《组织培养技术》PPT课件.ppt

组织培养,Tissue Culture,一、组织培养的定义,组织培养： 细胞、组织或器官离体合适的培养液、温度、无菌使之生存和生长 根据培养物的不同，组织培养又可分： 细胞培养、组织培养和器官培养。,二、组织培养的应用,1. 优点： （1）研究对象是活细胞，可长时间动态观察细胞的形态结构和生命活动。 （2）研究对象广泛，包括各种组织细胞。 （3）可研究各种理化因素（温度、药物、毒素等）对细胞代谢、增殖、分化的影响。 （4）研究方法多样，如倒置、荧光、电子显微镜、组织化学、同位素标记等，研究结果便于观察记录。,应用：,病毒学：细胞培养是分离培养病毒的重要手段，用于病毒感染的诊断，生产病毒疫苗。 免疫学：杂交瘤-单克隆抗体技术。 遗传学：从子宫取得胎儿细胞做染色体分析，进行遗传学诊断，试管婴儿等。 肿瘤学：抗肿瘤药物筛选。,2. 不足之处： 体外与体内培养条件不完全相同，失去神经内分泌系统的调节作用，培养的细胞存在一定的差异，故对结果的判断应慎重。,二、组织培养的应用,三、培养细胞的特性,1. 培养细胞的分型（按生长方式分） （1）贴附型： （2）悬浮型：,1. 培养细胞的分型（按生长方式分） （1）贴附型：大部分细胞附着于支持物表面生长，分化不明显，形态单一，常反映其胚层起源。如上皮细胞型，成纤维细胞型，多形细胞型。,上皮细胞型,成纤维细胞型,（2）悬浮型：不贴附于支持物上，而呈悬浮状态生长，细胞呈圆形，单个或细胞团排列；见于血、脾、骨髓细胞、部分肿瘤细胞。,悬浮型细胞,三、培养细胞的特性,2. 培养细胞的生长和增殖 原代培养（Primary Culture）：从体内取出组织开始在体外培养，在其传代之前。 传代培养（Subculture）: 将细胞分离成两部分获更多至新的培养器皿中，并补充更新培养液。 细胞系（Cell line）：原代培养细胞一经传代后便称为细胞系。,细胞系的生长过程,有限细胞系,无限细胞系,二倍体细胞大多可传30-50代，相当于150-300个细胞周期，维待一年左右的生存时间。,细胞系的生长过程 原代培养期：1-4周，与体内细胞相似，但分裂不旺盛，含细胞类型较多。 传代期：持续时间最长，细胞分裂增殖旺盛，保留原组织细胞的很多特征，一般传代30-50次后，细胞增殖逐渐缓慢。 衰退期：细胞增殖缓慢，并逐渐停止，细胞形态轮廓增强，最后衰退、死亡。 实验研究的最佳时期：,传代期（10代以内）,三、培养细胞的特性,1. 营养需要： 碳水化合物、氨基酸、维生素、无机离子、促生长因子和激素,2. 生存环境： 温度： PH值： 气相： 渗透压： 3. 无污染及无毒：,35-37 耐低温不耐高温,7.2-7.4 宁酸勿碱,O2、CO2（5% ）NaHCO3-CO2,260-320 mmol/L,3. 培养细胞的生长条件,防止污染,要注意防止微生物（细菌、病毒、真菌、支原体等）的污染、不同细胞类型的交叉污染。 出现以下情况时培养细胞可能有污染： 1) 培养液的酸碱度异常改变，如短期内颜色变黄 ； 2) 培养液出现混浊； 3) 光镜观察到大量颗粒或菌丝； 4) 细胞生长停止或出现死亡。,四、组织培养的常用设备,1. 仪器 包括各种无菌操作、消毒灭菌、细胞培养和保存的设备，如无菌室、超净工作台、CO2培养箱、高压蒸汽灭菌器、滤器、水纯化装置、倒置显微镜、离心机、液氮容器等。,超净工作台,CO2培养箱,四、组织培养的常用设备,2. 器皿,培养瓶,培养皿,培养板,四、组织培养的常用设备,3. 试剂 （1）天然培养基：动物血清（如胎牛血清、小牛血清）。 （2）合成培养基：如RPMI1640、DMEM、199等。 多采用合成培养基+天然培养基（5-20%）。 （3）平衡盐溶液：由无机盐和葡萄糖组成，用于洗涤、配 液、维持渗透压，调节PH值等，如PBS、Hanks等。 （4）消化液：用于消化解离组织块，使贴壁细胞从附着物 脱离。如胰酶、EDTA、胶原酶等。,五、基本培养技术,1. 无菌操作 2. 取材 3. 组织分离 4. 原代培养 5. 传代培养 6. 细胞冻存与复苏,五、基本培养技术,1. 无菌操作： 防止污染是决定组织培养成败的关键，必须无菌操作！ （1）培养前的消毒灭菌 待用物品：洗涤、消毒灭菌。 无菌室：紫外线照射30-50min，新洁尔灭拖地。 超净台：75%酒精擦洗，紫外线灭菌等照射30min。 （2）洗手和着装 彻底洗手，着清洁工作服，酒精消毒手。 （3）无菌培养操作 超净台内操作，点燃酒精灯，火焰附近操作，在安装吸头、打开或封闭瓶口时均应过火烧灼。 不直接用手触及器皿的无菌部分，如瓶口、瓶塞内侧，必要时借助镊子。 吸取培养液、平衡盐溶液、细胞悬液的吸管不能混用。 转移液体时，吸管口不能触及瓶口，以防交叉污染。 饭盒、瓶子不要过早打开，使用后及时盖好，瓶塞倒置在桌面。 面向操作台时勿大声讲话、咳嗽，以免喷出唾沫，污染工作台面。 操作完毕，整理台面，酒精擦拭。,五 、基本培养技术,2. 取材： 新鲜、无菌、避免有害因素损伤。,五、基本培养技术,3. 组织分离 （1）离心分离：用于血液、羊水、胸水、腹水等悬液，500-1000 rpm低速离心5-10 min。 （2）机械分离：用剪刀将组织剪切成小块，也可再挤压通过筛网，用于纤维成分少的组织，如脑、胚胎、一些肿瘤组织。 （3）消化分离：用消化液使组织松散、细胞分开，获得细胞悬液。常用消化液胰酶、EDTA、胶原酶。,六、基本培养技术,4. 原代培养： （1）组织块法：将组织剪切成小块后，接种于培养瓶底部，培养后细胞从组织块边沿移出生长。简便易行，适用于组织量少培养。 （2）消化法：将消化分离法获得的细胞悬液，接种培养瓶。在短时间内生长成片，适用于大量组织的培养，但步骤繁琐、易污染、成本高。,五、基本培养技术,5. 传代培养： 贴附型细胞：加入消化液，镜下观察，见胞质回缩、细胞间隙增大，终止消化，吹打为单细胞悬液，计数后接种新的培养瓶。 悬浮型细胞：直接吹打或离心沉淀后再分离传代。 注意：1）贴壁细胞覆盖瓶底大部分（80%）方可传代，不要急于传代； 2）传代时不同细胞有不同的消化时间，要根据需要注意观察及时处理。,六、基本培养技术,6. 细胞冻存和复苏 目的：保存和利用细胞。 短期保存：-70低温冰箱，长期保存：-196 液氮罐。 为保证细胞最大存活率，采用慢冻快融的原则 。 冻存：收集对数生长细胞，加入保护剂和培养液，调细胞密度5-10106/ml，分装入冻存管，逐渐降温，-1-2/min，到-25时，下降率增至-5-10/min，到-100迅速浸入液氮罐。（430min-7024h-196 液氮）。 复苏：取出冻存管，直接投入37水浴中，快速摇动，直至完全融化，吸出细胞，加入10倍以上培养液，离心，调整细胞密度5105/ml，接种培养瓶。 细胞冻存于液氮中（-196）理论上储存时间是无限的。一般冻存一年后，应复苏一次，继续冻存。,低温冰箱,液氮罐,冻存管,冻存管,实验操作：小鼠肝组织培养,（一）实验材料 1.器材： 手术剪、手术镊 （大） 剪鼠开皮肤、肌肉层 眼科镊、眼科剪 （小） 剪碎鼠肝脏 培养皿 盖和底分别用于清洗、剪碎鼠肝脏 培养瓶 培养肝组织 2.试剂：洗液PBS、小牛血清、 培养液1640 3.仪器：超净工作台、CO2培养箱 4.动物：小白鼠 1只 /2人,实验操作：小鼠肝组织培养,（二）实验方法 1. 处死消毒小鼠：引颈法处死小鼠，在75%酒精缸中浸泡数秒取出，滴去酒精，腹部向上放进白瓷盘，拿入超净台。 2. 准备工作：点燃酒精灯，酒精棉球擦手， 取3支滴管分别放入洗液、血清、培养液中。 （第一组放，最后一组收） 3. 取肝脏：用手术剪、镊剪开腹部皮肤、肌肉层，暴露腹腔，从腹腔右侧取一小块肝组织，放入培养皿中。 4. 洗涤：加入洗液，用眼科镊夹住肝组织清洗，共洗2遍。,实验操作：小鼠肝组织培养,（二）实验方法 5. 剪碎：在培养皿中加入1滴小牛血清，将肝组织放入其中，用眼科剪剪碎成1mm3左右小块。 6. 准备培养瓶：吸1滴血清，滴在培养瓶底面，来回涂抹。 7.接种肝组织：用滴管吸取肝组织，贴于培养瓶底面中， 3-4块即可，分开排列。 8.加培养液：翻转培养瓶，加入培养液2滴管，轻旋瓶盖。 9.培养：将培养瓶放入CO2培养箱，2h后翻转。 10.整理台面，清洗器材。,实验操作：小鼠肝组织培养,注意事项： 无菌操作 试剂中的滴管第一组放，最后一组收 加培养液时，要翻转培养瓶 2人一组，相互配合 实验结束后：器材 C409清洗 小鼠 C409垃圾桶,实验操作：小鼠肝组织培养,（三）实验结果 培养一周左右，倒置显微镜下，可见肝细胞