植物生长素除草剂作用机理和模式的现状

生长素除草剂作用机制的研究现状和作用方式克劳斯格罗斯曼摘要：人工合成的化合物如植物激素“超级植物生长素”是最成功的除草剂，已在农业中使用超过六十年。这些所谓的植物生长素除草剂在植物学上比天然植物生长素吲哚乙酸（IAA）稳定，并表现出系统机动性和选择性作用，有倾向性的防治禾谷类作物中的双子叶杂草。它们属于不同的化学类别，其中包括：苯氧基羧酸类、苯甲酸类、嘧啶羧酸类、芳香羧甲基衍生物和喹啉羧酸类。最近植物生长素感受器的识别和作用于植物生长素、乙烯和脱落酸生物合成的上流调节信号传输的新激素的发现解释了植物生长素除草剂调节反应的大部分机理，其中植物生长素除草剂调节反应包括敏感性双子叶植物的生长抑制、衰老和组织腐烂。也能防止杂草的喹啉羧酸类二氯喹啉酸引起了不常见现象。目前，我们从二氯喹啉酸刺激乙烯生物合成中最终推断出组织氰化物的累积水平，组织氰化物在诱发敏感性杂草的除草剂症状起到关键作用。关键词：脱落酸；植物生长素除草剂；植物生长素信号传输；氰化物；乙烯1 前言在高等植物中，新陈代谢、生长、形态建成以及对生物和非生物因素的反应的协调受称作植物激素的信号传输分子的调节，而植物激素是通过作用于称作受体的特殊受体蛋白产生影响的。植物生长素是植物激素中一个重要类别，包括高等植物中的最重要天然植物生长素吲哚乙酸（IAA）以及和吲哚乙酸一样能引起相同反应的内生性分子1-2。由于IAA几乎影响植物生长发育的各个方面，因此IAA被认为是与其他植物激素相互作用的复杂网络中的“主激素” 3。植物生长激素一般调节细胞分裂和伸长以及发育过程，包括维管组织和花分生组织分化、叶起始、叶序、衰老、顶端优势和根形成。植物生长激素也是热带反应的基本要素。 早在20世纪40年代，大学和工业的实验室都能合成一系列IAA的衍生物，包括1-萘醋酸（1-NAA）和苯氧基羧酸类2-甲基-4-氯苯氧乙酸（MCPA）和2，4-二氯苯酚乙酸（2，4-D），这些都是那时从大多数植物生长素活性分子中测定出来的4-7。这些衍生物和IAA一样能引起相同类型的植物反应，但是有长效性和较高的作用强度，具体地说，这是由于它们在植物中的高稳定性。天然植物激素如IAA在植物中可通过结合和降解多重路径使其快速失活。当在细胞作用位点有较低浓度时，它们刺激生长发育过程。当浓度提高和植物生长素在组织中活跃，植物生长就会受到干扰以及植物受到致命损伤。因此，植物生长素系统通过这些合成的类似物进行的化学调控对探索植物生长素功能的基础研究8以及应用方面有相当重要的作用。合成激素不仅作为生长调节剂来提高园艺和农业上的产量以及作为组织培养和植物微细增殖的媒介组分10，也作为除草剂来控制杂草5-7。随着二战后世界市场的推广，这些所谓的生长调节剂或者植物生长素除草剂2，4-D和MCPA开启了现代农业中杂草控制的新纪元。它们发挥选择作用，有倾向性的防治禾谷类作物中的双子叶杂草，而且在植物中能被系统的传输。多年以来，不同化学种类的拥有不同杂草防治范围和选择性类型的植物生长素除草剂已被合成并进行商业推广。目前，这些种类包括苯氧基羧酸类、苯甲酸、嘧啶羧酸类、芳香羧甲基衍生物、喹啉羧酸类（图1）。非植物性毒素分子的新陈代谢和靶标对化合物的敏感性在单子叶植物和双子叶植物间以及双子叶中的植物生长素除草剂的选择性差异中起主要作用4-6。作为植物生长素活动的的一个结构要求，离解分子羧基上的强负电荷，是从有相当距离的平面苯环上弱正电荷分离开的，这看起来是必要的。除了浓度效应，合成的植物生长素的生物活性波谱取决于组织的敏感性，而组织敏感性是由组织类型、生理阶段和植物种类决定的，并很有可能受不同信号转导路径的调节。当作为除草剂使用时，能模拟组织中IAA浓度较高而产生的植物变形和抑制植物生长的效应4-7，而在转基因的，IAA生成过多的植物上也能观察到这种效应12。我们描述这种现象为植物生长素过量或者是内源性生长素浓度过量，这会导致生长素的稳态调控失衡以及在组织中与其他激素交互作用的失调。但是，自从吉尔伯特在194613阐述植物生长素除草剂引起易染病植物的“自生自灭”，这个假说一直到现在也很流行，主要是由于我们观察到生长畸形的情况以至后来的灾难性后果。此时，植物新陈代谢持续的刺激被认为通过改变细胞分裂和扩张引起生长的反常，导致相关植物生长结构的变形14。但是，在植物生长抑制和死亡背后有一个特殊的作用机理和模式，这是由于大多数植物生长素除草剂高水平的物种选择性引起的，加上它们的快速以及一些情况下立体选择性反应（例如，除草剂活性分子（+）-D-对映体如滴丙酸）在较低的应用率6。2 生长素过量和生长的反常2.1 代谢和生理过程我们仔细观察植物生长素在组织中浓度增加以及在植物中的梯度分布的整个事件的时间过程，由植物生长素除草剂或者高浓度的IAA引起的植物生长抑制可分为三个阶段4,5,7,14。图2中，以文献中报道的数据为背景的双子叶杂草猪殃殃证明了这些过程。首先是刺激阶段，这会在使用后的前几个小时出现。这一阶段包括代谢的活化过程比如通过感应芽中合成的1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）会刺激乙烯的生物合成（12h），之后是正常（解除控制）生长的现象（34h），包括叶的偏上生长、组织膨胀以及开始茎卷曲。今天我们知道细胞伸长反应包括膜离子通道和质膜氢泵数分钟内激活的反应。随后，在58小时后我们会在芽组织中最初检测到脱落酸（ABA）的积累。第二个阶段会在24h内发生，包括抑制根的生长一直延伸到芽，伴随节间生长的减缓和叶面积的减小，以及增强绿叶色素的沉淀。附随地，我们观察到气孔关闭，紧随其后是蒸腾作用、碳同化、淀粉形成量下降以及活性氧产量过剩。第三个阶段是衰老阶段，组织衰老的特点是通过叶绿体损伤和高发萎黄病加速叶的衰老，以及通过破坏膜和维管系统的完整性导致萎焉、坏死最终使植物死亡。因此，刺激和随后的抑制阶段都适用于代谢和生长，最后导致的植物生长素除草剂的植物性毒素效果，是由于植物生长素除草剂在组织中持续高强度的作用引起的。从分子学角度看，生长素受体接收大量感应，这会调整基因表达同时会加快细胞伸长反应中膜离子通道和质膜氢泵的激活，由于超过内源性生长素最适浓度我们认为是除草剂作用的目标进程4,7,15。2.2 生长素感应，信号传输和基因表达数十年来，生长素分子生物学研究的目标集中在调节转录和生长素生物化学反应的受体的识别上。在20世纪80年代，生物化学路径显示生长素结合蛋白1（ABP1）是一个候选受体，这借助于生长素结合蛋白的生长素结合活性1,2,15。后来，拟拟南芥突变体的遗传屏障是生长素的抑制作用或者生长素传输抑制因子，而生长素抑制因子也使包括生长素信号传输和生长素抑制因子反应T1R1的一些遗传轨迹明确1,2,15。最近识别出T1R1蛋白是生长素感应的受体16-19以及发现生长素、乙烯信号传输中新的膜反应和脱落酸生物合成中9-顺式-环氧类胡萝卜素双氧酶（NCED）的上流调节解释了大部分的植物生长素除草剂调节反应（图3）。图2. 以文献中报道的数据为背景的双子叶杂草猪殃殃根吸收生长素和分布于植物后证明了生长素除草剂作用的三个阶段的反应。F-box蛋白T1R1是Skp1-cullin-F-box蛋白（SCF）E3泛素连接酶的识别组分，而E3泛素连接酶是蛋白质降解的蛋白酶体途径的一部分16,18。Aux/IAA转录阻遏蛋白T1R1底物，以生长素依赖的方式受用于T1R1。与T1R1捆绑后，阻遏蛋白就会降解16,18,21。这种作用的晶体分析表明IAA连接到相同T1R1结合域的底部，在IAA顶部的Aux/IAA蛋白占据剩余的T1R1结合域19。在这方面，IAA功能是作为“分子胶”提高T1R1-Aux/IAA蛋白的相互影响。为了证明T1R1是感应植物生长素的主要受体，我们也测试了合成的生长素类似物IAA、2,4D和1-NAA。T1R1对这些合成的生长素类似物也有绑定和功能性反应16,18。另外，与生长素类似物IAA、2,4D和1-NAA结合的T1R1的晶体结构表明IAA绑定到T1R1受体底部局部杂乱结合域，该结合域也能容纳合成的植物生长素19。有趣的是IAA紧密的绑定到T1R1，其中包括侧链羧基绑定和环式绑定。T1R1的计算机结构模型表明合成的其他植物生长素种类，包括苯甲酸麦草畏以及喹啉酸二氯喹啉酸和喹草酸，也适合绑定到受体空腔。最后，IAA和合成的生长素绑定到T1R1使Aux/IAA阻遏物和受体间的相互作用稳定并引起SCF T1R1复杂共价键绑定到Aux/IAA泛素结合蛋白，我们会通过26S蛋白酶体标记Aux/IAA泛素结合蛋白作为降解底物16,18,19。Aux/IAA阻遏蛋白的损失导致先前绑定到转录活体蛋白（生长素反应因子ARFs）的DNA抑制解除。ARFs不断激活生长素对应基因的转录，包括这些乙烯合成中的1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶和组织中生长素浓度保持高浓度时反馈抑制的Aux/IAA阻遏因子21,22。拟南芥基因组编码5个T1R1同系物。其中三个生长素绑定F-box蛋白AFB1、AFB2、AFB3也能调节生长素反应17。因此，拟南芥tir1、afb1、afb2、afb3四倍体幼苗对生长素是不敏感的并呈现出一些发展和形态学的表型。这表明四种同系物共同调节植物对IAA和2,4-D的反应。另外，我们发现突变后的T1R1同系物AFB5有抗性，特别是对2-吡啶甲酸类型的植物生长素除草剂，但对2,4-D或者IAA的交叉抗性最低23。这表明不同种类的植物生长素除草剂的化学特性主要是通过不同的生长素受体蛋白来调节。然而，至于T1R1受体家族能否解释生长素的全部的不同化学信号和基于组织敏感性、生理阶段、植物生物型和种类的生物活性的问题仍然存在。这也包括关于生长素除草剂的选择性是否以单子叶和双子叶植物中不同受体为基础的问题。Aux/IAA阻遏蛋白和ARF转录因子的多样性和组织特异性能解释过剩的生长素特异反应22,24。另外，多数植物生长素作用是通过转录调节的，因此与T1R1受体家族有联系。但是，由于快速的生长素反应，如细胞扩张是生长素诱导离子流的产生，我们讨论有一个额外的信号传输途径，可能是通过膜结合生长素绑定蛋白1（ABP1）相关蛋白2,24。ABP1可能是细胞分裂和扩张的协调者，局部生长素水平会影响ABP1的效果25。图3.提出的植物生长素除草剂作用机理和方式以及在双子叶植物种类中植物激素吲哚-3-乙酸（IAA）超过最适内源性浓度。植物生长素除草剂被T1R1/AFB生长素受体感知，而F-box蛋白小家族包括转运阻遏蛋白1（T1R1）和同系物生长素绑定F-box（AFB）蛋白，其中AFB是Skp1-cullin-F-box protein (SCF)E3泛素连接酶底物的F-box识别组分。生长素通过泛素蛋白酶体途径绑定靶标Aux/IAA转录阻遏蛋白到SCFTIR1/AFBsE3连接酶来降解。Aux/IAA阻遏物的得丢失使转录活性蛋白生长素反应因子的抑制解除，而生长素反应因子激活生长素反应蛋白的转录。在芽中，特别是乙烯合成中的1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）基因和脱落酸（ABA）生物合成中9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶（NCED）基因都过量表达。产生的乙烯引起叶和组织向下弯曲，并通过抑制生长素的运输来调节生长素的量。同时，生长素引起茎的水平弯曲。现在，在细胞膨胀过程中生长素迅速引起离子流的现象被认为是受膜结合生长素绑定蛋白1（ABP1）的调节。乙烯刺激NCED转录后活性，导致ABA持续的合成。NCED催化叶黄素裂解，导致黄氧素和ABA产量的升高。ABA分布在植物中并能引起气孔关闭而限制蒸腾作用和碳同化作用，同时伴随着活性氧（ROS）生产过剩。另外，ABA直接抑制细胞分裂和膨胀，和乙烯一起促使叶衰老和叶绿体损伤以及膜和维管系统的破坏。生长抑制、组织变干腐烂以及植物死亡是最后的结果。在敏感的稻科植物中，当二氯喹啉酸刺激乙烯生物合成中组织中的氰化物作为副产物而积累。SAM表示S-腺苷甲硫氨酸；-CAS表示-氰丙氨酸合酶2.3 激素间相互作用和生长反应最近发现的与生长素除草剂有关的T1R1/AFB受体或者丰富的转录因子和生长素反应基因的过表达引起的高浓度的IAA，相互间会导致随后的一系列与除草剂作用有关的生理生化反应（图3）。由此而论，ACC的过量刺激以及在生物合成中通过诱导 ACC合成而有乙烯形成使我们早已明晰和普遍存在的反应，当生长素应用于敏感性种类和在转基因植物中过量生产的时候5,6,26。ACC合酶亚型是由属于早期生长素反应基因的ACS多基因家族编码的。他们被有区别的表达或转录后加工或者由IAA调节转录后加工，生长素除草剂应用的几分钟里。植物生长素诱导ACC合成引起ACC浓度的升高，紧接着是提高乙烯的产量。在实验中使用含有ACC合成反义基因LE-ACS227，基因西红柿和生长素抑制或者乙烯不敏感型植物（拟南芥、十字花科植物、西红柿），除草剂诱导的态特征会减弱或者是完全的颠倒。乙烯是一种气态激素其参与植物的压力反应并调节植物的衰老和生长28。乙烯通过把微管从横向调节到纵向来促进侧面细胞的扩展，这会导致根和茎的膨胀。另外，受到刺激的乙烯会调节植物生长素的影响如叶的脱落和偏上性生长，通过乙烯抑制生长素运输来调节生长素水平。因此，生长素诱导乙烯爆发会导致生长的不正常和衰老（图3）5,6,28。生长受到抑制主要原因和对生长素的植物性毒素的实际情况可能是因为脱落酸的过量生产6,29。生长素诱导ACC合成和乙烯生成后会出现根部ABA的积累而在芽中更多，是可控浓度的70倍30。从不同的化学种类中证明与根和茎生长紧密相关的ABA诱导可作为植物生长素除草剂以及不同双子叶植物中的IAA，包括茜草科、茄科、伞形科、豆科、玄参科和旋花科31,32。相反，有自然忍受力的作物种类对ACC合成和ABA水平不敏感，这表明大概在受体位点是存在选择作用的6,31。先以高敏感的双子叶植物猪殃殃为例，IAA和植物生长素除草剂引发ABA生物合成的开始。在猪殃殃细胞悬浮液中，在处理后3小时就会出现ABA浓度的升高，这表明紧接着信息素信号就会出现反应6。分析路径中间体表明在芽中通过提高叶黄素分裂可诱导ABA生物合成，这会导致ABA前体黄氧素的产量增加。这条途径关键步骤受NCED基因家族编码的质体酶NCED催化的。生物合成上使用抑制剂和在感知或者在乙烯、ABA合成中有缺陷的番茄突变体，这些研究表明生长素诱导乙烯生成可能会引发ABA的积累6,32。最近，我们调查了猪殃殃中生长素诱导GaNCED1基因的表达和乙烯、ABA的生物合成的时间过程20。用包括喹草酸、麦草畏、氨氯吡啶酸（图1）等不同化学种类的IAA和生长素除草剂处理根部1h，唯独导致芽中GaNCED1 mRNA含量短暂增加。处理后三小时后，转录物含量达到最大值是可控水平的40倍，随后转录物含量会减少。在这期间，在芽中水含量和渗透势没有改变，这表明通过生长素调节膨压变化不会使GaNCED基因表达升高。在ABA升高前会有2h的停滞期，在24h后其浓度会达到可控水平的24倍。有趣的是，GaNCED1转录物含量的升高先于ACC合酶，ACC和乙烯的产生。因此，乙烯或者ACC并不是激活NCED基因的主要引发物。与此一致，在乙烯生物合成中使用抑制剂只会对GaNCED1基因有轻微影响。但是，乙烯抑制剂会明显降低生长素诱导的ABA的积累，这表明生长素诱导乙烯生成要求ABA的积累但NCED基因表达中起到的作用较小20。总之，IAA和生长素除草剂除了会刺激乙烯生物合成中的基因表达，也会直接引发NCED基因的活化，这在ABA生物合成的上流调节中也是必需的（图3）。但是，至于NCED基因表达中生长素信号传输是否也包含SCFTIR1/AFB调节的转录抑制因子的退化如Aux/IAA的问题还存在。同样的，我们还要证明NCED基因表达的诱导会对易感植物中的生长素有普遍的影响。这是最可能的情况因为我们在不同种类的双子叶植物中观察到生长素会诱导ABA的积累31,32。然而生长素是NCED基因表达主要引发物，乙烯可提高ABA生物合成可能是通过NCED转录后的上流调节（图3）19。乙烯调节的NCED上流调节活性是以酶蛋白合成，活性或稳定性的提高为基础的。与此同时，对用2，4-D处理过的拟南芥转录体分析展现了NCED1和乙烯信号传输基因的表达和生物合成35。最后，ABA在芽中积累并在植物中被系统的转运。与乙烯一起，ABA的功能是在生长素除草剂的作用方式中作为激素的第二信使。ABA被认为是促进叶衰老以及通过影响气孔运动和细胞分裂扩张来控制植物生长的重要激素。事实上，植物中ABA升高的过程与气孔关闭密切相关，因而会引起蒸腾作用、碳同化、植物生长受抑制并促使叶组织损伤36。随后的影响伴随着活性氧(ROS)如过氧化氢过量产生，这可能是由于ABA调节气孔关闭引起光合活性降低而引发的36。另外，ABA诱导原生质膜NADPH氧化酶活化可能参与过氧化氢的产生37。此外，在叶组织中Cu/Zn过氧化物歧化酶含量的增加，会更加促进过氧化氢的积累。ABA的外源性应用与生长素对这些过程的影响相差不多36。这与已识别激素ABA在气孔关闭、生长抑制和促进叶衰老的作用一致。比较不同化学种类的植物生长素除草剂的影响，我们会发现ABA和ROS（如过氧化物自由基和过氧化氢）生产过剩，以及与之相对的组织损伤，是所有生长素除草剂普遍存在的影响36,37。我们认为过氧化氢的积累会通过膜脂质过氧化反应造成组织氧化损伤，这很可能是衰老的信号38。因此，用过氧化氢处理猪殃殃的芽会引起像生长素除草剂一样的植物毒性，包括促使叶变色以及随之而来的萎焉、组织坏死和植物死亡6。总之，生长素刺激乙烯和IAA形成是引起植物生长素除草剂的植物毒性症状和IAA超最适浓度的主要致病原因。尤其是，ABA和过氧化氢的生长过剩是长期寻找的生长素作用和诱导生长抑制、衰老和组织腐烂中缺少的一环。因此，使用生长素，我们发现在植物生长调节中生长素与乙烯和ABA生物合成的上流调节间的生长素感知和激素信号传输作用的新原理8。此外，相关结果引起我们的推测，那就是激素的相互作用也能在其他生长素相关过程的信号传输中作为模块的功能，如根的向地性和在顶端优势中抑制侧芽的生长39。作为乙烯和ABA的信号转导链好像会出现部分地重叠和妨碍，乙烯和ABA间的相互作用会在与乙烯生物合成的强烈刺激相一致的现象中起重要作用。这些现象包括受压条件下引起的植物衰老、细胞分裂素引起的生长抑制、根癌土壤杆菌引起的植物肿瘤的生长和果实的催熟3,9。3 在植物生长素除草剂作用中氰化物的作用3.1 二氯喹啉酸在稻科植物中的作用植物生长素除草剂会优先控制双子叶植物杂草。这种现象中选择性植物生长素除草剂二氯喹啉酸是个例外，它还能额外控制一些重要杂草，比如水稻中的稗属、马唐属、狗尾草属和臂形草属的杂草40。生长抑制以及叶萎黄病加重首先出现在最嫩叶片的生长区域，随后整个根部会出现萎焉和坏死，这是主要的除草剂特征。对稻科植物中二氯喹啉酸的作用机理研究表明单独的诱导脱落酸（ABA）和过氧化氢增加不足以引起这些影响6,40。Tittle等报道的调查结果表明在植物性毒素作用模式和生长素除草剂2,4-D选择性中，氰化物第一次的角色是作为刺激乙烯生物合成中的副产物。因此，经验定的假说表明二氯喹啉酸在作为植物除草剂功能时能以相似的方式造成稻科植物的损伤。3.2 植物中氢氰酸的发生率在自然界氰化物是普遍存在的，能在广泛分布的不同前体细胞中形成42-44。超过2500种植物表现出是可以生氰的，即有产生氢氰酸（HCN）的能力。在双子叶植物种类（例如核果、豆类）和稻科植物包括重要的食物作物如玉米、大米、小麦和大麦中生氰作用相当普遍。在大部分植物中，HCN的产生机理是含氰糖苷的降解。有超过60种不同的含氰糖苷已经了解，我们认为在抵御植食性昆虫时通过其苦涩气味和在组织破裂处释放有毒HCN来起作用，其还可作为糖的储存化合物并降低氮含量44。另外，据报道在氨基酸氧化酶和过氧化酶存在的情况下组氨酸可形成HCN，硝酸盐同化的可能媒介物羟胺也可形成HCN，以及光呼吸产物也可形成HCN45。早在20世纪80年代，当发现氰化物可作为植物激素乙烯生物合成的副产物时，就提出关于这种代谢物在植物生理学意义上的问题6,45,47,48。3.3 乙烯生物合成中的副产物：氰化物氰化物产生量在化学计量上与乙烯产生量是相等的47,48。ACC氧化酶催化1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）的氧化，导致乙烯、CO2和HCN的产生。乙烯合成的普遍存在表明这一途径是植物内源性自由氰化物的主要来源。当乙烯在调节植物中一系列生长现象起重要作用，比如生长、衰老和成熟28，而氰化物却作为植物性毒素的代名词43。它是为人们所熟知的抑制剂，特别是对金属酶以及其他包含氰化物与夫式碱媒介物或者形成抑制物的底物间的反应的蛋白。这些没存在于植物的主要代谢过程，比如呼吸作用、碳和硝酸盐的同化、碳水化合物的代谢以及抵御降毒氧的过程。氰化物也能和抑制光和电子传递的质体蓝Cu-蛋白作用。大部分氰化物敏感酶包括硝酸盐还原酶、固氮酶、过氧化氢酶、Cu/Zn超氧化物歧化酶、过氧化物酶、核酮糖二磷酸羧化酶和细胞色素C氧化酶43。引起50%敏感性酶受到抑制要求的内源性氰化物的浓度大部分在510 M之间47。在高等植物中，净化HCN的关键酶是-氰丙氨酸合酶（-CAS），有一种吡哆醛磷酸盐依赖酶来催化半胱氨酸和氰化物的反应以形成硫化氢和-氰丙氨酸（图3）。后者随后在-氰丙氨酸水解酶催化的反应中形成天冬酰胺。高活性的-CAS会在老的植物组织中和分生组织活动的区域发现并且与氰化物产量和乙烯浓度有关47。乙烯和氰化物本身能影响氰化物产量和代谢。乙烯能影响自身的生物合成，并因此也能影响其副产物氰化物的形成，既能提高（自动刺激）也能降低（自动抑制）其生成率26,48。在转录和转录后加工时26乙烯能调节ACC合酶和ACC氧化酶活性并能诱导-CAS的从头合成49。我们发现氰化物能增加ACC合酶（ACS6）基因的表达50，能催化激活和钝化ACC氧化反应51以及提高-CAS的生成52。但是，细胞内ACC氧化酶是唯一的胞质酶，因此它的反应产物乙烯和HCN最初是在细胞质中释放的53。相比之下，-CAS主要存在于线粒体内54。细胞内不同细胞器氰化物释放位点和氰化物解毒位点会引起氰化物在细胞内分布不均48。氰化物在线粒体外的细胞间的移动低效的并可能引起细胞器局部氰化物的浓度短暂提高，比如细胞质和叶绿体47。线粒体中对氰化物有效的解毒作用在氰化物敏感性呼吸中特别保护了细胞色素C的氧化并阻断ROS的形成55。但是，其他高敏感的酶如硝酸还原酶和Cu/Zn超氧化物歧化酶分布在细胞质中，而核酮糖二磷酸羧化酶分布在叶绿体中，过氧化氢酶分布在过氧化物酶体中。这使得他们非常易受氰化物的抑制因为氰化物在细胞中是高速移动的。在25时溶液中氢氰酸的pKa大约为9.2。当细胞内PH大约为中性时，在ACC氧化反应中释放的大部分氰化物以未离解的形式存在。这种形式大部分是亲脂性的而非离子，因此能很容易的跨过膜而进入细胞间47。短暂性提高引起的HCN不均匀分布的结果是细胞中植物性毒素的浓度受多重代谢的影响会在细胞中达到最高点以及氰化物会造成植物死亡47,48。但是，在观察的基础上我们发现高活性的-CAS在植物组织中高速率的产生乙烯（例如在成熟水果中1650 nmol g1 h1 ）并发现组织中氰化物浓度低于对大约1 M敏感酶无毒的浓度，Yip和 Yang阐明植物组织有足够的能力对在乙烯生物合成中产生的HCN解毒。因此，在过去的几年里我们忽略了代谢和生理学对植物中氰化物的可能作用。在20世纪90年代，有关植物生长素除草剂作用模式的研究重新审视了这些问题并调查了受刺激的乙烯和氰化物在诱导细胞和植物死亡过程中的关系。3.4 氰化物植物性毒素作用和调节作用首先以稗草为例，二氯喹啉酸作用的主要位点在根部，但内源性ACC含量的增加、乙烯的形成和氰化物的积累主要是在植物性毒素症状发展的芽中进行40。二氯喹啉酸诱导乙烯合成主要在根部，至少在处理后一个小时才能导致ACC的升高（图三）。过量的ACC被转运到芽，在哪里通过ACC氧化酶作用转换成高浓度的乙烯和氰化物。这个过程好像是被自我放大因为在芽中ACC及其产物氰化物会诱导ACC的合成。用ACC通过维管系统处理稗草各个芽组织会导致ACC合成的提高并能提高相同摩尔量的乙烯和氰化物57,58。与对照相比，用1 mM ACC处理六小时后ACC合成量增加5倍58。在53h潜伏期中组织内氰化物浓度从可控的5 M到18M57。另外，使用氰化物能提高芽中的ACC合成58，可能是通过诱导ACC合成基因转录来起作用的50。在其他易受影响的杂草中，包括大马唐草Digitaria sanguinalis (L.)、阔叶小檗Brachiariaplatyphylla(Griseb.)Nash和狗尾巴草Setaria viridis (L.) Beauv.，芽中的氰化物浓度也有积累。其积累的程度与除草剂浓度和使用时间有关，而与除草剂对生长的抑制、造成的叶绿素损失和碳同化的降低的影响最密切相关40,57。例如在稗草和大唐草的芽中氰化物的浓度会提高3倍和9倍，而在96h后分别会达到最大值30 M和 50 M40,57。其他种类的生长素除草剂包括麦草畏和1-NAA（图1），则引起较低的ACC和氰化物浓度而且与较低的植物生长素浓度有关59。因此，牧草马唐的研究证明二氯喹啉酸的植物毒性影响主要是由来源于芽中受刺激的ACC的合成造成的氰化物的积累引起的60。已经使用的KCN重生的二氯喹啉酸的量与内源性氰化物相似。另外，用ACC合酶抑制剂氨基乙氧基乙烯基甘氨酸（AVG）预处理会导致二氯喹啉酸植物毒性和乙烯产量的降低57,60。同时，在易受影响的杂草中-CAS只略微激活。相对而言，具有二氯喹啉酸抗性的杂草和生物型以及耐二氯喹啉酸的水稻，表现出高出平时六倍的活性，但在芽中ACC合酶活性、乙烯和氰化物的产量没有明显变化59,60。因此，ACC合酶的选择性诱导（在稻科植物和转录后加工中可能是通过不同的敏感性生长素受体来感知二氯喹啉酸）和通过-CAS使氰化物解毒的能力好像是由稻科植物对二氯喹啉酸的不同敏感性决定的。与敏感的稻科植物相反，在敏感双子叶植物的芽中氰化物的浓度没有变化40。正如猪殃殃所显示的，只有在处理过的植物衰老的一开始，在芽中检测到释放的气态HCN增加了3倍30。总而言之，越来越多的证据表明，在特异环境下特别是受生长素除草剂二氯喹啉酸刺激的通过ACC路径进行乙烯生物合成过程中，细胞内氰化物会积累并调节植物性毒素影响最终导致细胞和植物死亡（图3）40,45,48,60。在线粒体中-CAS的分布显然会阻碍对细胞质中释放的大量氰化物成功的解毒。目前，我们可能会应用能对线粒体外的对氰化物敏感的酶和蛋白造成抑制的代谢的多重影响。最后，高浓度乙烯和氰化物的联合作用造成了如臂形草属、马唐属、稗属和狗尾草属等敏感性杂草的代谢和生理上的反应。最近提出了在玉米根部一个可能存在的乙烯和能引起细胞死亡的氰化物二氯喹啉酸的独立作用61。目前，我们发现细胞死亡与ROS的形成和脂质过氧化作用有关。在植物中氰化物的作用好像会受到生长素作用的影响。一般地说，在逆境植物中ACC依赖于HCN的产量表明其具有植物性毒素和调节的双重功能45,47,48。在病原菌侵染62、干旱52和臭氧引起树叶55损伤的超敏反应中诱导细胞死亡的过程会牵扯到强烈刺激下的乙烯生物合成和植物性毒素氰化物的浓度。另一方面，氰化物和乙烯的亚致死浓度可能通过特殊基因如ACC合酶基因的表达在植物适应生物和非生物逆境时起到信号传输的作用45。将来阐明氰化物如何被感应并转换到特定下游反应的研究会是一个非常有趣的领域。致谢感谢托马斯艾哈德、约翰斯皮克曼和弗兰克达扬对原稿的批判性阅读和有帮助的讨论。参考文献1 Woodward AWand Bartel B, Auxin: regulation, action, and interaction.Ann Bot 95:707735 (2005).2Vanneste S and Friml J, Auxin: a trigger for change in plant development. 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