《基因工程制药》PPT课件.ppt

基因工程制药,基因工程药物: 利用基因工程技术生产人体健康所需的、难以用传统方法制取的蛋白质、多肽和基因等药物。 基因工程药物包括: 基因工程治疗药物，基因工程抗体和疫苗，基因治疗药物，基因工程诊断试剂等。,基因工程药物生产的基本过程,获得目的基因目的基因克隆构建重组表达载体构建、筛选基因工程细胞工程细胞培养表达产物的分离、纯化除菌过滤半成品检定成品检定包装。,目的基因的获得,从基因组中获得 从基因组文库中获得 从cDNA文库中获得 PCR扩增法 从化学合成方法中获得,免疫法分离目的基因,mRNA,选择宿主细胞的原则,安全性高、便于导入重组DNA、便于筛选克隆子、重组子能在细胞内稳定维持、不影响外源基因高效表达、具有较好的翻译后加工系统、遗传密码无特别的偏倚性、遗传性稳定，易于扩大培养、有较高的应用价值。,外源基因表达常用的宿主细胞,大肠杆菌表达系统 优点：遗传背景、代谢途径和表达机制清楚；易于遗传学操作；生长迅速；异源蛋白的高效表达;也可以分泌型表达 缺点：潜在致热源；蛋白质不分泌到培养基中；无翻译后修饰系统；异源蛋白而易形成包函体,外源基因表达常用的宿主细胞,枯草芽孢杆菌表达系统 优点：不产生内毒素；良好的分泌型； 天然构象的可能性大。 缺点：外源蛋白表达量较低；细胞内外高水平的蛋白酶。,外源基因表达常用的宿主细胞,酿酒酵母表达系统 优点：简单的真核生物，不产生病毒，内毒素；遗传背景清楚；有翻译后修饰；分泌异源蛋白。 缺点：异源蛋白表达量低；有超糖基化趋势；异源蛋白有时分泌不理想，30Kd不分泌，乙醇积累导致异源蛋白合成不足。,外源基因表达常用的宿主细胞,动物细胞表达系统 CHO、COS、3T3 优点：可分泌异源蛋白；正确的糖基化和翻译后修饰 缺点：异源蛋白表达量低；难以大规模生产；培养基昂贵；培养时间长；培养条件苛刻,重组DNA转化宿主细胞的途径,直接转化法、化合物诱导法、接合转化法、噬菌体转染法、电穿孔转化法、基因枪轰击法、超声转化法、脂质体介导转化法、磷酸钙转化法等。,重组子的鉴定,1. 根据重组子的特征鉴定 DNA分子的大小、酶切图谱、PCR扩 增片断、DNA杂交法、DNA测序 2. 根据转录产物鉴定 Northern、RT-PCR 3. 根据翻译产物鉴定 蛋白电泳、ELISA、Westhern、RIA,异源蛋白在大肠杆菌中的表达形式 包涵体型表达,包涵体形成的机理： 外原基因的表达产率过高。 无真核细胞的亚细胞器结构和稳定因子 宿主细胞的异源蛋白。 所处的环境不利于折叠。 高浓度异原蛋白造成高浓度的微环境。,异源蛋白在大肠杆菌中的表达形式 包涵体型表达,包涵体-生物大分子致密地聚集在细胞內，形成的高密度、不溶性的无膜的颗粒结构。 包涵体的性质-主要是表达的外原蛋白，其高级结构往往是错误的。只有在变性剂中才能溶解。要获得具有生物学活性的蛋白质必须将包涵体溶解，释放出其中的错误折叠蛋白质，将各个次级键打开，在体外进行蛋白质的重折叠。,异源蛋白在大肠杆菌中的表达形式 包涵体型表达的优缺点,优点： 外原基因的表达量极高，对宿主细胞的生长和代谢影响小 抗宿主细胞内蛋白酶降解的能力强 目标蛋白的纯度高，易于分离和纯化 缺点： 必须复性,异源蛋白在大肠杆菌中的表达形式 分泌型表达,分泌型表达的特点： 在N端加上能够跨膜的信号肽序列。这对重组蛋白的折叠可能有一定好处；由于跨膜是逐个进行的，蛋白间的交联机会较少；周质中的蛋白酶活性比胞质低；周质蛋白仅占菌体总蛋白的4%，使之易于纯化。但分泌到周质中的重组蛋白其构象不一定是天然构象，在周质中的重组蛋白也可能形成包涵体。,异源蛋白在大肠杆菌中的表达形式 分泌型表达,分泌型表达的优缺点 优点-1 可溶性表达 2 可能接近天然构象 3 Met可被切除 缺点-1 表达量低 2 纯化较困难 3 面临复性问题,异源蛋白在大肠杆菌中的表达形式 融合型表达,融合型表达的特点： 将高量表达的宿主蛋白基因与外源基因拼接在一起，大量表达内、外原杂合蛋白。在融合蛋白中，外源表达产物能在菌体蛋白的引导下形成较好的杂合折叠构象，封闭了部分重组蛋白上的酶切敏感位点，增加了抗酶解能力。,异源蛋白在大肠杆菌中的表达形式 融合型表达,融合型表达的优缺点： 优点- 1稳定性强 2比单纯分泌表达产量高 缺点-1需将融合蛋白两者分开，对酶切试剂和工艺的要求高 2可能面临体外复性问题,异源蛋白在大肠杆菌中的表达形式 融合型表达,融合型表达系统的构建原则： 选择能够高效表达的宿主结构基因， 尽量避免融合蛋白中两者的理化性质过于接近，以利于异原蛋白的分离。 两种蛋白之间留有特定的分割位点，能够准确分离。,切割融合型蛋白的条件,蛋白内切酶的纯度一定要高 选用断裂位点专一性最强的酶 目的蛋白内部不存在同样的切割位点 严格按照相应酶切的最佳条件进行,几种常用的融合蛋白表达载体,Protein A (葡萄球菌A蛋白) GST（谷光甘肽S-转移酶） CBD (几丁质结合功能区) (纤维素结合功能区) MBP (麦芽糖结合蛋白) 硫氧还原蛋白 周质酶片断,异源蛋白在大肠杆菌中的表达形式 寡聚型表达,寡聚型表达的特点： 单纯增加载体数量，在一定程度上可提高表达量。然而受体细胞的大部分能源除了表达目的基因外，还要表达载体上更多的，有些是已无关紧要的产物。因此单纯增加质粒拷贝数有时表达量也上不去。这时可考虑采用将一连串外源基因克隆在相对低拷贝的质粒上形成寡聚型表达，虽拷贝数少但转录产物并不少，在一定程度上节省了资源。,多表达单元重组,目的基因,转录,翻译,多顺反子重组,转录,翻译,SD,SD,SD,外源基因,多编码序列从组,转录,翻译,体外切割,外源基因,异源蛋白在大肠杆菌中的表达形式 整合型表达,整合型表达的特点： 将外源基因直接整合在宿主细胞的染色体上，大大增加了外源基因的稳定性，并免去了对宿主细胞的抗性选择。最好整合到不干扰宿主细胞正常生理代谢的非编码区中的特定位置。,外源基因染色体定位整合原理,根据DNA同源交换原理，在外源基因两侧各组合一段与染色体特定部位完全相同的同源序列。外源基因越长同源序列也需越长。,外源基因在大肠杆菌 中的高效表达的方法,强化异源蛋白质的生物合成 抑制异源蛋白质的降解 优化菌体培养和诱导表达的条件,强化异源蛋白质的生物合成,提高外源基因的剂量 优化转录调控元件 优化翻译元件,提高外源基因的剂量,1. 合理采用高拷贝质粒 质粒扩增多发生在宿主细胞生理代谢最旺盛的对数生长期内，过早的质粒快速扩增会影响宿主的生长与代谢，进而导致质粒的不稳定性。如pCP3表达质粒，大肠杆菌在28度生长时，尽管到达对数期，但细胞内的质粒数也不多，不影响菌体生长。当温度提高至42度时，质粒拷贝数可迅速提高10倍。此时同时开启启动子，可大大提高外源基因表达量。,优化转录调控元件 常用的的启动子,最常用大肠杆菌天然启动子有Plac、Ptrp、Pl、PrecA、T7。分别来自乳糖操纵子，色氨酸操纵子，其余来自-噬菌体。T7启动子最常用，它位于pET-3a表达载体上，宿主菌是BL21（DE3）株，编码T7-RNA聚合酶。杂合启动子作用更强，如Ptrp和Plac杂合成的Ptac，启动强度分别是Ptrp的3倍和Plac的11倍。启动子的强弱程度还与所控外源基因的性质密切相关。,优化转录调控元件 双启动子表达载体,为提高转录活性，增加外源基因的表达量有时将两个启动子串联到一起。 两个不同的启动子串联， 如 PR+T7 两个相同的启动子串联, 如 T7+T7,在目的基因与一个强启动子重组后，如检测不到相应的mRNA，排除其它因素后，可考虑调整启动子与目的基因间的距离。可用核酸外切酶将目的基因的上游切成不同的长度，在将启动子与目的基因连接和克隆，最后检测表达量。,优化转录调控元件 启动子的位置,优化转录调控元件 操纵子的选择,使用操纵子的原因 象质粒扩增对宿主细胞的影响一样。高水平的全程表达，对宿主菌生长极为不利。会导致宿主菌能量耗尽，代谢终止而死亡。受到高负荷的宿主菌在传代过程中会将重组质粒部分或全部丢失。最终筛选出低效表达或不表达外源基因的宿主细胞群体。,乳糖操纵子结构,调节,操纵,启动,CRP,乳糖分解和利用的酶,乳糖,阻遏蛋白,结构基因,优化转录调控元件 常用的操纵子及诱导条件,-噬菌体启动子-去阻遏途径复杂，难以化学诱导。一般采用其阻遏基因温度敏感型突变体的操纵子。采用变温诱导，宿主菌扩增温度为28-30度，需要时变温至42度，使阻遏蛋白失活，从操纵子上脱落，启动转录。,优化转录调控元件 阻遏蛋白量对操纵子的影响,操纵子抑制作用的强弱很大程度上取决于阻遏蛋白的数量，数量过低抑制效果不佳。可把阻遏蛋白基因克隆到另一个低拷贝质粒上，确保阻遏蛋白分子数和启动子拷贝数维持在一个合适的比例上，强化阻遏作用。,优化转录调控元件 终止子,强启动子控制易发生转录过头的现象，形成长短不一的mRNA混合物。严重影响转录和翻译效率。外源基因下游如有载体质粒的重要基因功能区，这种干扰可能是致命的。至少也会由于生成大量废物蛋白而耗费能量。必须选择强的终止子，必要时采用双终止子结构。,优化转录调控元件 终止子,强启动子有时除发生转录过头现象外，有时甚至可以发生反向转录，转录出与mRNA互补的反义序列，造成模板封闭。 终止子附近有丰富的GC反向互补序列，配对折叠成终止发夹结构，该结构可使RNA聚合酶移动缓慢或暂时停止，下游寡聚U结构是独立型终止子的终止信号。 转录完成的重要标志是有poly A的掺入。,优化翻译元件 SD序列与起始密码子区间的优化,SD序列与起始密码子间精确距离保正了核糖体定位，翻译起始密码子AUG正好处在核糖体上的给位（P）。在大多情况下SD序列位于AUG前大约7个碱基处。如有必要可对这距离进行优化。 SD序列与起始密码子间的碱基组成对不同的外源基因表达也有影响，特别是AUG前3个碱基的组成对翻译起始影响更大。,优化翻译元件,a,AUG,5,3,SD序列 结合核糖体 优化与核糖体的结合强度以 提高翻译效率,3-10bp,SD与AUG的间距 优化距离使AUG 处于核糖体给位 优化碱基组成以 求翻译最佳效率,此区不可 与前面有 互补序列 以免形成 茎环等明 显二级结构,UAAGGAGG,优化翻译元件（4） 简并密码子,人的61个编码密码子中只有14个使用频率超过1.0%，其中最大只有 2.18%（平均1.50%）。 大肠杆菌61个编码密码子中却有29个使用频率超过1.0%，其中最大达到7.69%（平均2.88%)。另有9个编码密码子使用频率为零。 以下为9个大肠杆菌根本不用的密码子(括号中为人该密码子的使用频率%）。 CUA(0.31)，AUA(0.18)，CCC(0.76)，ACG(0.27)，CGA(0.18)，CGG(0.22)，AGG(0.45)，GGA(0.71)，GGG(0.49)。,密码子偏爱性的特点,密码子与反密码子的结合强度差异： 结合强度大，tRNA离开核糖体给位的时间长，结合强度弱 ，tRNA进入核糖体受位的时间长。可能是偏爱原因的所在。 不同细胞内tRNA含量的差异： 表达量高-密码子种类少-相应的tRNA多 表达量少-密码子多-相应的tRNA少,优化翻译元件（6） 简并密码子使用的优化,按照宿主的偏爱性来选择它们偏爱的密码子。替换密码子碱基可参照宿主细胞的密码子使用频率表。如 CCC为0，而改为CCG为2.98 外源基因的全程替换，做起来比较困难，可能也没有必要。 从外源基因密码子中选出几个宿主细胞最不喜欢选用的主密码子，加以替换，测定表达结果。,优化翻译元件（7） 简并密码子使用的优化,对于那些富含宿主细胞讨厌密码子的大分子外源基因，可选择： 同步克隆表达法：将一些在宿主细胞中含量低的tRNA编码基因，克隆在另一个高表达质粒上，以弥补由于宿主细胞几种tRNA分子匮乏造成的，对外源基因翻译的限制作用。,终止密码子,在终止密码子处新生肽与mRNA分离，新生多肽释放因子RF1 识别 UAA 和 UAG，RF2 识别 UAA 和 UGA。由于两个释放因子都能识别UAA，故UAA的终止效果最好。为保证翻译的有效终止，可将几个终止密码子串联在一起。有报道说 UAAU的翻译终止效果甚佳。,蛋白酶抗性或缺陷型表达系统,原核生物细胞内的蛋白酶解系统较为发达，特别针对异源蛋白，尤其是在异源蛋白折叠不佳的情况下，更易受到宿主细胞蛋白酶的降解。改进方法有： 选用蛋白酶缺陷型受体细胞 外源基因产物序列的改造,蛋白酶抗性或缺陷型表达系统 抗蛋白酶重组异源蛋白序列改造,有些氨基酸序列能够抗大肠杆菌蛋白酶的降解。如C端存在极性氨基酸时会提高蛋白质的稳定性，如在C端引入天门冬氨酸能显著延长蛋白质的半衰期。在N端连上连接上某个氨基酸会使稳定性大为增强，应避免蛋白酶易感序列，如N端的PEST序列。,基因工程菌遗传不稳定性的表现,结构不稳定性：重组载体分子上某一区域发生缺失、重排或修饰等改变导致重组体的功能部分或全部丧失。 分裂不稳定性：重组体从宿主细胞中逃逸(curing)，导致重组体的功能全部丧失。,工程菌遗传不稳定性的产生原因,外源基因的高效表达严重地干扰了宿主细胞的生长代谢过程。这些干扰可诱导菌体产生应激反应，包括关闭自身的生物合成，启动核酸酶和蛋白酶基因的表达，将外原基因或表达产物降解。 外原基因大量表达，使不含或少含重组质粒细胞在繁殖上逐渐占优势。导致胞分裂时质粒的分配不均。 应激反应激活宿主细胞内源性转位因子，促进重组载体片断的缺失和重排。,重组质粒的宏观逃逸率,重组质粒的宏观逃逸率 = 不携带重组质粒的细胞数 / 总细胞数 100 % 例：每代基因工程菌的宏观逃逸率为0.1%，不含重组质粒的受体细胞其比生长速率是含重组质粒细胞的1.5倍，在分裂第25代时的宏观逃逸率为99.9%！ 大规模发酵已逐渐不允许使用抗生素进行压力选择。加重了问题的严重性。,改进载体宿主系统,增加质粒拷贝均衡分配（Par）基因。 正确设置载体上的多克隆位点，防止外源基因插入质粒上的稳定区。 选择对重组质粒耐受性好的宿主菌。 除去宿主菌染色体DNA上的转座元件。,施加选择压力,抗生素添加法-利用抗性基因，将抗生素加入到培养体系中。 抗生素依赖法-将宿主菌诱变成抗生素依赖突变株，在质粒上引入该抗生素的非依赖性基因。 营养缺陷法-灭活某种细胞生长必须的基因，获得营养缺陷型突变株。将灭活的基因克隆到质粒上，建立互补关系。,基因工程菌的大规模培养,基因工程下游技术的开始,原始种子库和生产种子库,生物制品生产采用种子批系统。原始种子库应验明其纪录、历史、来源和生物学特性。从原始种子库传出、扩增后动干保存的为生产用种子库。生产用种子批的生物学特征应与原始种子批一致。每批生产用种子批均应按规程要求保管、鉴定和使用。,制造菌种库的建立,从原始菌种库传出，经扩大后冻干保存，或由上一代制造菌种库传出，扩大后冻干保存，作为制造菌种库，但每次只限传三代。每批制造菌种库应进行下列鉴定，合格后方可投入生产。,生产用菌种库的鉴定,形态学鉴定、革兰氏染色、生化反应鉴定、抗生素抗性鉴定、重组质粒稳定性的测定、表达稳定性鉴定、表达产物抗原抗体反应鉴定、重组质粒酶切图谱鉴定、菌落原位杂交及污染检测鉴定等。,分批式发酵的特点,分批发酵可以看成一个封闭的系统，所有的培养成分一次性投入发酵罐中，灭菌后直接接种开始发酵。在整个发酵过程中，培养基的组成、菌体浓度、细胞内代谢物质成分以及外源基因产物均随着细菌的生长状态、细胞代谢途径和营养成分利用率的变化而变化。,分批式发酵的四个时相,潜伏期,对数期,稳定期,衰亡期,LogN,T,补料式发酵,一种或多种营养成分定时加入培养系统中，可防止某些限制性营养成分在培养过程中被耗尽而影响细胞的生长和产物形成。可以在一定程度延缓对数期和稳定期，提高菌体密度和表达量。通常用一些发酵参数的变化来间接估算补料时间和规模。流加发酵比较适于基因工程菌的培养，但工艺控制较为严格。,连续式发酵,为一个开放的发酵系统，培养基不断进出，细胞的总数和培养液的总体积维持恒定，形成稳态。连续发酵中细胞的生理状态相当稳定，产量与质量也较为恒定。生产相同量的产品所用的设备小；对处理量要求较低；有效缩短发酵设备的停工期；生物产品的成本远低于其他的发酵方法。,发酵过程的优化控制,基因工程菌的大规模发酵与普通发酵相比，其显著特征是在细胞内增加了一条相对独立的代谢途径，菌体的其它代谢途径都要受到重组质粒的拷贝数和重组蛋白的表达量的影响。基因工程菌发酵过程的优化可以围绕以下三个层次进行。即工程水平、分子水平和细胞水平的优化控制。,工程水平的优化控制,要能补足大量的空气，必要时补充纯氧。要有除泡沫措施，要能将气体悬浮及气泡的破碎，要有调节培养液酸碱度的措施。 能够恒温和迅速变温，找到表达最佳状态。 能够均匀适度的混合。有利于加快营养成分和溶氧的传递，促进热量的散发以及降低细胞有毒代谢产物的局部浓度等。,细胞水平的优化控制,优化发酵过程中的细胞密度、调整代谢途径及产物比生长产率等。实验证明，重组蛋白的最大合成量和受体菌代谢活力的维持，往往与细菌较低的生长速率相伴。但降低生长速率必须在拥有一定的细胞密度的基础上才能有助于提高重组蛋白的宏观表达量。,分子水平的优化控制,外源基因的表达控制。工程菌构建只是为表达调控提供了可能性，必须通过各种手段在菌体生长过程中得以实现。具体方法见载体构建。 细胞内蛋白质生物合成系统的均衡。合理控制细菌基因表达的时间与强度，有利于细胞内几种代谢途径的和谐与稳定。 重组质粒拷贝数的维持。质粒的过高拷贝会耗费大量能量，表达更多的无效产品，不仅影响菌体的生长代谢，且不利与其稳定性。,动物细胞大规模培养,优点：可分泌异源蛋白；正确的糖基化和翻译后修饰；正确的蛋白分子构象。 缺点：异源蛋白表达量低；难以大规模生产；培养基昂贵；培养时间长；易于污染；培养条件苛刻。,动物细胞培养中血清的使用,血清对动物细胞的生长有很大作用，但其确切作用还未充分确定 血清的存在是产物纯化的主要障碍。 常受病毒、支源体等微生物的污染。 血清不仅有生长促进活力，而且有生长抑制活力。 是细胞培养基高成本的主要因素。 生产标准化难以实现。,动物细胞培养的操作方式,分批式：适用于表达产物仅在某一时相有最高的表达量。 流加式与连续操作式特点基本同发酵。 换液培养：不断置换一部分培养液，可以反复收获产物，对分泌性比表达特别适用，尤其对微载体培养。,动物细胞的转瓶培养,将细胞接种在柱型瓶的瓶壁，培养过程中转瓶不断转动。 优点：投资少，技术成熟，重现性好，溶氧和pH不需调节，放大只是简单地增加转瓶的数量。 缺点：劳动强度大，单位体积提供细胞的表面极小，占用空间大，按体积计算细胞产率低。,动物细胞的微载体培养, 细胞贴附在微载体颗粒上，经搅拌悬浮培养，是单层培养和悬浮培养的结合。 优点：具有两种培养方法的优点；表面积/体积比极大；细胞生长环境均一；培养基利用效率高；重现性好；收获过程不复杂；劳动强度小；占用空间小，非常适用于大规模培养。 缺点：微载体培养时表达载体容易丢失，质粒稳定不好一般不能使用这种方法。,微载体必备的条件,对培养细胞无毒 与细胞有良好的相容性 密度要稍大于培养基 颗粒度均匀，表面平滑，柔性材料， 具有良好的透明性， 耐高温、高压，可灭菌 收获细胞或细胞制品容易。,微载体的几种形式,毛玻璃珠微载体：效果较好，可包被粘性物质，稳定性好，可重复利用。 液膜微载体：一种有机相在液相中形成的液珠。与细胞的培养基搅拌混合后，该化合物随即分散成微珠，细胞贴附于上并扩增，停机后离心，两相自动分开，细胞自动悬浮于两相之间。 大孔微载体：细胞可钻到内部，加大了载体表面积，细胞的抗性增加。,微囊化培养方法,将细胞包绕在营养物质可以自由进出的半透膜内，细胞在微囊内扩增表达。由于囊膜保护，使细胞不易受到机械损伤。根据微囊的截留值不同，分泌表达物质可被截留在位囊膜内，培养结束后破囊提取，也可释放到囊膜外，易于分离。,不同部位表达效果鉴定,溶菌酶消化后离心取上清 反复冻融后离心取上清 超声破碎后离心取沉淀 电泳确定重组蛋白在周质,细胞质及包涵体中的分布情况。,基因工程菌的裂解方法,高速球磨法：珠子与与细胞间碰撞剪切 高压匀浆法：高压挤压，高速喷出碰撞 超声破碎法：高频震动，冲击波剪切力 酶溶解法：消化细胞膜与细胞壁 化学渗透法：去垢剂、金属鳌合剂、变性剂、有机溶剂 冻融破碎法：膜疏水键断裂，冰晶膨胀,包涵体的溶解,在复性纯化前，必须使包涵体充分变性、溶解。 不含二硫键多肽的可用8M尿素或6M盐酸胍等变性剂溶解，有时也要加还原剂。 含二硫键的多肽需添加2-MT或DTT等还原剂，必要时需排空气，充氮气，使二硫键充分还原。 加入EDTA或 EGTA，用来抑制金属离子与还原状态的巯基间发生的氧化反应和抑制某些酶。 加入蛋白酶抑制剂等。,变性蛋白的层析纯化,凝胶过滤法：在含有变性剂和还原剂的条件下进行层析分离，流速要慢。此法可能是大规模生产中的一个限速步骤。 离子交换法：变性剂对离子交换的效果可能有一定影响。由于高浓度盐酸胍的高离子强度，其变性液中的蛋白质不能用于离子交换分离。,重组蛋白的复性操作,目前重组蛋白已达数千多种，其中大肠杆菌表达占90%以上，绝大多数以包涵体形式存在，只有复性才能恢复其活性。 折叠复性是一个非常复杂的过程，除对复性过程的控制相关外，还蛋白质本质有关，有些蛋白非常容易复性，有些蛋白体外根本无法复性。至今也没找到针对大多数蛋白质体外复性的通用方法。,体外复性的影响因素,蛋白质在复性过程中涉及两种疏水作用，分子内的疏水作用，可促进蛋白质正确折叠；二是分子间的疏水作用，会导致蛋白质聚集。 复性过程中有三类二硫键配合方式，即分子内正确、分子内错误及分子间错误配合方式。 肽链折叠还受到周围环境的影响，如温度、pH值、离子强度、复性时间等因素的影响。,包涵体蛋白,分子内二硫键的正确配对,折叠,折叠,聚集,聚集,沉淀,沉淀,还原态,天然态,聚集,聚集,沉淀,沉淀,共价,共价,共价,共价,蛋白折叠过程中的动力学模型,影响复性效率的因素,