研究生入学考辅导西医综合.ppt

,DNA 蛋白质,复制,转 录,反（逆）转录,翻 译,RNA,复制,遗传中心法则,第三部分 基因信息的传递,DNA 复 制 要 点 一、DNA半保留复制 二、DNA复制的酶学 三、复制基本过程（端粒酶） 四、DNA损伤（突变）及其修复 五、逆转录及逆转录酶,一、DNA复制的含义： DNA分子为模板合成新的DNA分子的过程，称 为DNA复制。 二、复制的方式 半保留复制 指经复制后，子代DNA分子中一条链完整来自 亲代DNA，而另一条链则完全重新合成，且与母链 碱基互补。,DNA的半保留复制,DNA复制的酶学,一、酶 DNA聚合酶 （简称 DNA-pol，全称依赖 DNA的DNA聚合酶，DNA-dependent DNA polymerase, DDDP） 主要特点：（1）催化5 3的合成方向 （2）具核酸外切酶活性 （3）底物 dNTP,大肠杆菌DNA聚合酶,3 5外切 53外切 酶活性 酶活性,功 能,种 类,DNA-pol I 校读、修复、填补 缺口（催化延长约 20个核苷酸） DNA-pol II 不详 DNA-pol III 复制,真核生物DNA聚合酶, ,酶活性 5 3 聚合酶活性 3 5 外切酶活性 构成亚基数 4 4 4 2 5 分子大小（kd） 250 36-38 163-300 170 256 细胞内定位 核 核 线粒体 核 核 功能 随从链 修复 复制 领头链 校读、修 复制 （无其它 复制 复、填补 DNA-pol时）,DNA聚合酶通过其35核酸外切酶的作用发挥较正功能,二、引物 寡聚核苷酸（RNA片段） 三、模板 解开成单链的DNA母链为模板,四、其它酶类和蛋白质因子 解螺旋酶（即Dna B蛋白或Rep蛋白）解开 DNA双链。 Dna A 辨认复制起始点。 Dna C 协助解螺旋酶，使其在起始点上结合 并打开双链。 DNA拓扑异构酶 理顺DNA链，即通过切断、 旋转和再连结作用，把正超螺旋变为 负螺旋。 单链结合蛋白（SSB） 稳定解开的单链DNA DNA连接酶 催化复制中两条不连续的链片段 间的磷酸二酯键形成。,解旋、解链作用,DNA复制的基本过程,起始 延长 终止,5,5,5,3,3,3,5,领头链,随从链,解链方向,不连续复制,复制叉,冈奇片段,连续复制,起始点（Ori） 复制叉与双向复制 引发体的形成 3、引物的生成,起始,复制方向（53） （不）连续复制 冈崎片段 领头链 随从链,延长,终止,引物水解 补缺 连接 端粒酶,含义：它有蛋白质和 RNA 两部分组成，是 一种特殊的反转录酶。 它以自身的 RNA 为模板，在随从链模板 DNA 的3-OH 末端延长 DNA，再以这种延长 的 DNA 为引物，继续合成随从链，直至一定长 度。,端粒酶（真核生物）,1、突变 （基因突变）的含义 指DNA分子（基因）上碱基的改变。 2、分类： 错配（点突变） DNA分子上1个碱基的变异 缺失 一个或一段核苷酸链片段的丢失 插入 原来没有的1个碱基或一段核苷酸链插入分子 重排（重组） DNA分子内发生较大片段的交换。移位的DNA片段在新位点上可颠倒方向反置（倒位），也可以发生在染色体之间。,DNA损伤（突变）与修复,3、引发突变的因素 （1）物理因素：紫外线和辐射 紫外线常发生嘧啶二 聚体，致复制和转录受阻。 （2）化学因素：化学诱变剂 5-溴尿嘧啶（5-BU）、 羟胺类（NH2OH）、亚硝酸盐、烷化剂 （氮芥类）等,胸腺嘧啶,嘧啶二聚体,光修复酶,4、DNA 损伤的修复： （1）光修复通过光修复酶催化，使嘧啶二聚体解聚， 但需要光照射 （2）切除修复特异核酸内切酶、DNA-pol I和连接酶 共同完成,重 组 修 复,（3）重组修复,（4）SOS修复 细胞处危急状态的一种修复。此时可诱 导一种可催化DNA合成的特殊酶，其对碱基识辨能力差，易 出错。尽管如此，还是可以提高细胞存活率。,逆转录作用指以RNA为模板合成DNA的过程。 逆转录酶 三种酶活性 （1）RNA为模板催化DNA合成 （2）水解杂化双链上RNA （3）DNA为模板催化DNA合成,逆（反）转录作用和逆（反）转录酶,起始点 多 点 单 点 速度 慢（原核的1/10） 快 引物大小 短（约10个核苷酸） 长（约数十个核苷酸） 冈奇片段 少（约100200个） 多（约10002000个） 酶 DNA聚合酶- DNA聚合酶 III 端粒酶 有 无,真核生物 原核生物,真核与原核生物复制的主要区别,转 录 以DNA为模板合成RNA的过程,称为转录。 要 点 1、RNA的不对称转录 （转录的模板、酶及基本过程） 2、RNA转录后的加工修饰 3、核酶,RNA 聚 合 酶,一、RNA 聚合酶（全称依赖DNA的RNA聚合酶，DNA -dependent RNA polymerase, DDRP; 亦称转录酶） 特点：1、催化53的合成方向 2、底物为NTP 3、摸板DNA 4、不需要引物 5、产物是RNA,大肠杆菌RNA聚合酶组分及功能,二、原核生物 RNA 聚合酶,2 核心酶 ,全酶,亚基 分子量 功能, 36512 决定哪些基因被转录 150618 与转录全过程有关（催化） 155613 结合DNA模板（开链） (sigma) 70263 辨认起始点,三、真核生物RNA聚合酶,真核生物RNA聚合酶分类,种类 I II III,转录产物 45S-rRNA hnRNA 5SRNA，tRNA snRNA 对鹅膏覃碱的反应 耐受 极敏感 中度敏感,一、不对称转录 两层含义：（1）在DNA双链分子上，仅一股链可转录 （2）模板链非永远在同一条单链上,模 板,为结构基因 （编码链、反义链）,为有意义链（模板链）,不对称转录,3,3,5,5,（箭头表示转录产物生成方向）,二、模板链（有意义链）和编码链（反义链） 模板链：指DNA分子中可转录成 RNA的一股链。 编码链：其特点是除用T代替RNA分子中U外，其余都相同。,DNA模板、转录产物、RNA繁荣核苷酸序列， 以及翻译产物肽的氨基酸序列,T,T,T,U,U,U,三、酶与模板的辩认结合 1、转录起始点开始转录的位点，常标以 +1 2、结合部位约为7个碱基长度，其中心位于上 游- 10 bp处被称为 10区或 Pribnow 盒(TATA盒）。该 区具高度保守性，并易解链。 3、识别部位RNA聚合酶亚基识别的部位，约 含6个碱基长度，其中心位于上游 - 35 bp处被称为 35 区。,启动序列(原核）,启动子（真核） 顺式作用元件,TGTTGACA,TATAAT,3 5,5 3,DNA,编码链 模板链,- 35 区,- 10 区,+ 1,5 McGPPP,转录起始部位,启动子,基因转录区,RNA产物,NH2,翻译开始,转录开始,四、基本过程 1、转录起始 原核生物需要依赖 因子辨认转录起始点， 被辨认的DNA区段处-35区特定序列。 真核生物转录起始也需要RNApol对起始区 上游DNA序列做辨认和结合，并生成起始复合物， 但其上游DNA序列（统称为顺式作用元件）不象 原核生物那样典型。,2、延长 在RNA聚合酶催化下，按 53 方向合成 5，3-磷酸二酯键。酶-DNA-RNA形成转录复合物。 3、终止 原核生物有两种机制： （1）依赖 因子（Rho factor）的转录终止可识别来自RNA产物的终止信号，而不是来自DNA摸板。 （2）非依赖 因子的转录终止终止子特点是RNA产物具有发夹结构（茎-环结构）和一段富含polyU片段。 真核生物的转录终止是与转录后修饰密切相关的：,5,AAA.AAA,TTATTT,AATAAA,GTGCGC,5,3,DNA,转录终止,RNA聚合酶,AAUAAA,RNase,修饰点,hnRNA,真核生物的转录终止及加尾修饰,（一）真核生物mRNA的转录后的修饰 1、加帽（5端） 2、加尾poly A（3端） 3、剪接断裂基因、外显子和内含子,切除,连接,帽,poly A,转录后的修饰,概念：真核生物结构基因含若干个编码区 （即外显子）被非编码区（即内含子）互相隔开， 但又连续镶嵌而成，故被称为断裂基因。 （二）tRNA的转录后加工 加工修饰包括：剪接（去除内含子） 甲基化（生成甲基嘌呤） 还原反应（生成DHU） 核苷内转位反应（形成） 脱氢反应（产生I） 加-CCA-OH,（三）rRNA的转录后加工 加工修饰包括： 1、原核生物 16 S 23 S 30 S 5 S 2、真核生物 18 S 5.8 S 45 S 28 S 5 S,3、核酶（ribozeme） 由RNA发挥催化作用的酶称为核酶，其 本质是RNA,复 制 转 录 模板 两股链 模板链（有意义链） 原料 dNTP NTP 配对 A - T , G - C A - U , G - C 聚合酶 DNA聚合酶 RNA聚合酶 产物 半保留DNA 三种RNA,转录与复制的区别,要 点 参加蛋白质生物合成的物质 遗传密码 蛋白质生物合成过程和合成后的加工修饰 蛋白质生物合成的干扰和抑制,翻 译,概 念： 指核酸中储存的遗传信息，通过遗传密码解读的 手段转变为蛋白质的氨基酸排列顺序的过程。 参与蛋白质生物合成的物质： mRNA 模板 tRNA 运载体 核蛋白体 装配场所,一、mRNA是翻译直接模板 遗传密码的特点： （1）连续性 （2）简并性 除Trp和Met外，一种氨基酸可有多个密 码（2-6个）；且其1，2位碱基大多相同，第三位碱基可不同。 例如： Ser UCU UCC UCA UCG 偏爱性,5 3,（3）摆动性,tRNA反密码的第一位碱基 I U C mRNA密码的第三位碱基 A , C , U A , G C , G , U,（4）通用性 起始密码：AUG；终止密码：UAA、UAG、UGA,二、合成场所 核糖体（核蛋白体）的组成 三、氨基酸活化 氨基酰-tRNA （一）氨基酰-tRNA合成酶 特点：1、绝对转一性（对底物氨基酸和tRNA都有 高度特异性） 2、具有校正活性（实际为水解酯键催化活性） （二）二步反应 氨基酸 + ATP-E 氨基酰-AMP-E + Ppi 氨基酰-AMP-E + tRNA 氨基酰-tRNA + AMP +E,（三）氨基酰-tRNA的表示方法,ala-tRNAala,arg-tRNAarg,met-tRNAmet,e,真核：,met-tRNAmet,i,（携带延长肽链上Met）,（起始者tRNA，被起始因子eIF-2a辨认）,原核：,fmet-tRNAmet,i,四、基本过程 （一）起始 S-D序列： （原核细胞）指mRNA起始密码AUG前若 干嘌呤核苷酸的保守序列，可与核糖体16 S rRNA 3-末端 UCCU序列互补，故又称为核糖体互补序列（或称核蛋白 体结合位点） 例如,5 A G G A Pu Pu U U U Pu Pu A U G 3,mRNA,mRNA-小亚基,小亚基,mRNA-小亚基-fmet-tRNA,mRNA-小亚基-fmet-tRNA-大亚基,fmet-tRNA,大亚基,met-tRNA-小亚基,小亚基,met-tRNA-小亚基- mRNA,met-tRNA-小亚基- mRNA大亚基,mRNA,大亚基,met-tRNA-GTP-eIF,真核生物,原核生物,（二）肽链的延长（核糖体循环） 包括：注册、成肽和转位三步 （三）终止 多聚核糖体：合成中，在一条mRNA上，有多个 核糖体结合呈串珠状，称为多聚核糖体。,五、翻译后加工 （一）一级结构的修饰 1、去除N-甲酰基或N-蛋氨酸 细胞内脱甲酰基酶或氨基肽酶可去除N-甲酰基， N-末端蛋氨酸或N-末端一段肽。 2、个别氨基酸的修饰 如：胶原分子中的羟脯氨酸和羟赖氨酸 3、水解修饰,N,C,信号肽,103肽（？）,ACTH（39）,-脂酸释放激素（91）,-促黑激素, -促黑激素,内啡肽,（二）高级结构的修饰 1、亚基聚合 2、辅基连接（糖基化） （三）合成后的靶向输送（信号肽、自身结构、转运机构） 信号肽 ： 1、1040多个氨基酸组成 2、碱性氨基酸组成N-端（Lys、Arg） 3、中性氨基酸为主组成疏水核心区（Leu、Ile） 4、小分子氨基酸组成C-端，即加工区（Gly、Ala、Ser）,碱基N-端,疏水核心区,加工区（含信号肽酶裂解位点）,20或更多个氨基酸,信号肽结构,连接分泌蛋白,部分抗生素对翻译过程抑制作用的机理,种 类 机 理 作用对象,四环素 抑制起始氨基酸-tRNA与核糖体小亚基结合 原核 氯霉素 结合大亚基，抑制转肽酶活性，阻断链延伸 原核或 真核线粒体 链霉素（或 结合小亚基，改变其构象，引起读码错误 原核 卡那霉素 嘌啉霉素 取代一些氨基酰-tRNA进入核糖体A位，终 原核或真核 止肽链合成 放线菌素 抑制核糖体转肽酶 真核 白喉毒素 共价修饰延长因子-2，使之失活 真核,六、抗生素对翻译的抑制作用,1997年 A型题 31、紫外线对 DNA的损伤主要是 A、引起碱基置换 B、导致碱基缺失 C、发生碱基插入 D、使磷酸二酯键断裂 E、形成嘧啶二聚物,1997年 X型题 143、将DNA核苷酸顺序的信息转变成为氨基酸顺序的过程包括： A、复制 B、转录 C、反转录 D、翻译,1998年 A型题 29、下列哪种酶不参与DNA损伤的切除修复过程？ A、核酸内切酶 B、核酸外切酶 C、DNA聚合酶 D、DNA连接酶 E、核酸限制性内切酶,1998年 A型题 30、下列关于氨基酸密码的描述，哪一项是错误的？ A、密码有种属特异性，所以不同生物合成不同的蛋白质 B、密码阅读有方向性，5-端起始，3-端终止 C、一种氨基酸可有一种以上的密码 D、一组密码只代表一种氨基酸 E、密码第3位（即3-端）碱基在决定掺入氨基酸的特异性方面重要性较小,1997年 C型题 A、不被转录的序列 B、被转录但不被翻译的序列 C、二者均是 D、二者均不是 123、DNA上的内含子（intron）是指 124、DNA上的外显子（exon）是指,1997年 A型题 29、真核生物转录生成的 mRNA前体的加 工过程不包括： A、5末端加帽 B、3末端加多聚A尾 C、甲基化修饰 D、磷酸化修饰 E、剪接去除内含子并连接外显子,1999年 A型题 31、氯霉素可抑制原核生物的蛋白质合成。其原因是 A、特异地抑制肽链延长因子2（EFT2）的活性 B、与核蛋白体的大亚基结合，抑制转肽酶活性，而阻断 翻译延长过程 C、活化一种蛋白激酶，从而影响起动因子（IF）磷酸化 D、间接活化一种核酸内切酶使mRNA降解 E、阻碍氨基酰tRNA与核蛋白体小亚基结合,1999年 C型题 A、GTP B、ATP C、两者都需要 D、两者都不需要 123、糖原合成时需要的是 124、蛋白质生物合成时需要的是,2000年 A型题 29、下列关于真核生物 DNA复制特点的描述错误的是 A、RNA引物较小 B、岗崎片段较短 C、片段连接时由ATP供给能量 D、在复制单位中，DNA链的延长速度较慢 E、仅有一个复制点,2000年 A型题 30、AUC为异亮氨酸的遗传密码，在tRNA分子中其相应的反密码应为 A、UAG B、TAG C、GAU D、GAT E、IAG,2001年 A型题 30、下列有关真核细胞mRNA的叙述，错误的是 A、是由hnRNA经加工后生成的 B、5末端有m7GpppNmp帽子 C、3末端有多聚A尾 D、该mRNA为多顺反子（多作用） E、成熟过程中需要进行甲基化修饰,2001年 A型题 31、下列有关反转录酶的叙述，错误的是 A、反转录酶以mRNA为模板，催化合成cDNA B、催化的DNA合成反应也是53合成方向 C、在催化DNA合成开始进行时不需要有引物 D、具有RNase活性 E、反转录酶没有35核酸外切酶活性，因此 它无校对功能,2001年 C型题 A、DNA聚合酶I B、DNA聚合酶III C、二者都是 D、二者都不是 123、具有35外切酶及53外切酶活性的是 124、在DNA复制中，链的延长上起重要作用的是,2002年 A型题 26、下列有关遗传密码的叙述，正确的是 A、遗传密码只代表氨基酸 B、一种氨基酸只是一个密码子 C、一个密码子可代表多种氨基酸 D、每个tRNA上的反密码只能识别一个密码子 E、从病毒到人，丝氨酸的密码子都是AGU,2002年 A型题 28、原核生物中识别DNA模板上转录起始点的是 A、RNA聚合酶的核心酶 B、RNA聚合酶的因子 C、RNA聚合酶的亚基 D、RNA聚合酶的亚基 E、因子,2003年 A型题 27、下列不属于DNA分子结构改变的是 A、点突变 B、DNA重排 C、DNA甲基化 D、碱基缺失 E、碱基插入,2003年 A型题 28、真核生物中，催化转录产物为hnRNA的RNA 聚合酶是 A、RNA聚合酶 B、RNA聚合酶I C、RNA聚合酶II D、RNA聚合酶III E、RNA聚合酶-亚基,2003年 A型题 29、下列属于终止密码子的是 A、UCA B、UCG C、UAC D、UAA E、UGC,2003年 B型题 A、rRNA B、mRNA C、tRNA D、hnRNA E、SnRNA 97、含稀有碱基最多的RNA是 98、既含内含子又含外显子的RNA是,基因表达调控 要 点 基因表达调控的基本概念 原核基因转录调控 真核基因转录调控,一、基本概念 （一）基因表达 指基因转录及翻译的过程 （二）基因表达的特点： 1、时间特异性 基因表达严格按特定时间顺 序发生 多细胞生物表现发育“阶段特异性”。 2、空间特异性 某基因产物按个体不同组织空 间顺序出现，即细胞（或组 织）特异性。,（三）基因表达方式： 1、组成性表达： 管家基因 生命必不可少，几乎在所有组 织细胞中持续表达的一类基因。（不受环境影响） 2、诱导和阻遏基因表达 诱导基因和阻遏基因,二、原核基因转录调节 原核生物基因组大多按功能相关性成簇地串联、密集于染色体上，共同组成一个转录单位 操纵子 （一）乳糖操纵子诱导型操纵子 1、结构,操纵序列 O 启动序列 P 上游含CAP（分解代谢物 基因激活蛋白）,调控区,调节基因 I 编码一种阻遏蛋白,结构基因,Z -半乳糖苷酶 Y 透酶 A 乙酰基转移酶,CAP（同型二聚体）,DNA结合区 cAMP结合位点,2、阻抑蛋白的负性调节 3、CAP的正性调节,4、协同调节,CAP（分解代谢基因结 合蛋白）结合位点,聚合酶进入位点,Pi启动基因,结 构 基 因,操纵基因,启动基因,调节基因,mRNA,阻抑蛋白,别乳糖 乳糖,-半乳糖苷酶 透性酶 乙酰基转移酶,Pi I P O Z Y A,乳糖操纵子结构示意图,阻抑蛋白的负调节作用,CAP结合位点,RNA聚合酶进入位点,Pi启动基因,结 构 基 因,操纵基因,启动基因,调节基因,-半乳糖苷酶 透性酶 乙酰基转移酶,Pi I P O Z Y A,CAP的正调节作用,+,cAMP,cAMP,三、真核基因调控 （一）真核基因组特点 基因组庞大 单顺反子 重复序列多 基因不连续性 （二）转录激活调节 1、顺式作用元件,顺式作用元件,正性调控作用元件,负性调控作用元件：沉寂子,启动子,增强子,（1）启动子 RNA聚合酶结合并启动转录的DNA 序列。 （2）增强子 是远离转录起始点，决定组织特异 性表达，增强启动子转录活性的特定 DNA序列。 特点 a、远距离作用，在上、下游都能起作用 b、作用与其序列的方向无关 c、对启动子没有严格专一性 d、必须与特定蛋白质因子结合才能发挥作用，具组织 或细胞特异性,（3）沉寂子（沉默子或抑制子） 2、反式作用因子： 指与顺式作用元件DNA序列相结合或间接影响 其作用的蛋白质因子，统称为转录因子。 （1）分类： 基本转录因子RNA聚合酶结合启动子所必需 的一组蛋白因子。决定转录类别。 特异转录因子为个别基因转录所必需。 （2）结构,DNA结构域 锌指 碱性亮氨酸拉链 碱性螺旋-环-螺旋 转录激活域 酸性激活域 谷氨酰胺富含域 脯氨酸富含域 蛋白质-蛋白质相互作用的结构域 二聚化结构域,三、真核基因调控 （一）真核基因组特点 基因组庞大 单顺反子 重复序列多 基因不连续性 （二）转录激活调节 1、顺式作用元件,顺式作用元件,正性调控作用元件,负性调控作用元件：沉寂子,启动子,增强子,（1）启动子 RNA聚合酶结合并启动转录的DNA 序列。 （2）增强子 是远离转录起始点，决定组织特异 性表达，增强启动子转录活性的特定 DNA序列。 特点 a、远距离作用，在上、下游都能起作用 b、作用与其序列的方向无关 c、对启动子没有严格专一性 d、必须与特定蛋白质因子结合才能发挥作用，具组织 或细胞特异性,（3）沉寂子（沉默子或抑制子） 2、反式作用因子： 指与顺式作用元件DNA序列相结合或间接影响 其作用的蛋白质因子，统称为转录因子。 （1）分类： 基本转录因子RNA聚合酶结合启动子所必需 的一组蛋白因子。决定转录类别。 特异转录因子为个别基因转录所必需。 （2）结构,DNA结构域 锌指 碱性亮氨酸拉链 碱性螺旋-环-螺旋 转录激活域 酸性激活域 谷氨酰胺富含域 脯氨酸富含域 蛋白质-蛋白质相互作用的结构域 二聚化结构域,基因重组的概念、基本过程及其在医学中的应用 癌基因的基本概念及活化机制 抑癌基因和生长因子的基本概念极其作用机制 基因诊断的基本概念、特点及应用 基因治疗的基本概念及基本程序,要 点,基因工程、癌（抑癌）基因、基因诊断（治疗）,（一）工具酶（限制性核酸内切酶） 作用特点 识别双链DNA，并在识别位点（长度一般为46个核苷酸）或其周围切割双链DNA的一类内 切酶。 切割特点： 1、3-突出粘性末端 2、5-突出粘性末端 3、平末端（钝性末端）,3,3,5,5,（二）目的基因的来源和分离 1、基因组DNA文库 2、cDNA文库 3、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction， PCR） 4、人工化学合成,聚合酶链式反应 （polymerase chain reaction PCR） 1、PCR系统的组成： 模板DNA、特异引物、dNTP、 DNA 聚合酶以及含Mg2+的缓冲液 2、基本步骤（循环三步骤）： （1）DNA解链（变性） （2）DNA单链与引物结合（退火） （3）引物的延伸（DNA的合成） 3、原理及应用（目的基因克隆、体外突变、微量分析）,（三）基因载体（克隆载体） 指能够携带外源基因进入受体细胞，并在其 中进行扩增或诱导外源基因表达的DNA分子。 表达载体指可转录，翻译成多肽链的基因载 体。 具备的条件： 能自我复制 具备筛选标志 多克隆位点（接纳外源基因） 细胞中拷贝数高,分类： 质粒载体（Pbr322，pUC19）： 共价闭合环状 DNA；自主复制并能传给子代细胞； 共存，但非宿主细胞生存必需 噬菌体载体（ 噬菌体，M13噬菌体） 柯斯质粒（cosmid）载体和酵母人工染色体载体 病毒载体（腺病毒载体，逆转录病毒载体）,pBR322质粒图谱,PVUII,PstI,Ori,Ampr,Tetr,ECoRI,BamHI,SalI,载体筛选标志 抗生素抗性,-互补,Ori,LacI,LacZ,MCS,Ampr,pUC19载体图谱,X-gal：5-溴-4氯-3吲哚-D-半乳糖苷,-D-半乳糖苷酶,-片段（基因载体LacZ ）,-片段（宿主细胞）,X-gal 培养基上生长： 白色菌落 载体LacZ有外源基因插入 蓝色菌落 载体LacZ无外源基因插入,（四）基本方法和基本过程 1、分载体和目的基因的分离 2、切工具酶的应用 3、接载体和目的基因连接成重组体 4、转重组体的转化 感受态细胞：具接受外源DNA能力的细胞 5、筛DNA重组体筛选与鉴定,A,B,A,B,内切酶,内切酶,目的基因,转化,连接,载体,载体,筛选,DNA重组技术的 基本步骤,（五）克隆基因的表达系统 1、原核表达系统 特点：无转录和翻译后加工修饰功能；易形成包涵体 2、真核表达系统,一、癌基因（oncogene） （一）癌基因（原癌基因）的基本概念 癌基因指其异常表达或其表达产物异常可决 定细胞恶性表型产生的一类基因。 在正常细胞内处非激活状态，低表达或不表达，故亦称原癌基因。 病毒癌基因（v-onc） 细胞癌基因（c-onc）,第二十一章 癌基因、抑癌基因与生长因子,癌基因产物的主要功能 src 家族 酪氨酸蛋白激酶 myc 家族 DNA结合蛋白 ras 家族 P21蛋白 sis 家族 P28蛋白和人血小板源生长因子（PDGF） myb 家族 核蛋白（核内转录因子,（二）癌基因的活化机制 1、获得启动子与增强子（插入激活） 2、基因移位 使原来无活性的原癌基因移至 某些强启动基因或增强子附近而被激活。 3、原癌基因扩增（细胞不恰当生长阶段