没食子酸纳米硒抗氧化性的测定

本科毕业论文 题目： 没食子酸纳米硒抗氧化性的测定 学 院： 食品科学与工程学院 姓 名： 何利强 学 号： 20134716 专 业： 食品质量与安全 年 级： 食安1301 指导教师： 杨丽聪 职称：讲师 二00一七 年 五 月没食子酸纳米硒抗氧化性的测定目 录摘 要IAbstractII引 言III1 材料与方法- 1 -1.1 实验材料- 1 -1.1.1 主要原料- 1 -1.1.2 主要实验试剂- 1 -1.1.3 主要实验仪器设备- 1 -1.1.4 试剂的配置- 2 -1.2 实验方法- 2 -1.2.1 清除羟基自由基的测定- 2 -1.2.1.1 实验原理- 2 -1.2.1.2 实验步骤9-11- 2 -1.2.2 ABTS+自由基清除能力的测定- 3 -1.2.2.1 实验原理- 3 -1.2.2.2 实验步骤12-13- 3 -1.2.3 还原力的测定- 3 -1.2.3.1 实验原理- 3 -1.2.3.2 实验步骤14-15- 4 -2 结果与分析- 4 -2.1 GASeNPs对体外羟基自由基的清除率分析- 4 -2.2 GASeNPs对体外ABTS+自由基清除率分析- 5 -2.3 GASeNPs的总还原力测定分析- 5 -3 小结与讨论- 6 -参 考 文 献- 7 -致 谢- 8 -摘 要 本文通过采用分光光度法对没食子酸纳米硒（GASeNPs）体外清除羟基自由基、ABTS+自由基和还原力进行测定，评价其抗氧化性。结果表明，与没食子酸（Gallic acid,GA）、维生素C(Vc)相比，100-300 g/mL的GASeNPs对羟基自由基的清除率为49.90%-96.86%，其清除率高于同等浓度下的Vc及GA；5-25 g/mL的GASeNPs对ABTS+自由基的清除率47.02%-97.57%，其清除率高于同等浓度下的Vc及GA；20-100 g/mL的GASeNPs对还原力的测定吸光度为0.362-0.911，在同等浓度下其还原力大于Vc，略低于GA。实验结果显示，GASeNPs具有较强的抗氧化活性。关键词：没食子酸纳米硒；抗氧化；自由基；清除率；还原力 AbstractIn this paper, the antioxidation of GASeNPs to hydroxyl free radicals, ABTS+ free radicals and reductive forces in vitro was determined by spectrophotometry with the Spectrophotometric method. The results showed that compared with Gallic acid (Gallic acid,GA) and Vitamin C(Vc), 100-300 g/mL GASeNPs to hydroxyl radical scavenging rate of 49.90%-96.86%, its scavenging rate is higher than that the same concentration of Vc and GA; 5-25 g/mLGASeNPs to ABTS+ free radicals scavenging rate 47.02%-97.57%, its scavenging rate is higher than that the same concentration of Vc and GA. The GASeNPs of 20-100 g/mL to the determination of reducing power absorbancy is 0.362-0.911, in the same concentration its reducing power is greater than Vc, slightly lower than GA. The experimental results show that GASeNPs has strong antioxidant.Key words:gallic acid modified selenium nanoparticles; anti-oxidant; free radical; scavenging rate; reducing powerI引 言没食子酸(Gallic acid,GA),化学名3,4,5-三羟基苯甲酸,是一种天然的多酚类化物,广泛存在于中草药和水果类植物中,包括叶下珠、五倍子、余甘子、葡萄、甜茶、报春黄甙叶等提取物1。没食子酸具有抗炎、抗突变、抗氧化、抗肿瘤、抗自由基等多种生物活性,在食品、生物、医药、化工等领域有广泛的应用2-3。硒是动物和人体健康生长发育所必需的微量元素4。纳米硒是纳米级的单质硒5。硒的缺乏还会严重影响机体的抗氧化系统，造成对细胞膜、蛋白质和DNA的损伤，进而干扰各类激素、生长因子和细胞活性素在体内执行的各项功能6。长期以来，关于硒的报道主要集中在纳米硒源和无机硒源作用比较和剂量确定上，大量实验证实了纳米硒比无机硒毒性作用低，生物转化率高7。GASeNPs 具有较好的稳定性，然而对GASeNPs 的抗氧化能力的评价还未见报道，对此本文选用GASeNPs作为研究对象，特别针对其体外其体外对各种自由基 (羟基自由基、ABTS+自由基及还原力的测定)的清除效果进行考察，并与Vc 这个公认的自由基清除剂和GA做对比研究，评估GASeNPs的抗氧化能力，以期为GASeNPs抗氧化作用在食品保鲜、医药、化妆品等领域提供理论依据。IV1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 主要原料GASe溶胶的制备参考已发表的文献进行GASe的合成制备8。称取0.19 g没食子酸至250 mL烧杯中，用蒸馏水溶解后转移至100 mL容量瓶并用蒸馏水定容，配成0.01 mol/L的没食子酸储备液。称取0.17 g亚硒酸钠至50 mL烧杯中，用蒸馏水溶解后转移至10 ml容量瓶并用蒸馏水定容，配成0.1 mol/L的亚硒酸钠储备液。然后在25 mL烧杯中按1：6的浓度加入Na2SeO3与没食子酸，利用盐酸将pH调至3.0后，加热挥干后得到橙红色固相样品。将此样品加蒸馏水溶解，在透析袋中过夜透析除去未反应的没食子酸后，定容于10 mL容量瓶中得到GASe溶胶。 1.1.2 主要实验试剂绿矾分析纯天津市永大化学试剂开发中心水杨酸分析纯天津市永大化学试剂开发中心磷酸氢二钠十二结合水分析纯天津市永大化学试剂开发中心双氧水分析纯天津市大茂化学试剂厂无水乙醇分析纯天津市大茂化学试剂厂磷酸二氢钠二结合水分析纯天津市大茂化学试剂厂铁氰化钾分析纯天津市福晨化学试剂厂三氯乙酸分析纯天津市福晨化学试剂厂过硫酸钾分析纯阿拉丁试剂（中国）有限公司ABTS分析纯上海源叶生物科技有限公司三氯化铁分析纯西陇化工股份有限公司1.1.3 主要实验仪器设备电子分析天平奥豪斯国际贸易（上海）有限公司移液枪Genex BetaCL3型恒温加热磁力搅拌器巩义市予华仪器有限责任公司石英比色皿宜兴市伟鑫仪器有限公司低速大容量离心机上海安亭科学仪器厂可见分光光度计上海元析仪器有限公司数显恒温搅拌循环水箱常州国华电器有限公司超声波清洗机宁波新芝生物科技股份有限公司干燥箱上海跃进医疗器械有限公司1.1.4 试剂的配置6 mol/L绿矾（FeSO4.7H2O):称取0.17 g绿矾溶于烧杯中，并用蒸馏水定容于100 mL容量瓶中摇匀。 6 mol/L双氧水(H2O2):称取0.07 g30%的双氧水用蒸馏水定容于100 mL容量瓶中摇匀。 6 mol/L水杨酸(C7H6O3)：称取0.08 g水杨酸用无水乙醇溶解于烧杯中，并用无水乙醇定容于100 mL容量瓶中。 1 mg/mL过硫酸钾：称取0.10 g过硫酸钾于烧杯中，用蒸馏水定容于100 mL的容量瓶中。 80%的乙醇：取40 mL无水乙醇加入到50 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。ABTS工作液：精密称取40 mgABTS，加入1 mg/mL的过硫酸钾溶液8 mL，密封后避光静置反应16 h，定量转移到250 ml的容量瓶中，加入32 mL蒸馏水，用无水乙醇定容至刻度，放置10 h后使用。0.20 mol/L磷酸盐缓冲液（pH=6.6）：甲液（磷酸氢二钠十二结合水），称取7.16 g溶于烧杯中，用蒸馏水定容于100 mL的容量瓶中；乙液（磷酸二氢钠二结合水），称取3.12 g溶于烧杯中，用蒸馏水定容于100 mL的容量瓶中。取40 mL甲液，60 mL乙液混合，即配置成所需的0.20 mol/L磷酸盐缓冲液。1%铁氰化钾:称取1 g铁氰化钾溶于烧杯中，加蒸馏水定容于100 mL的容量瓶中。0.1%三氯化铁:称取0.10 g的三氯化铁溶于烧杯中，用蒸馏水定容于100 mL的容量瓶中。10%三氯乙酸:称取10 g三氯乙酸溶于烧杯中，用蒸馏水定容于100 mL的容量瓶中。1.2 实验方法1.2.1 清除羟基自由基的测定1.2.1.1 实验原理根据Fenton方法产生OH自由基的模型，H2O2与亚铁离子反应生成OH自由基,该反应为：H2O2+Fe2+OH+OH+Fe3+自由基一般存活时间比较短而且具有较高活性的特点，而水杨酸能有效地捕捉羟基自由基且产生有色产物，因此，若在该体系加入一定量的水杨酸，将发生颜色反应。生成的有色产物在510 nm处被较强地吸收。1.2.1.2 实验步骤9-11 （1）各取1 mL的0.10 mg/mL、0.15 mg/mL、0.20 mg/mL、0.25 mg/mL、0.30 mg/mL的样品溶液于5支离心管中，依次加入6 mmol/L FeSO4溶液1 mL，6 mol/L H2O21 mL，混匀后静置10 min，再加入6 mol/L水杨酸溶液1 mL混匀后静置30 min，然后于510 nm处测其吸光度值Ai。在其他处理不变的情况下，以1 mL蒸馏水代替水杨酸测吸光度Aj，空白对照组以1 mL蒸馏水代替样品溶液测吸光度A0。羟基自由基的清除率计算公式：E=(A0Ai+Aj)/A0 （2）以样品浓度为横坐标，羟自由基清除率为纵坐标建立标准曲线，得出他们之间的关系。1.2.2 ABTS+自由基清除能力的测定1.2.2.1 实验原理ABTS法是使用最广泛的间接检测方法，可用于亲水性和亲脂性物质抗氧化能力测定。ABTS经氧化后生成稳定的蓝绿色阳离子自由基ABTS+，能溶于水相或酸性乙醇介质中，在734 nm处有最大吸收。被测物质加入ABTS+溶液后，所含抗氧化成分能与ABTS+发生反应而使反应体系褪色，在ABTS+的最大吸收波长（一般选择734 nm）检测吸光度的变化。1.2.2.2 实验步骤12-13 （1）各取0.50 mL的0.005 mg/mL、0.010 mg/mL、0.015 mg/mL、0.020 mg/mL、0.025 mg/mL的样品溶液于5支离心管中，用80%乙醇补至2 mL，再加入2 mLABTS+工作液，摇匀，避光反应6 min，然后在734 nm下测吸光值Ai，在其他处理不变的情况下，以80%乙醇代替样品溶液作为空白对照，测吸光度A0。计算提取液对ABTS+自由基清除率:W=(A0Ai)/A0 （2）以样品浓度为横坐标，ABTS+自由基清除率为纵坐标建立标准曲线，得出他们之间的关系。1.2.3 还原力的测定1.2.3.1 实验原理 K3Fe(CN)6 (赤血盐）+样品K4Fe(CN)6(黄血盐）+样品氧化物 K4Fe(CN)6+Fe3+Fe4Fe(CN)63（普鲁士蓝）普鲁士蓝为沉淀，700 nm是普鲁士蓝的最大吸收，在波长700 nm处测吸光度Ai，Ai越大，还原力越大。1.2.3.2 实验步骤14-15 （1）各取1 mL的0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL、0.10 mg/mL的样品溶液于5支离心管中，加入0.20 mol/L磷酸盐缓冲液1.25 mL（PH=6.6）和1%的铁氰化钾溶液1.25 mL，混匀后于50 水浴中保温20 min后，快速冷却，再加入1 mL10%三氯乙酸，以3000 r/min的转速离心10 min，取上清液0.50 mL,加入0.1%三氯化铁溶液0.25 mL，再加入1.75 mL蒸馏水，充分混匀，在700 nm处测定其吸光值Ai。 （2）以样品浓度为横坐标，吸光值Ai为纵坐标建立标准曲线，得出他们之间的关系。2 结果与分析2.1 GASeNPs对体外羟基自由基的清除率分析图1 羟基自由基的测定GASeNPs对羟基自由基清除效果由图1所示，100,150,200,250,300 g/mL的GASeNPs对羟自由基清除率分别为：49.90%、83.42%、91.35%、93.36%、96.68%。并呈现出一定的浓度依赖关系，而Vc在相同浓度下的清除率分别为：40.42%、51.29%、52.94%、53.09%、53.20%,GA的清除率分别为：50.72%、62.82%、82.03%、90.58%、93.41%。结果表明Vc清除率较低，GASeNP在相同浓度下对羟自由基清除率优于Vc和GA,最高清除率可达96.68%。2.2 GASeNPs对体外ABTS+自由基清除率分析ABTS2,2联氨双（3乙基苯并噻唑咻6磺酸）二胺）是一种供氢体。该方法作为测定抗氧化性的一种新方法，以Vc为阳性对照，测定其清除率如图2所示。图2 ABTS+自由基清除率的测定由图2可以看出，GASeNPs对ABTS+自由基的清除率随质量浓度的增加而增大，并呈现明显的量效关系。当质量浓度为25 g/mL时，GASeNPs的清除率为97.57%，GA的清除率为95.39%，而Vc的清除率只有32.48%，可见GASeNPs对ABTS+自由基具有极强的清除能力。2.3 GASeNPs的总还原力测定分析抗氧化剂的还原力与其抗氧化活性之间存在关系，还原力越强，抗氧化活性越强。FeCl3/K3Fe(CN)6 法测定还原力，是通过测普鲁士蓝沉淀在700 nm处的吸光度，而离心之后普鲁士蓝还没有沉淀下去时测其吸光度，吸光度处于不断变化之中，所以测量应先摇晃均匀放进去立马记录数据。 图3 还原力的测定 由图3可以看出，GASeNPs对普鲁士蓝的还原作用曲线大致呈线性关系，且基本与Vc的曲线平行，直到质量浓度为100 g/mL时两条曲线呈现远离趋势，GASeNPs的还原作用在加快，而Vc的则在放缓。GA的还原作用则在质量浓度为80 g/mL之后优于GASeNPs和Vc。说明GASeNPs的还原力比Vc强，抗氧化性比Vc强。3 小结与讨论抗氧化剂是指能防止或延缓食品氧化性和延长贮存期的食品添加剂。GASeNPs则是外界物质通过人为化学合成的一种抗氧化性纳米材料。对于羟基自由基的清除作用：GASeNPs、GA、Vc对羟基自由基的清除率都是随着浓度的增大，清除率增大。浓度范围在100-300 g/mL时对羟基自由基的清除能力：GASeNPsGAVc。对于ABTS+自由基的清除作用：GASeNPs、GA、Vc对ABTS+自由基的清除率都是随着浓度的增大，清除率增大。浓度范围在5-25 g/mL时对ABTS+自由基的清除能力：GASeNPsGAVc。对于还原力的测定：GASeNPs、GA、Vc的还原力都是随着浓度的增大，还原力逐渐增强。浓度范围在20-100 g/mL时还原力大小：GAGASeNPsVc。综上所述，GASeNPs具有很强的抗氧化性，可应用食品、药品、化妆品等领域，具有广阔的发展前景。参 考 文 献1何文飞, 何大维, 马超, 等. 没食子酸抑制人神经母细胞瘤增殖作用的实验研究J. 第三军医大学学报, 2011, (02):107-110.2李肖玲, 崔岚, 祝秋德. 没食子酸生物学作用的研究进展J. 中国药师, 2004, 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