中药厚朴中有效成分的提取工艺研究

本科毕业论文 题 目 中药厚朴中有效成分的 提取工艺研究 专 业 化学 作者姓名 王娜娜 学 号 2011202328 单 位 化学化工学院 指导教师 孙爱玲 2015年 5月 教务处编原创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师指导下，独立进行研究取得的成果。除文中已经引用的内容外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得聊城大学或其他教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均在文中以明确的方式表明。本人承担本声明的相应责任。 学位论文作者签名： 日期： 指 导 教 师 签 名: 日期： 聊城大学本科毕业论文目 录 前 言1 1.中药有效成分提取方法1 1.1溶剂提取方法21.1.1溶剂提取方法21.1.2溶剂提取原理31.1.3溶剂的选择31.2新型提取方法31.2.1超临界流体萃取技术31.2.2微波提取法41.2.3超声波提取法41.2.4水蒸气蒸馏法41.2.5破碎提取法41.2.6酶提取法5 2.高效液相色谱法5 2.1高效液相色谱法的简介52.1.1高效液相色谱法的分类52.1.2高效液相色谱法的分离原理62.1.3高效液相色谱法的特点62.2高效液相色谱法的应用62.3高效液相色谱与气相色谱的区别73.厚朴化学成分及药理作用的研究73.1厚朴的概述73.2厚朴主要化学成分83.2.1酚类成分8 3.2.2挥发油化合物83.2.3生物碱83.2.4其它83.3药理作用83.3.1厚朴酚的药理作用83.3.2和厚朴酚的药理作用93.3.3挥发油的药理作用93.3.4厚朴中生物碱的药理作用94.实验部分94.1实验仪器94.2试剂与药材94.3色谱条件104.4提取方法104.4.1不同提取方法的比较104.4.2不同提取溶剂的比较104.4.3不同溶剂浓度的比较104.4.4不同料液比的比较114.4.5不同提取时间的比较115.实验结果与讨论115.1HPLC分离条件的优化115.2不同提取方法的比较125.3不同提取溶剂的比较135.4不同溶剂浓度的比较135.5不同料液比的比较145.6不同提取时间的比较15结论16参考文献171摘 要 对中药厚朴中化学成分厚朴酚和和厚朴酚的提取方法进行了研究，通过分别使用无水甲醇、无水乙醇、乙酸乙酯做提取溶剂，采用冷浸、超声、加热回流三种提取方法对其化学成分进行分离提取，同时改变浓度、不同料液比、不同提取时间找到最佳提取方案，采用高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography,HPLC）对有效成分的含量进行分析，从而得到最佳提取方案为:用无水乙醇做溶剂，料液比为1:15，加热回流2 h。 关键词:高效液相色谱；厚朴；超声；回流；冷浸AbstractExtraction of the active ingredient Magnolol and Honokiol in Chinese medicine Mangnolia officinalis.through the use of no water respectively methanol, ethanol, ethyl acetate for extraction solvent,the use of different methods such as cold soaking ,ultrasonic, and heated under reflux separation to extract the active ingredient through the switch to a different extraction solvent concentration . extraction time. feed liquid proportion to find the best extraction program with HPLC (High Performance Liquid chromatography, HPLC) to analyze the content of active ingredients , in order to get the best extraction method is :no water ethanol for extraction solvent, feed liquid proportion was 1:15 ,heated under reflux separation for 2 hours .Key words:HPLC;Mangnolia officinalis;Ultrasound;Backflow;Cold soak中药厚朴中有效成分的取工艺研究前 言 厚朴为木兰科木兰属乔木(Magnolia officinalis Rehd.et Wils）和凹叶厚朴(Magnolia var. biloba Rehd.et Wils）的树皮、根皮和枝皮，厚朴的树皮、根皮、花、种子及芽皆可入药，以树皮为主，为著名中药，有化湿导滞、行气平喘、化食消痰、驱风镇痛之效；种子有明目益气功效，芽作妇科药用。其主要活性成分为厚朴酚和和厚朴酚，具有多种药理作用，包括抗炎、抗心律失常、抗癫痫、抗血小板、抗制肌肉收缩和抗菌作用，此外还可以抑制氮的氧化产物，抑制肿瘤坏死因子的表达活性等。 由于其具有天然无公害的优势，以及厚朴酚既能抑制紫外线诱导的突变作用，又能抑制非直接作用的致突变源的突变作用，近来市场上一些口服药物抑制剂、化妆用品、防晒霜中均含有厚朴酚。 通过高效液相色谱法（HPLC）对厚朴中的主要成分厚朴酚和和厚朴酚进行分析，可确定其中的主要成分并能测定其含量，因此本实验通过应用HPLC法从更换实验变量方面对厚朴中有效成分的提取进行探索，同时比较不同成分的提取的效率，从而得到最佳实验方法的提取方案。实验结果表明：提取方法、提取溶剂、提取溶剂浓度、料液比、提取时间均明显地影响提取效率，通过对采取不同提取方法进行比较可得加热回流提取效果最好；而通对使用不同提取溶剂进行比较可得乙醇作为溶剂提取效果最好； 通过对提取溶剂的不同提取浓度进行比较可得无水乙醇的提取效果最好；通过对不同料液比进行比较可得料液比为1:15提取效果最好；通过对不同提取时间进行比较可得提取时间为2 h 提取效率较好，故采用2 h为最佳提取时间。1.中药有效成分提取方法 中药有着悠久的药用作用历史，我国传统文化的宝贵财富，近几年由于中药行业的快速发展，相关中药传统的提取方法包括溶剂提取法、水蒸气蒸馏法、升华法、压榨法等提取方法,还有许多新型的提取技术包括超临界提取技术、大孔吸附树脂提取技术、超声波提取技术、微波辅助萃取技术、膜分离技术、分子印迹技术、分子蒸馏技术、近红外提取等技术1。由于中药所含的化学成分通常比较复杂，一味中药可能含有上百种的化学成分，既有有效成分，又有无效成分和有毒成分2-4。结合中药制剂的特性，推广应用低耗高效、可操作性的提取方法是近几年来中药领域热门讲究的课题5。下面来介绍几种常用的提取方法： 1.1溶剂提取方法1.1.1溶剂提取方法用溶剂提取中草药的成分，常用的传统提取方法主要包括回流法、浸渍法、煎煮法、渗漉法等，其中回流法是提取最常用的方法。 (1)回流提取法 回流提取法是一种用乙醇等易挥发的有机溶剂作为提取液热浸药材，将浸出液加热蒸馏，其中易挥发性溶剂馏出后又被冷却，重流回浸出的容器中重新浸提原料，这样周而复始地循环，直至有效成分回流提取完全的方法。 回流法提取液在蒸发锅中受热时间比较长，因此不适用于受热易遭破坏的原料成分的浸出。因为其局限性，大量生产中很少被使用。(2)连续回流提取法 实验室通常用索氏提取器作连续提取装置，使用此法比回流提取法中所用溶剂少，提取成分比较完全,因此应用挥发性有机溶剂提取中草药的有效成分。以连续回流提取法为佳，但所需提取时间长，所以有效成分遇热不稳定的中药不用。(3)浸渍法一般命有热浸、冷浸、温浸等数种，将中草药粉末或碎块装入适当的容器中加入适量的溶剂，搅拌，放置，浸渍药材以溶出其成分，过滤，取滤液：为提高提取效率，滤渣可另加新溶剂进行同样操作。本法简单易行，但浸出率比较差，耗费时间较长。 (4)渗漉法渗漉法一般是指不断向已经装有中药的渗漉器中添加新有机溶剂，使有机溶剂从而自上而下地渗透过药材，从渗漉器的下部流出浸出液的一种浸出方法，在有机溶剂渗进药粉的过程中上层溶液或稀浸液便替换位置，溶出的有效成分比重就因而加大向下移动，造成良好浓度差异使扩散效果较好地进行，因此浸出效果比浸渍法优越。但在控制流速时应在渗漉的过程当中随时从药面上补充新的溶剂，直到药材中的有效成分充分浸出或渗涌液的体积相当原中药重的10倍或当渗滴液颜色极浅时，便可以确定有效成分已经基本提取完全了，不需要再加热。缺点是：耗时很长、溶剂消耗大。 (5)煎煮法煎熬发简单易行是我国最早使用的传统浸出方法，可煎出大部分有效成分，但煎出液中杂质多，且易发生霉变，一些不耐热挥发性成分易损失。药材一般宜煎2次。所用容器一般为陶瓷、沙罐或铜制、搪瓷器皿，不宜用铁锅，以免药液变色。加热最好不断搅拌，以免局部药材受热太高，导致焦糊6。1.1.2溶剂提取原理溶剂提取方法是根据中药的各种主要化学成分在有机溶剂中的溶解性质，来选用对活性成分溶解度较大，而对于不需要溶出的成分溶解度较小的有机溶剂，来将有效成分从中药组织内溶解出来的一种方法。当将溶剂加入到中药的原料中时，溶剂由于渗透、扩散的作用从而逐步通过细胞壁透入到细胞内部，进而溶解了可溶性的有效成分，造成细胞内和细胞外的浓度差异，于是细胞内的浓溶液不断向细胞外扩散，溶剂又不断从细胞外进入到中药细胞内部去，这样多次地重复，至到细胞内和细胞外溶液浓度达到了动态的平衡时为止，再将这饱和的溶液滤出来，再次多次加入新的有机溶剂，就可把所需要的主要的成分近于完全溶出了。1.1.3溶剂的选择运用溶剂提取法的关键是选择恰当溶剂。只有溶剂选择适当，才可以比较顺利地将需要的成分顺利提取出来。选择溶剂要注意以下三点：（1）溶剂对有效成分溶解度大，对杂质溶解度小；（2）溶剂不能与中药成分起化学变化；（3）溶剂要经济、易得、使用安全等。1.2新型提取方法1.2.1超临界流体萃取技术超临界流体提取法（super critical fluid extraction,SFE）是近年来刚刚兴起的提取中药中有效成分的一种新型分离技术，其基本原理是利用超临界流体具有密度大、黏度小、扩散系数大等特性来提取中药中有效成分的，后又通过改变压力改变温度，将流体变为气体从而导致对物质的溶解能力下降，从而析出提取的有效成分。超临界提取法改变了传统的提取法如水蒸气蒸馏法、溶剂提取法等所具有的提取工艺比较复杂、产品纯度低，且很容易残留有害有毒的有机溶剂等缺点，而它流程较简单、能量消耗低，而且无溶剂的残留，有效成分提取产率高、纯度好，因此SFE在中药有效成分提取工艺中有广阔的应用前景。1.2.2微波提取法微波提取法（Miacrowave-assistedextraction）是一种利用微波能将中药细胞内的有效成分提取出来的一种新型技术，其原理是微波加热促使中药植物细胞内的极性物质吸收电磁能，产生的热量促使细胞内温度上升，压力增大，将细胞膜、细胞壁冲破，形成孔洞，细胞外的溶剂通过孔洞进入细胞内，有效成分则溶解在溶剂中7的方法。微波提取法可对中草药中不同成分进行选择性加热，易于目标成分的提取，因而具有选择性。微波提取设备比较简单，使用范围较广，可用于对中药中挥发油、苷类、生物碱、多糖、黄酮、有机酸等有效成分进行提取，与传统提取方法相比具有提取的时间短、效率高、污染小、重现性好等特点，但微波提取要求中药要含有一定水分，对含水分少的细胞不易破壁，有效成分较难提取。微波对一些化合物有一定的降解作用，微波对人体，尤其是眼睛具有一定程度的危害，因此应用时应选择合理的提取条件，并注意微波的泄露和防护8。1.2.3超声波提取法超声提取法（Ultrasonic Extraction, UE）是利用超声波空化效应、机械效应和热效应等作用加速细胞内有效物质的释放、扩散和溶解，来提高提取效率的提取方法。其主要理论依据是超声的空化效应、热效应和机械作用。超声空化中微小气泡的爆裂会产生极大压力，使植物的细胞壁及整个生物体的破裂在瞬内间完成，缩短了破碎的时间，同时超声波产生的振动作用也加强了细胞内物质的释放、扩散和溶解，从而显著地提高了提取效率9。1.2.4水蒸气蒸馏法水蒸气蒸馏法一般是指将含易挥发性成分中药的碎片、粗粉，通过浸泡湿润再直火加热蒸馏或通入水蒸汽蒸馏，也可在多能式中药提取罐中对药材一边煎煮一边蒸馏，使药材中易挥发性的成分随水蒸气的蒸馏而带了出来，经冷凝后再收集馏出液的方法。有时需再蒸馏一次，来提高馏出液的浓度以及纯度，最后再收集定量的蒸馏液。但蒸馏次数不宜过多，避免挥发油中的有些化学成分氧化分解。1.2.5破碎提取法破碎提取法是使中草药在破碎提取器中加入恰当的溶剂后破碎，而得以提取有效成分10的方法。有关研究表明，此方法提取速度快且完全，不需要加热，可节省时间、能源和溶剂，这种方法虽省时且不用高温加热，但由于其提取效率并非最高因而其只限于实验的研究。1.2.6酶提取法酶法一般是指选用适当的酶，通过酶反应温和地将组织分解，加速有效成分的释放的一种方法。中草药成分有有效成分和非有效成分，这些非有效成分不仅仅会影响中药有效成分的浸出,而且还会影响中药液体制剂澄清度，可通过选用适当的酶,使非有效成分分解提高有效成分浸出率和液体制剂质量。工业用酶在中药的提取过程中已取得了较好的效果,回收率高,应用潜力大。 2.高效液相色谱法2.1高效液相色谱法的简介 高效液相色谱法最早是由俄国植物学家茨维特(Tswett)在1906年研究碳酸钙分离植物色素时发现的色谱法(Chromatograpby)而得名。后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。 高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography HPLC）11又称“高分离度液相色谱”、“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“近代柱色谱”等。其是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型的分析分离技术，随着技术的不断发展与改进，高效液相色谱法现在已经成为应用极为广泛的化学分析分离技术12，在技术上采用高效固定相、高灵敏度、高压泵的检测器，在经典的液相色谱的理论基础之上，引入气相色谱理论，而发展起来的一种技术，因此有效率高、灵敏度高、操作自动化、速率快等等特点。而且该法已在医学、化学、工业、商检、农学、法检等学科领域被广泛的应用。 2.1.1高效液相色谱法的分类(1)按固定相聚集状态可以分为液液色谱法和液固色谱法两大类。(2)按分离机制可分为液-液色谱法、液-固色谱法、离子交换色谱法、空间排阻色谱法、化学键合相色谱法、离子对色谱法、离子色谱法等类别。其中，化学键合相色谱中的反相键合相色谱应用最广，使用最广的反相键合相是十八烷基键合相，即碳十八烷基（C18H37）键合到硅胶表面。这种键合相又称ODS(Octadecylsilyl)键合相，如国产的YWG-C18等，本实验就是用的该键合相。(3)按流动相的压强可分为高效液相色谱法和超高效液相色谱法两大类。2.1.2高效液相色谱法的分离原理高效液相色谱法是在经典的液相色谱法基础之上发展起来的。其也是在高压的条件下溶质在流动相和固定相之间进行的一种连续的多次交换过程，是借住溶质在两相之间分配系数的吸附力、亲和力或分子大小不同而引起排阻作用的差异使不同溶质得以分离13的方法。2.1.3 高效液相色谱法的特点高效液相色谱法具有“四高一广”的特点14：(1)高压：液体流动相流经色谱柱所受阻力较大，为了使载液迅速通过色谱柱，必须对其加高压。(2)高速：分析速度快、载液流速快，较经典液体色谱法速度快得多，通常分析在1小时以内均能完成。(3)高效：分离效能高。可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。 (4)具有很高的灵敏度：紫外检测器高达0.01 ng，进样量也很少。(5)应用范围十分广泛：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是强极性、高沸点、大分子、热稳定性差的化合物的分离分析更具有显著优势。此外高效液相色谱还有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等优点，缺点也存在，就是“柱外效应”。从进样开始到检测器之间，除柱子以外任何的死空间（柱接头、进样器、检测池和连接管等），要是流动相的流型有所变化，被分离的物质的任何滞留和扩散都会有明显地导致色谱峰加宽的现象，柱效率也会降低。高效液相色谱检测器的灵敏度不如气相色谱。 2.2高效液相色谱法的应用(1)药物分析中药质量控制，抗生素质控分析，生化药质量控制，化学药物质量控制，新型高效手性药物中手性对映体含量的测定等。(2)环境污染物的分离与测定大气、土壤水、食品中的多环芳烃、多环联苯，有机磷农药、有机氯农药，阴离子表面活性剂，酚类胺、黄曲霉毒素类，除草剂等污染物的分离与测定。(3)食品质量分析兽药残留，农药残留；防腐剂、人工合成色素、抗氧化剂等食品添加剂的分离与测定，保健食品中有效成分的检测，真菌毒素分析等。(4)前沿生命科学分析生物技术的药物纯化及其鉴定，DNA电泳与色谱分析，生物标志物色谱分析，蛋白质组学研究等。(5)精细化工在精细化工生产过程当中使用的具有较高沸点、较高分子量的有机化合物，如高碳数的脂肪族或芳香族的醇、醛、酮、酯、酸、醚等化工应用原料，以及用于各种表面的活性剂、农业药剂、医用药物、燃料、炸药等工业产品的分离与测定。2.3高效液相色谱与气相色谱的区别(1)液相色谱可完成难度较高的分离，是因为液相色谱固定相类型多，分析时可选择的余地大，气相色谱则不可能；液相色谱室温下便可操作，低温利于色谱分离。(2)液相色谱不受试样和热稳定性的限制，适合相对分子质量大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质的分离、分析，而气相色谱仅可以分析在操作温度下气化而不分解的物质，即气体和沸点较低的化合物。(3)液相色谱试样制备简单，且回收试样也容易，可用于大量制备。3.厚朴化学成分及药理作用的研究 3.1厚朴的概述 木兰科植物厚朴（Magnolia officinalis Rehdet Wils）或凹叶厚朴（Magnolia biloba Rehdet Wils）的干燥干皮、根皮及枝皮。厚朴也是我国的重要的传统的中药，在东汉时期的著作神农本草经中将厚朴列为上等品，水香顺气丸、鳖甲煎胶囊、保济丸、香砂养胃丸、等传统中药均以厚朴为主药。厚朴性温味苦辛，入脾、胃、肺、大肠经，主要治湿滞伤中、食积气滞、脘痞吐泻、腹胀便秘、痰饮喘咳15，为中华人民共和国药典1990年版收载。 我国对厚朴的应用有着悠久历史，其记载了：治中风、伤寒、头痛、寒热、惊悸、气血痹、死肌的药用作用。明时的李时珍也在本草纲目中记载了有关厚朴朴树肤白肉紫，结之果实如冬青，子生青熟赤，有核，味甘美的内容。日华子本草在炮制方面也记载有沿用至今的去粗皮，姜汁炙或浸炒用等方法。 3.2厚朴主要化学成分厚朴中主要的有效化学成分含有酚类、挥发油类、生物碱类及其它类化合物。3.2.1酚类厚朴中酚类成分有:厚朴酚（magnolol）、和厚朴酚（honokiol)16、去三羟基厚朴酚、三羟基厚朴酚，其中以厚朴酚、和厚朴酚为主要成分，约占材料的512。其中厚朴酚、和厚朴酚的化学式分别为： 3.2.2挥发油化合物目前报道的厚朴挥发油中已分离到的成分如下：桉叶醇、聚伞花素、石竹烯、反丁香烯等17-19。最主要成分为桉叶醇，占挥发油总量的4050。桉叶醇是-桉叶醇和-桉叶醇的混合物，化学式分别是： 3.2.3生物碱厚朴中含有木兰箭毒碱16、氧化黄心树宁碱。3.2.4其它厚朴中还含有少量皂苷、鞣质。3.3药理作用3.3.1厚朴酚的药理作用 厚朴酚具有持久的、明显的中枢神经抑制，中枢性肌肉松弛抑制的作用，抗菌，抗炎，抗溃疡，抗病原微生物，抗肿瘤，抗氧化，抑制吗啡戒断反应，也有抑制血小板聚集等药理作用，还可用于治疗细菌性或阿米巴痢疾，急性肠炎，慢性胃炎等20-24。其中在抗菌作用的方面，厚朴酚对丝状真菌、格兰氏阳性菌、耐酸性菌有明显的抗菌活性作用，还对变形链球菌有明显抗菌的作用，然而对葡萄球菌的抑制作用却是最强的。临床上主要用作镇静中枢神经、消除胸腹满闷、运动员肌肉松弛、抗溃疡、抗真菌等药，其中有些药理作用和和厚朴酚相同。 3.3.2和厚朴酚的药理作用和厚朴酚具有持久的、明显的中枢神经抑制，中枢性肌肉松弛的作用，抗炎，抗菌，抗溃疡，抗病原微生物，抗氧化，抗肿瘤，抗衰老，降低胆固醇等药理作用，用于治疗急性肠炎，慢性胃炎，细菌性或阿米巴痢疾等25-27。其中，在抗菌作用的方面，厚朴酚对格兰氏阳性菌、丝状真菌、耐酸性菌有明显的抗菌活性，对变形链球菌有更加明显的抗菌作用，然而对葡萄球菌的抑制作用才是最强的。临床上主要用作消除镇静中枢神经、胸腹满闷、运动员肌肉松弛、抗溃疡、抗真菌等药。如今和厚朴酚新的用途可以拓展到精神类的疾病。3.3.3挥发油的药理作用厚朴挥发油成分具有发干、镇痉、平喘、去谈等作用28以及对肾上腺髓质细胞分泌的儿苯酚胺具有抑制作用29。 3.3.4厚朴中生物碱的药理作用 具有剧烈的箭毒样骨骼肌松弛作用与降压作用30。4.实验部分 4.1实验仪器UltiMate300型HPLC色谱仪。包括U-300输液泵，DAD-300紫外检测器；Chromeleon 7.1色谱工作站；KQ3200型超声清洗器(Ultrasonic Cleaning Machine，济宁科技源超声波设备有限公司)；HH-6型数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)；WK-1000A型高速药物粉碎机(中国山东青州市精诚机械有限公司)，抽滤瓶，25 ml容量瓶（天津BEI FANG）；抽虑瓶；50 mL圆底烧瓶；AR1140电子天平(MaxCap:110 g,Readability:0.0001 g)。4.2试剂与药材用于样品提取的试剂有无水甲醇、无水乙醇、乙酸乙酯；HPLC检测的试剂（甲醇）为色谱纯试剂；实验用水为二次蒸馏水、娃哈哈纯净水；厚朴药材购于聊城利民大药店。 4.3色谱条件色谱柱:C18柱(250 mm 4.6 mm I.D,5 m)；流动相：甲醇：水=73:27（V/V）；等度洗脱20 min，进样量10 L，流速1 mL/min；检测波长：254 nm；柱温：室温。4.4提取方法将厚朴药材粉碎，分别按照以下方法进行提取：4.4.1不同提取方法的比较(1)精确称取厚朴药材粉末1.0067 g，于100 ml锥形瓶中，加入10.0 ml无水乙醇，室温下冷浸0.5 h；(2)精确称取厚朴药材粉末1.0152 g，于100 ml锥形瓶中，加入10.0 ml无水乙醇，超声波提取0.5 h； (3)精确称取厚朴药材粉末1.0076 g，于50 ml圆底烧瓶中，加入10.0 ml无水乙醇，设定温度为75 加热回流0.5 h。4.4.2不同提取溶剂的比较(1)精确称取厚朴药材粉末1.0032 g，于50 ml圆底烧瓶中，加入10.0 ml无水甲醇，设定温度为75 加热回流0.5 h；(2)精确称取厚朴药材粉末1.0076 g，于50 ml圆底烧瓶中，加入10.0 ml无水乙醇，设定温度为75 加热回流0.5 h；(3)精确称取厚朴药材粉末1.0048 g，于50 ml圆底烧瓶中，加入10.0 ml无水乙酸乙酯，设定温度为75 加热回流0.5 h。4.4.3不同溶剂浓度的比较(1)精确称取厚朴药材粉末1.0014 g，于50 ml圆底烧瓶中，加入10.0 ml40%乙醇，设定温度为75 加热回流0.5 h；(2)精确称取厚朴药材粉末0.9996 g，于50 ml圆底烧瓶中，加入10.0 ml60%乙醇，设定温度为75 加热回流0.5 h；(3)精确称取厚朴药材粉末1.0051 g，于50 ml圆底烧瓶中，加入10.0 ml80%乙醇，设定温度为75 加热回流0.5 h。(4)精确称取厚朴药材粉末1.0076 g，于50 ml圆底烧瓶中，加入10.0 ml无水乙醇，设定温度为75 加热回流0.5 h；4.4.4不同料液比的比较(1)精确称取厚朴药材粉末1.0030 g，于50 ml圆底烧瓶中，加入5.0 ml无水乙醇，设定温度为75 加热回流0.5 h；(2)精确称取厚朴药材粉末1.0042 g，于50 ml圆底烧瓶中，加入10.0 ml无水乙醇，设定温度为75 加热回流0.5 h；(3)精确称取厚朴药材粉末1.0056 g，于50 ml圆底烧瓶中，加入15.0 ml无水乙醇，设定温度为75 加热回流0.5 h；(4)精确称取厚朴药材粉末1.0033 g，于50 ml圆底烧瓶中，加入20.0 ml无水乙醇，设定温度为75 加热回流0.5 h。4.4.5不同提取时间的比较(1)精确称取厚朴药材粉末1.0056 g，于50 ml圆底烧瓶中，加入15.0 ml无水乙醇，设定温度为75 加热回流0.5 h；(2)精确称取厚朴药材粉末1.0033 g，于50 ml圆底烧瓶中，加入15.0 ml无水乙醇，设定温度为75 加热回流1 h；(3)精确称取厚朴药材粉末1.0039 g，于50 ml圆底烧瓶中，加入15.0 ml无水乙醇，设定温度为75 加热回流1.5 h；(4)精确称取厚朴药材粉末1.0046 g，于50 ml圆底烧瓶中，加入15.0 ml无水乙醇，设定温度为75 加热回流2 h；(5)精确称取厚朴药材粉末1.0032 g，于50 ml圆底烧瓶中，加入15.0 ml无水乙醇，设定温度为75 加热回流2.5 h。上述提取液定容于25 ml容量瓶中，再用0.45 m滤膜过滤，待测（注意：不同溶剂的比较中乙酸乙酯需要旋蒸后用甲醇溶解后定容）。5.实验结果与讨论 5.1 HPLC分离条件的优化色谱柱:C18柱(250 mm 4.6 mm I.D,5 m)；流动相：甲醇：水=73:27（V/V）；等度洗脱20 min，进样量10 L，流速1 mL/min；检测波长：254 nm；柱温：室温。 下面的每一个图中峰1：和厚朴酚；峰2：厚朴酚。图1 厚朴粗提物的HPLC图 5.2不同提取方法的比较为了选择合适的提取方法，考察不同提取方法对厚朴中两种化学成分的提取效率的影响。使用无水乙醇为提取溶剂，分别采用冷浸、超声、回流0.5 h提取，提取液经0.45 m滤膜过滤后，用HPLC进行检验，结果见表1。表1 不同提取方法对应各色谱峰面积 提取方法冷浸超声回流峰1/mAu*min8.392812.636421.7305峰2/mAu*min74.0782103.0541162.5040图2 不同提取方法对应峰面积从上图可以看出：相同的提取溶剂和时间，不同的提取方法对提取效率有显著的影响。由峰面积的大小可以确定加热回流的提取效率最高，超声的提取效率次之，冷浸的提取效率最低，所以最佳方法是加热回流。5.3不同提取溶剂的比较 为了选择合适的提取溶剂，考察不同溶剂对厚朴中两种化学成分提取效率的影响，分别采用无水甲醇、无水乙醇、乙酸乙酯为提取溶剂加热回流提取0.5 h，提取液经0.45 m滤膜过滤后，用HPLC进行分析，结果见表2。表2 不同提取溶剂对应各色谱峰面积 提取试剂无水甲醇无水乙醇乙酸乙酯峰1/mAu*min17.467221.730512.4713峰2/mAu*smin143.4038162.504096.4713图3 不同提取溶剂对应峰面积从上图可以看出：相同的提取时间和方法，不同的提取溶剂对提取效率有影响。由峰面积的大小可以确定提取厚朴中化学成分的最佳溶剂为乙醇，所以采用乙醇作为溶剂效果最好。 5.4不同溶剂浓度的比较为了选择合适的乙醇提取浓度，考察不同浓度的乙醇对厚朴中两种化学成分的提取效率的影响。分别采取40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇、无水乙醇为溶剂加热回流提取0.5 h，提取液经0.45 m滤膜过滤后，用HPLC进行分析，结果见表3。 提取试剂40%乙醇60%乙醇80%乙醇无水乙醇峰1/mAu*min11.975116.987618.683821.7305 峰2/mAu*min92.1764126.7011128.2209162.5040表3 不同浓度提取溶剂对应各色谱峰面积图4 不同浓度提取溶剂对应峰面积从上图可以看出：相同的提取方法、提取时间和提取溶剂、不同浓度的提取溶剂对提取效率也有影响。由峰面积的大小可以确定无水乙醇提取厚朴中化学成分的效果最佳。5.5不同料液比的比较为了选择合适的料液比，考察不同料液比对厚朴中两种化学成分的提取效率的影响。用无水乙醇为溶剂，分别采取1:5、1:10、1:15、1:20的料液比加热回流提取0.5 h，提取液经0.45 m滤膜过滤后，用HPLC进行分析，结果见表4。表4 不同料液比对应各色谱峰面积料液比mL/g1:51:101:151:20峰1/mAu*min11.665013.932315.200414.9489峰2/mAu*min115.8181123.7015150.8921128.7396图5 不同料液比对应峰面积从上图可看出：用相同的提取方法、提取时间和提取溶剂加热回流，随料液比的不同，提取的效率有很大差异。通过峰面积的大小可知料液比为1:15时提取效率最佳。5.6不同提取时间的比较为了选择合适的提取时间，考察不同的提取时间对厚朴中两种化学成分的提取效率影响。使用无水乙醇为溶剂，料液比为1:15，分别加热回流0.5 h、1.0 h、1.5 h、2 h、2.5 h，提取液经0.45 m滤膜过滤后，用HPLC分析，结果见表5。提取时间0.5h1h1.5h2h2.5h峰1/mAu*min15.200417.132820.004522.043422.1323峰2/mAu*min150.8921160.6722166.3349177.2266178.2654表5 不同提取时间对应色谱峰面积图6 不同提取时间对应峰面积从上图可看出：相同的提取方法法、料液比、提取溶剂加热回流不同的时间对提取效率也有影响，当提取时间为2 h时，厚朴中有效成分提取效率最大，此后随着时间的延长，有效成分提取率虽然有增长的趋势，但增长不多，从节约时间的角度考虑，选择每次提取时间为2 h作为最佳提取时间。结论本实验使用HPLC分析中药化学成分的方法，研究厚朴中有效成分的提取方法(1)用冷浸、超声、回流三中提取方法，用无水乙醇为提取溶剂，考察不同提取方法对厚朴有效成分提取效率的影响，综合考虑两种成分的提取效率得出加热回流为最佳提取方法。(2)分别以无水甲醇、无水乙醇、乙酸乙酯为提取溶剂加热回流提取，考察不同提取溶剂对厚朴有效成分提取效率的影响，综合考虑两种成分的提取效率得出无水乙醇为最佳提取溶剂。(3)分别以40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇、无水乙醇为提取溶剂加热回流提取，考察不同乙醇浓度对厚朴有效成分提取效率的影响，综合考虑两种成分的提取效率得出无水乙醇为最佳提取浓度。(4)以无水乙醇为提取溶剂，分别采取1:5、1:10、1:15、1:20的料液比加热回流提取，考察不同料液比对厚朴有效成分提取速率的影响，综合考虑两种成分的提取效率得出1:15为最佳提取料液比。(5)分别以无水乙醇为提取溶剂提取不同的时间，考察不同提取时间对厚朴有效成分提取效率的影响，综合考虑两种成分的提取效率得出加热回流2 h为最佳提取时间。综上，建立了厚朴有效成分的最佳提取方法：无水乙醇为提取溶剂，料液比为1:15，加热回流2 h。20参考文献1 张焱，邢细红，谢蕊繁，白花蛇舌草对人胶质瘤细胞增殖及凋亡的影响及其机制，中华实验外科杂志，2010, 27(11) : 169316952 黎明，傅若农等，高效逆流色谱在植物有效成分分离中的应用J. 药物分析杂质，1998, (1) : 60-65.3 蔡艳华，赵红卫等，中草药中生物碱的提取与分离J. 四川化工，2005, 8(1) : 39-42.4 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