《NO38基因工程》PPT课件.ppt

复习检查： 1.基因工程概念？原理？ 2.基因工程操作的基本工具有哪些？ 3.限制性核酸内切酶的来源？特性？作用部位？结果？ 4.DNA连接酶的分类？作用？连接部位？ 5.DNA连接酶与DNA聚合酶的区别？ 6.常用的运载体有哪些？作为运载体必须具备的条件? 7.基因工程的操作步骤？核心？ 8.基因文库？基因组文库？部分基因文库？cDNA？ 9.PCR技术扩增目的基因的原理？条件？前提？过程？ 10.基因表达载体构建的目的？基因表达载体的组成？ 11.目的基因导入植物细胞的方法?最常用方法及原理? 12导入动物细胞的方法?受体细胞是?导入微生物的方法? 13.基因工程从分子水平检测可分别检测哪些对象? 如何检测?从个体水平如何鉴定?,考点一：基因工程的基本工具线性 【典例1】 已知某种限制性内切酶在一线性DNA分子上有3个酶切位点，如图中箭头所指，如果该线性DNA分子在3个酶切位点上都被该酶切断，则会产生a、b、c、d四种不同长度的DNA片段。现在多个上述线性DNA分子，若在每个DNA分子上至少有1个酶切位点被该酶切断，则从理论上讲， 经该酶切后，这些线性DNA 分子最多能产生长度不同 的DNA片段种类数是（ ） A3 B4 C9 D12 【典例2】镰刀型细胞贫血症的病因是血红蛋白基因碱基序列发生了改变。检测这种碱基序列改变必须使用的酶是 （ ） A解旋酶 B.DNA连接酶 C.限制性内切酶 D.DNA聚合酶 【典例3】下列有关基因工程中限制内切酶的描术，错误的是（） A. 一种限制性内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列 B. 限制性内切酶的活性受温度的影响 C. 限制性内切酶能别和切割RNA D、限制性内切酶可从原核生物中提取,线性DNA分子的酶切示意图,【归纳点拨】 1、要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？ 2、如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？ 3、大多数限制酶识别的序列由几个核苷酸组成？ 4、平末端是从识别序列的什么部位切开？ 5、Ecoli DNA连接酶 T4 DNA连接酶在缝合的时候有什么不同？ 6、DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？ 7、DNA水解酶和DNA解旋酶的作用和上面两种酶有什么不同？ 8、质粒有哪些特点？,2个， 4个,产生相同的黏性末端,绝大多数6个，少数为4、5、8个。,中心轴线,Ecoli DNA连接酶连接黏性末端 ； T4 DNA连接酶连接黏性末端 和平末端,不是,DNA水解酶水解磷酸二酯键将DNA分子水解为游离的脱氧核苷酸； DNA解旋酶破坏DNA的氢键，使其变为单链结构。,能自我复制 有一个到多个限制酶识别位点 具有标志基因,【针对训练1】以下说法正确的是 （ ） A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接 D、基因控制的性状都能在后代表现出来 【针对训练2】不属于质粒被选为基因运载体的理由是（ ） A、能复制 B、有多个限制酶切点 C、具有标记基因 D、它是环状DNA,考点二：基因工程的基本步骤 【典例3】为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。 （1）获得耐盐基因后，构建重组 DNA分子所用的限制性内切酶作用 于图中的 处，DNA连接酶作 用于 处。（填“a”或“b”） （2） 将重组DNA分子导入水稻 受体细胞的常用方法有农杆菌转 化法和 法。 （3）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用 技术。该技术的核心是 和 。 （4）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的 作探针进行分子杂交检测，又要用 方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。,a,a,基因枪,脱分化 再分化,目的基因,一定浓度盐水浇灌,植物组织培养技术,【归纳点拨】 （一）目的基因的获取 1.从基因文库中获取 基因文库的构建方法（动手写出构建流程） 1）直接分离法： 2）反转录法：,某生物体中全部DNA 限制酶 许多DNA片段 与运载体连接 导入 受体菌群 从中直接分离,目的基因的mRNA 反转录 单链DNA片段 合成 双链DNA 与运载体连接 导入 受体菌群,2.利用PCR技术扩增目的基因： （1）PCR技术概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_ 的核酸合成技术 原理：_ （2）条件：_、_、_ _ 、 _. 前提条件： _. （3）扩增过程： a变性（ ）：目的基因DNA受热变性后接连为单链 b退火（ ）： 与单链相应互补序列结合 c延伸（ ）：在 的作用下进行延伸Taq酶的特点是 。,聚合酶链式反应,体外 特定DNA片段,DNA双链复制原理,原料：四种脱氧核苷酸 模板,酶：热稳定的DNA聚合酶 能量,引物,9095,5560 引物,7075 热稳定DNA聚合酶,热稳定,PCR技术与DNA复制的比较： 3.人工合成 当基因较小，核苷酸序列已知时，可以用人工方法合成（例如，通过 直接合成）。,DNA双链复制,四种脱氧核苷酸,原料、模板、酶、能量,加热 解旋酶,体外 细胞内,Taq酶 解旋酶、DNA聚合酶,目的基因扩增 DNA数目加倍,DNA合成仪,（二）基因表达载体的构建（核心） 1.过程：用一定的_切割 质粒，使其出现一个切口， 露出_。 用_切断目 的基因，使其产生_。 将切下的目的基因片段插入质粒的_处， 再加入适量_，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒） 基因表达载体的组成：复制原点+ + 。 + + 。 思考：1、绘一个基因表达载体示意图： 2、构建表达载体的目的是什么？,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,相同黏性末端,切口,DNA连接酶,启动子 目的基因,终止子 标记基因,使目的基因在受体细胞中稳定存在， 并且可以遗传给下一代。,（三）将目的基因导入受体细胞 1.将目的基因导入植物细胞 （1）农杆菌转化法：转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为 。农杆菌特点：在自然条件下能感染 植物和 植物，对 植物没有感染力；Ti质粒的 可以转移至受体细胞，并整合到受体细胞的 上。 （2）基因枪法又叫 。 （3）花粉管通道法：利用花粉管通道使目的基因进入 ，然后进入 。 2、将目的基因导入动物细胞 （1）方法： 。 （2）操作程序：目的基因的 提纯取卵（受精卵） 移植子宫内发育新性状动物 3、将目的基因导入微生物细胞 （1）原核生物的特点： 。 （2）常用的受体细胞： 。 （3）转化： 处理细胞 细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收 分子，完成转化。,转化,双子叶 裸子,绝大多数单子叶,T-DNA,微弹轰击法,花粉管,受体细胞,显微注射技术,表达载体,采用显微注射仪进行显微注射,繁殖快、多为单细胞、一遗传物质相对较少,Ca2+,感受态,DNA,染色体DNA,目的基因插入Ti质粒的T-DNA上 农杆菌 导入植物细胞 整合到受体细胞的染色体上 目的基因的遗传特性得以维持稳定和表达,农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物。Ti质粒的T-DNA可转移至受体细胞的染色体上,2.转化,（四）目的基因的检测与测定 1）检测转基因生物的 上是否插入了目的基因 检测方法： 技术，即将转基因生物的基因组DNA提取出来，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为 ，使探针与基因组DNA杂交，如果出现 ，就表明目的基因已插入染色体DNA中。 （2）检测目的基因是否 ： 检测方法： 技术 （3）检测目的基因是否 ， 检测方法： ，从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行检测，若有 出现，表明目的基因已形成蛋白质产品。 （4）进行 水平的鉴定,染色体DNA,DNA分子杂交,探针,杂交带,转录出mRNA,分子杂交,翻译成蛋白质,抗原抗体杂交,杂交带,个体,不能，还必须检测目的基因翻译出蛋白质（或受体细胞表现出特定的性状），才能说明目的基因完成了表达。,受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗？,3.下表关于基因工程中有关基因操作 的名词及对应的内容，正确的组合是,4、下列属于获取目的基因的方法的是( ) 利用mRNA反转录形成从基因组文库中提取 从受体细胞中提取 利用PCR技术 利用DNA转录 人工合成 A. B. C. D.,5.细菌的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因在基因工程中的主要作用是 A提高受体细胞在自然环境中的耐药性 B有利于对目的基因是否导入进行检测 C增加质粒分子的分子量 D便于与外源基因连接 6. 有关基因工程的叙述正确的是 A限制酶只在获得目的基因时才用 B重组质粒的形成是在细胞内完成的 C质粒都可作为运载体 D蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料,7.哪项不是基因表达载体的组成部分( ) A.启动子 B.终止密码 C.标记基因 D.目的基因 8.下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法( ) A基因枪法 B显微注射法 C.农杆菌转化法 D花粉管通道法,1.下列关于基因工程的叙述，错误的是（ ） A目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物 B限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶 C人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性 D载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达,3.DNA测序工作中，需要将某些限制性内切酶的限制位点在DNA上定位，使其成为DNA分子中的物理参照点。这项工作叫做“限制酶图谱的构建”。假设有以下一项实验：用限制酶Hind，BamH I和二者的混合物分别降解一个4kb(1kb即1千个碱基对)大小的线性DNA分子，降解产物分别进行凝胶电泳，在电场的作用下，降解产物分开，如下图所示： 据此分析，这两种限制性内切酶在该DNA分子上的限制位点数目是以下哪一组? A、Hindl个，BamHI 2个 B、Hind2个，BamHI 3个 C、Hind2个，BamHI 1个 D、HindIII和BamHI各有2个,4.一长度为1000碱基对(bp)的DNA分子，用限制性核酸内切酶Eco R1酶切后得到的DNA分子仍是1000 bp，用Kpnl单独酶切得到400 bp和600 bp两种长度的DNA分子，用EcoRl、Kpnl同时