟草的总DNA为模板，以Le启动子的引物LP1，LP2为引物，进行PCR分析。50L PCR反应混合液，34L ddH2O，1L dNTP，5L 10Buffer，3L MgCl2溶液，1L LP1，1L LP2，4L 烟草核DNA，1L Taq DNA polymerase。PCR反应条件，94预变性5min；94变性45s，60退火1.5min，72延伸1min，循环30次；72再延伸10min。同时，以pLP质粒为模板，以Le启动子的引物LP1，LP2为引物，PCR作为对照。50L PCR反应混合液，37.5L ddH2O，1L dNTP，5L 10Buffer，3L MgCl2溶液，1L LP1，1L LP2，0.5L 质粒DNA，1L Taq DNA polymerase。反应条件同上。PCR产物电泳分析，结果见图5 f9. 转基因烟草的Northern Blotting分析1) 制备探针用XbaI，NcoI限制性内切酶双切pAVA120载体，电泳回收1kb左右的GFP基因酶切片断，用随机引物DNA标记试剂盒（Random Primer DNA Labeling Kit）标记后用作探针。2) Northern Blotting用植物总RNA提取试剂盒（RNeasy Plant Mini Kit）分别从转基因烟草的茎（幼茎、老茎），根（幼根、老根），叶和节间中提取各组织的RNA。电泳后转膜，以GFP基因为探针进行杂交，放射自显影后得到杂交结果，见图10. 用荧光显微镜观察转基因烟草的叶片取转基因烟草无菌苗的顶端叶片，取叶尖、叶缘部分，切成小片；在载玻片上滴50%的甘油一滴，将叶片展放于载片中间，放上盖玻片（尽量避免气泡）。立即置于20倍荧光显微镜下观察，照相。结果与讨论Le 基因的Northern Blotting 结果分析Northern Blotting 结果显示，在光照条件下生长的豌豆中，Le基因转录产物在根和茎中大量存在，在叶中只有少量的存在，在花和幼嫩的种子中不存在；在暗中培养的黄化豌豆中，Le基因转录产物在根和茎中的含量特别丰富。（见附图3 b）根和茎是植物主要的伸长组织，二者均通过细胞的伸长进行生长；而叶，花和种子则主要是通过细胞数量的增加进行生长，细胞基本不伸长；暗中培养的黄化苗，表型上存在十分明显的伸长现象，根、茎细而长。Northern Blotting 的结果证实了Le基因伸长组织特异的表达模式，根据启动子对基因表达的调控作用可以推测Le基因的启动子也具有伸长组织的特异性。Le启动子的克隆Le基因翻译起始位点ATG上游80bp处，含有TATA-box，（），对照Le基因的cDNA序列和核DNA及其上游序列，可知TATA-box位于转录起始位点上游-34bp处，含有TATA-box的上游序列为Le基因的启动子。设计引物LP1、LP2，克隆Le基因上游1.1kb的序列，并在DNA序列的5端和3端分别添加KpnI和XbaI酶切位点。六合通公司测序鉴定，测序结果和已知序列比较，核苷酸序列相同，认为得到了Le基因的启动子，命名为Le Promoter。Le启动子的序列及测序结果见附图2，7。植物表达中间载体的构建构建流程图见附图1。pCAMBIA3300植物表达载体，具有除草剂（phosphinothricin，简称PPT）和卡那霉素（kanamycin）两个不同的抗性基因，分别用于真核、原核生物内的筛选。在多克隆位点连入Le启动子，通过酶切和PCR进行鉴定（见附图4 b,c），结果证实，成功构建了新的植物表达载体pLP。pLP带有伸长组织特异启动子，可实现目的基因在伸长组织中的特异表达。来自中间载体pAVA120的GFP报告基因，已经改造并在基因的5端连有转录增强子（TL），可在植物细胞中高效率的表达。将其连入载体pLP，获得新的植物表达载体pLP-GFP，酶切鉴定结果见附图4 d。利用载体pLP-GFP可以获得转基因植物，利用GFP报告基因进行Le启动子的表达特异性检测。转基因烟草的获得通过叶盘法转化获得转基因的烟草。烟草转化结果见附图5 a-e。以LP1，LP2为引物，对转基因烟草进行PCR检测，电泳结果（见附图5 f）显示，pLP质粒和转基因烟草PCR产物为1.1kb的条带，与Le启动子大小一致；野生型烟草的PCR产物没有特异的条带，该结果证实已获得含有Le启动子的转基因烟草。对Le启动子转化拷贝数的检测需进一步的Southern Blotting结果（实验正在进行）。表达特异性检测Northern Blotting 结果（见附图6 e）显示，转基因烟草中，GFP基因转录产物在根和茎中含量丰富，在叶中只有少量的存在；GFP基因转录产物，在幼根和幼茎中的含量又明显高于老根和老茎。在荧光显微镜下观察转基因烟草的叶片，叶毛中可观察到明显的绿色荧光，但在叶片细胞中看不到明显的绿色荧光；同样的，在荧光显微镜下观察野生型烟草的叶片，叶毛和叶片细胞中都不能观察到绿色荧光。结果见附图6 a-d。叶片的生长主要通过细胞数量的增加实现，细胞伸长的现象不明显；而叶毛属于表皮毛，是由表皮细胞的伸长形成的。上述结果证实，Le启动子确实是一个伸长组织特异的启动子。研究意义克隆得到的Le启动子是一个伸长组织特异的启动子，对叶片细胞观察的结果初步证明该启动子具有伸长细胞的特异性。利用Le启动子可以实现外源基因在伸长组织，或是非伸长组织伸长细胞中的特异表达。可广泛用于有关伸长组织或细胞的理论研究中。虫害一直是造成农业减产的重要原因之一，通过基因工程的手段将抗虫基因引入农作物细胞并使其稳定的表达和遗传，从而培育抗虫作物新品种，获得农作物的稳产高产，已成为现代农业发展的方向。一般情况下，抗虫基因的作用是通过表达毒蛋白实现的，所以，在提高作物抗性的同时，必须注意转基因作物的食用安全性。通过特异的启动子，有目的的实现抗虫基因在特定组织中的特异表达，是利用基因工程手段获得抗虫作物最为理想而有效的方式。Le启动子正是具有这样的组织特异性，可以预计它在基因工程的实践中会有重要的用途。图例图1 植物表达中间载体构建流程图 a.pLP中间载体构建；b.pLP-GFP中间载体构建图2 Le启动子的克隆图3 豌豆的Northern Blotting分析 a. Northern Blotting转膜示意图；b.豌豆Northern Blotting结果图4 PCR产物、酶切产物电泳图 a.Le启动子PCR产物；b.酶切鉴定中间载体pLP；c.PCR鉴定中间载体pLP ；d.酶切鉴定中间载体pLP-GFP图5 转基因烟草的获得 a.未转化农杆菌浸染的烟草叶片；b.转化农杆菌浸染的烟草叶片在T3培养基上长出愈伤；c. 转化农杆菌浸染的烟草叶片在T3培养基上长出小苗；d.转化的烟草小苗在T4培养基中生根；e.初步长成的转化烟草；f.转基因烟草的PCR鉴定图6 表达特异性检测 a.野生型烟草叶片在荧光显微镜下观察结果；b.图a的局部放大；c.转基因烟草叶片在荧光显微镜下观察结果；d.图c的局部放大；e.转基因烟草Northern Blotting结果图7 Le启动子PCR产物测序结果致谢首先感谢李政道先生和秦惠女士为我提供这样好的机会，使我可以在本科生期间就参与到学科前沿的实验研究工作中。两年来，在独立承担科研任务的过程中，我的理论水平和实践能力都有了质的飞跃，树立了初步的科研思想，掌握了丰富的实验技能，具备了一定的科研能力。这将为我今后进一步的科学研究工作打下一个良好的基础。师恩难忘，是导师朱玉贤教授的悉心指导，把我一步步带进生命科学的殿堂。他对科研工作火一般的热情和忘我的拚搏精神时刻激励着我前进的脚步，他严谨的治学态度和渊博的生物学知识帮我培养起良好的科研品质。两年来，朱博的关怀和教诲时刻鼓舞着我，帮我战胜实验中的一次次的困难和挫折，让我懂得做人、做学问的道理。参考文献1 David N, et al. Mendels dwarfing gene: cDNAs from the Le alleles and function of the expressed proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997, 94: 890789112 DR Lester, et al. Mendels stem length gene (Le) encodes a gibberellin 3 beta-hydroxylase. Plant Cell. 1997, 9: 1435-14433 Diane R, et al. The influence of the null le-2 mutation on gibberellin levels in developing pea seeds. Plant Growth Regulation. 1999, 27: 83-894 Jacquel