2010前处理在分析测试中的应用实例-教材.ppt

前处理在分析测试中的应用,中山大学测试中心 陆慧宁,2010.3.15 联系电话13640710719 E-mail: ,掌握样品前处理方法的意义,前处理是用好仪器的前提 前处理是拓展仪器使用范围的途径 在科学合理使用仪器的前提下，前处理水平直接影响仪器使用水平 利用手中的仪器可以去解决尽可能多的问题，应该是分析人员追求的目标 玩仪器，玩分析，是分析人的一种境界,分两部分内容,一、前处理分类概述 二、分类应用实例 （重点）,色谱分析 前处理,定量分析前处理,定性分析前处理（定性分析的前处理具有更大的灵活性、探索性。有更多的发挥空间 ）,执行标准,标准方法部分变通,建立新方法,分析前处理分类：,定量分析前处理,1、经典的前处理程序：萃取、净化 仪器的选择性越来越高 前处理的步骤逐步简化 最热门的分析领域是食品安全。农药和药物残留分析。趋向于多残留分析，利用质谱的SIM技术和SM/SM技术排除干扰，提高分析灵敏度,农药残留分析多使用GC-MS 萃取：有机溶剂 净化：小柱、SPE小柱 药物残留分析较多使用 HPLC-MS 萃取：乙腈、甲醇、水 净化：离心、冷冻高速离心、滤膜过滤,建立分析前处理方法简例一： 咸鱼制品中农药敌敌畏的测定,参考以下标准的前处理,GB/T 19650-2005 动物组织中437种农药多残留测定方法 气相色谱-质谱和液相色谱-串联质谱法,样品前处理,GPC净化柱,待净化提取液,浓缩,1mL溶液 待仪器分析,咸鱼（鱼干）样品情况分析,与GB/T 19650-2005所述样品对比： 含水量低 含油脂量高（经测定，淡水鱼干含油脂达到30%）,确定萃取方法 确定萃取物中主要的干扰物（GC-MS Full scan） 大量油脂 有机酰胺 长链脂肪酸类 建立针对各种干扰物的净化方法,咸鱼提取液除油脂后的GC-MS总离子流图,去除大量油脂的方法1,参考国标：凝胶色谱法（GPC）,凝胶渗透色谱 GPC (Gel Permeation Chromatography),凝胶渗透色谱又称为尺寸排阻色谱，它是按 溶质分子的大小进行分离的一种色谱技术。,凝胶色谱法的优点,按照分子大小分离，无吸附作用，使用简便 分析物回收率好 分析柱可以重复使用 易于自动化,凝胶渗透色谱用于农残分析,凝胶渗透色谱净化利用凝胶对不同大小的分子的排阻效应进行分离。 分子量大的油脂、色素等先随流动相流出，较大多数的农药分子较小，进入凝胶孔内，较晚流出色谱柱，从而达到净化的目的。,待分离目标物化学结构分析：,敌敌畏,油脂,净化用GPC凝胶色谱,一、自动化装置（商品化、组装） 二、实验室简易凝胶色谱柱,自动凝胶色谱仪的组成,1 自动进样器 2 凝胶色谱柱 3 一台稳定的无脉冲泵 4 检测器 5 馏分收集器,自制简易凝胶色谱仪,1 凝胶色谱柱 2 一台稳定的无脉冲泵（可以用蠕动泵） 3 馏分自动收集器,二、实验室简易凝胶色谱柱,1 凝胶色谱柱 2 不使用泵（以高位液槽代替） 3 流分自动收集器（无条件时可以人工收集）,简易GPC柱,GPC净化柱,高位储液瓶,GPC柱的装填,1、选定凝胶填料，在本标准中采用Bio-Breads S-X3填料。 2、选定净化柱规格 标准要求200mm *25mm 3、选定流动相（环己烷-乙酸乙酯 1：1） 4、预测定树脂在流动相中的膨胀率，按照需要量浸泡凝胶树脂过夜，然后装柱 5、装柱要求均匀（均匀轻敲柱身、连续匀速装填、保持溶剂液面高于填料） 6、填装完毕后，流动相在柱子中慢速流动以使柱子达到平衡,在流动相不变的情况下，一根装好的GPC柱有很好的重现性，可以反复使用。 在使用前，应当标定GPC柱，即做出目标物和污染物在该柱的流出曲线 在食品安全分析中，凝胶色谱柱的用途主要在于分离去除分子量大的油脂和色素,黄瓜中有机磷农药残留分析,提取,净化,检测,改进的 S19方法,GPC净化 收集3045 ml,Varian GC 3800 PFPD检测器,色素,用GPC脱除黄瓜提取液的叶绿素过程,油脂与农药在GPC柱上的分离,0.527g 油脂+农药混标 在柱上的流出曲线,油脂洗脱情况：65-115ml回收油脂0.517g，回收率98%,农药洗脱情况：125-190mL部分回收农药,GPC柱上洗脱情况分析,农药与油脂的分子大小差异大，在GPC上获得很好的分离 回收曲线显示，收集120-190mL流分能完全回收农药 优点：去除率高、农药回收好，理论上无损失 缺点：大量溶剂、大量时间、需要特殊设备、投 入 高,去除大量油脂的方法2,硅胶小柱分离,硅胶小柱分离方法的建立,原理：硅胶吸附层析原理 属于正相层析，按照极性大小分配。极性大的物质与硅胶的相互作用力大，难洗脱 选择适当洗脱剂是关键,敌敌畏 极性较大,油脂 极性较小,1. 薄层色谱法选择溶剂系统,二氯甲烷:乙酸乙酯 (10:0),二氯甲烷:乙酸乙酯 (10:2),二氯甲烷:乙酸乙酯 (8:2),从以上薄层展开结果看，10：2较优 薄层层析移植到柱层析，极性应该减小，减小幅度只能依据实际数据,2. 上柱测定油脂与农药洗脱曲线 选择分离条件,目的和要求：好的洗脱溶剂，应该是能够将污染成分尽可能去除，而被测成分完全保留 方法：调整二氯甲烷:乙酸乙酯洗脱剂系统的比例，使得油脂能完全洗脱而农药不流出。 收集流出液计算油脂回收率 用GC监控农药流出情况 结果：找到最优淋洗条件：二氯甲烷:乙酸乙酯=98：2 找到回收农药洗脱条件：乙酸乙酯：丙酮=1：1,3. 确定硅胶和各溶剂用量,按照样品的实际情况进一步优化硅胶用量、 脱脂溶剂用量、洗脱农药溶剂用量 按要求烧制特制玻璃小柱：,净化方法： 硅胶柱：（4g硅胶） 除油脂：（二氯甲烷：乙酸乙酯=98：2）15mL 回收农药：（丙酮：乙酸乙酯=1：1）15mL 收集于K-D浓缩瓶中，于40 旋转蒸发至1.0mL，,K-D浓缩器装置图,K-D浓缩瓶,小柱分离 优点：溶剂用量小、时间省、设备投入低 缺点：去除油脂率相对较低，硅胶吸附损失、操作较繁锁，无自动化,经典柱层析分离与SPE,原理 流出曲线 确定洗脱体积 自动化,两种去除大量油脂的方法,凝胶色谱法 优点：去除率高、农药回收好，理论上无损失 缺点：大量溶剂、大量时间、需要特殊设备、投 入高 小柱分离 优点：溶剂用量小、时间省、设备投入低 缺点：去除油脂率相对较低，硅胶吸附损失、操作较繁锁，无自动化,至此，去除油脂的净化方法基本定型 酰胺及有机酸干扰物通过其他方法去除？ 需要注意的是，一个前处理方法是否可行，最后标准是： 准确度添加回收率 精密度相对标准偏差,农药残留分析方法的准确度要求,不同添加浓度要求回收率如下： 添加浓度(mg/kg) 1 0.11 0.010.1 0.0010.01 0.001 回收率(%) 70-110 70-110 70-110 60-120 50-120,不同添加浓度回收率实验所要求的相对标准偏差如下： 添加浓度 1 0.11 0.010.1 0.0010.01 0.001 (mg/kg) 相对标准偏差 10 15 20 30 35 (RSD)(%) RSD = (检测值-平均检测值)2/ (检测次数-1)1/2/ 平均检测值 100% 相对标准偏差反映了方法在该实验室条件下的重复性水平，因为是直接添加标准物质到空白样品中,农药残留分析方法的精密度要求,基质加标0.05mg/kg,回收率：83-109%（70-110%） RSD 13.9%（15-20%） 以上开发方法达到残留分析要求,前处理,定量分析前处理,定性分析前处理（定性测定分析具有更大的灵活性、探索性。有更多的发挥空间 ）,执行标准,标准方法部分变通,建立新方法,建立分析前处理方法简例二： 直接分散-顶空-GC法测定微甘菊叶中石竹烯含量,分析项目概况：研究在不同生长环境中微甘菊叶片中代谢产物石竹烯的含量 栽培条件所限，每个样品只有鲜叶3片：约1.5g 由于样品量少，用经典方法（如溶剂提取、小柱净化，GC分析）分析萜烯类化合物容易带来过大的误差。,叶片+液氮研磨,自动顶空进样器 GC-FID分析，峰面积定量,加标，自动HS-GC-FID分析，单点定量,处理步骤少，样品不需要转移 数据重现性很好， 平行3次进样RSD 2.5-5.0%之间。 由于顶空进样，分离-净化-富集一次完成，方法灵敏度高,2.5uL EA,石竹烯,处理步骤少，样品不需要转移，数据重现性很好。 由于顶空进样，分离-净化-富集一次完成，方法灵敏度高,6天,9天,12天,3天,RSD=2.55.0%,6天+标,6天,计算出样品中石竹烯含量在0.032mg/kg 平行3次测定的 RSD=2.5-5.0% 之间，远低于20%的要求。达到相当好的精密度,固相微萃取 在分析中的应用,要 点 一、简单介绍固相微萃取（SPME） 二、介绍固相微萃取在挥发性有机物的定性分析的几个应用实例,一固相微萃取法简介 (Soild Phase Microextraction)是80年代末90年代初发展起来的一项测试分析前处理技术。 特点：无溶剂、操作简便,装 置,原 理,根据有机物与溶剂之间“相似相溶”原理，利用石英纤维表面的色谱固定相（溶剂）对分析组分（溶质）的吸附（溶解）作用，将组分从基质中萃取出来，并逐渐富集,萃取方式,溶液萃取 通常用于萃取水溶液中的微量有机物 顶空萃取 适用于对所有基质（有机溶液除外）的试样中的挥发性、半挥发性的有机物的分析,操 作,二、介绍固相微萃取在挥发性有机 物的定性分析的几个实例,1. 防滑地胶异味成分的分析 2. 某品牌安全套的异味成分定性分析 3红树林植物浸膏中挥发性物质的分析 4油墨慢干剂鉴定 5. 化工产品来源指纹图及挥发性污染物溯源,防滑地胶异味成分的分析,实验方法 将剪碎的3g样品放入10mL顶空瓶中，插入预先活化好的固相微萃取器在顶空部分室温萃取30 min 。聚二甲基硅氧烷萃取纤维头，固定相液膜厚100um； 分析条件：热解吸不分流进样，0.5 min后吹扫；进样口温度220；DB-5石英毛细管柱（30m0.25mm，0.25m）；氦气流速lmL/ min；升温程序：50保持3min ，以10/min升至140,保持3min，以5/min升至200,保持3min 。质谱条件：EI源，接口温度230；离子源温度220；检测电压300V。,防滑地胶室温下HS-SPME-GC-MS TIC图,样品的顶空化学成分分析结果,臭！,某品牌安全套的异味成分定性分析,实验方法 取安全套2只剪碎，置于顶空瓶中用SPME室温顶空萃取20min。 分析条件 热解吸不分流进样，进样口温度220；1 min后吹扫；DB-5石英毛细管柱（30m0.25mm，0.25m）；氦气流速lmL/ min；升温程序：40保持3min ，以20/min升至180,保持3min 。质谱条件：EI源，接口温度230；离子源温度220；检测电压450V。,二硫化碳,结 果 分 析,主要有6个色谱峰：水、二硫化碳、乙酸乙酯、硅油和乙基苯基胺、二叔丁基甲酚 二硫化碳恶臭高毒成分 来源分析：与乙基苯基胺一起都是在乳胶生产过程中添加的硫化促进剂分解而产生的。,常见植物精油分析方法,植物精油分析前处理方法,经典 水蒸气蒸馏,自动循环水蒸气蒸馏,( 挥发油测定仪),溶剂萃取,顶空固相微萃取HS-SPME,( 同时蒸馏萃取法),挥发性选择，适合GC分析,按照溶解性选择!,挥发性选择，适合GC分析,?,1,2,3,4,红树林浸膏中挥发性物质的GC-MS分析,样品外观：黑色树脂状，顶空法进样有8个弱峰 方法 红树林植物浸膏取样品0.1克，置于顶空瓶中，用SPME 80萃取2小时。 分析条件 热解吸不分流进样，进样口温度220；1 min后吹扫；INNOWAX 石英毛细管柱（30m0.25mm，0.25m）；氦气流速2.5mL/ min；升温程序：60保持3min ，以10/min升至260,保持5min 。质谱条件：EI源，接口温度230；离子源温度220；检测电压400V。,红树林样品的HS-SPME-GC-MS分析 总离子流色谱图,图中可以检索的有效峰数多达108个 普通进样方式只能检测到8个峰,油墨慢干剂的分析鉴定,通常用顶空-气-质联用分析油墨的溶剂 慢干剂含量低挥发性小，顶空分析无法检出 尽量赶除低沸点溶剂后，用HS-SPME萃取可以得到很好的结果,HS进样,HS-SPME进样,石蜡烃,5 化工产品来源指纹图及 挥发性污染物溯源,某化工用储物桶存在污染物致使物料变质,合格与不合格储物桶挥发性成分对比：,合格产品的SPME-GC-MS分析结果对比,特点：有不规律的烯烃类物质，无石蜡油类成分,不合格产品的SPME-GC-MS分析结果对比 (2007.112008.3工艺改进跟踪),特点：有指纹图完全一致的石蜡烃类物质,寻找挥发物来源：,桶身色母、胶粒 桶盖色母、胶粒 设备工艺 进一步寻找挥发物来源以便指导改进工艺或原料,结 束 语,SPME 技术对样品顶空中微量有机物具有高度的富集作用，通常比直接进样强度大几十到数百倍 分析样品在室温下的异味成分有特别的优越性 对于浸膏样植物提取液、树脂、油漆、油墨等不宜直接进样的基质中的微量挥发性、半挥发成分的萃取分析有独到功能 通过挥发性物质指纹图容易对各种产品产地溯源（蜂蜜、香烟等）,SPME定量分析,测定水溶液中的微量挥发性有机物 只在相对洁净基质中分析较有效 测定复杂基质中的微量挥发性有机物 自动顶空固相微萃取仪使分析便利现实,SH-SPME-GC/MS定量分析应用例子,引自：Journal of Chromatography B, 796 (2003) 5562 Identification of pheromones in mouse urine by head-space solid phase microextraction followed by gas chromatographymass spectrometry,使用顶空固相微萃取和气相色谱质谱联用技术鉴定鼠尿中的信息素,常规方法需要20mL同一只老鼠的尿液，采样困难 HS-SPME仅用20uL尿样就可以进行分析,SPME定量分析需要优化各萃取参数,SPME及GC-MS条件,手动SPME装置 膜厚 85um SPME萃取头（CAR/PADM） 在进行提取之前，固相微萃取柱在280，氦气活化1小时 萃取1小时后，在260的进样口脱附10min 色谱采用程序升温：35下保持15min，以3/min的速度升到60，在60时保持5min，再以10/min的速度升到150，维持1min，再以25/min的速度升到290，样品在290时加热18min,优化条件后GC-MS分析的TIC图,用香叶醇和吲哚的标样定量 雄性大鼠尿液中香叶醇和吲哚的检测范围分别是 200400ug/ml和6080ug/ml,SPME领域值得关注的研究方向,在定性分析中的应用 定量分析中的应用（研究方法、研究对象） 自动顶空固相微萃取进样器 新型纤维头涂布液的合成及性能测定,复杂定性鉴定分析,一、食用油中微量颜料的分析鉴定 二、降解- GC-MS法鉴定难挥发化合物,食用油中微量颜料的分析鉴定,分析项目简介,来源：某商场送出的礼品锅在使用时食油变成蓝绿色。为了对消费者的健康和安全负责，必须对蓝色物质作出科学的鉴定。,样品及其分离纯化,样品B与酞菁颜料的 理化性质对比试验：,图1 B的EI-MS图,样品B的氧化降解,邻苯二甲酰亚胺,酞菁颜料,浓HNO,浓硝酸,图2 C的选择离子(m/z147)色谱图,图3 Rt9.35min组分的检索结果,酞菁颜料对照品的降解,将酞菁颜料对照品用同样方法降解并进行 GC-MS分析，结果同样得到邻苯二甲酰亚胺,从EI-MS图推测酞菁颜料结构,分子量为MW 575，同时同位素丰度比M+:M+2=2:1的是铜酞菁，中心原子为Cu2+ 分子式：C32H16CuN8,分析的特点,色素存在于食用油这种特殊基质中，浓度低、难富集分离和纯化。 样品量少，难溶解、难挥发，易附着于其他介质表面，致使常规的分析手段难以奏效 在对这种性质特殊，含量极低的颜料的定性分析中，前处理对分析起到关键性作用,对食油污染过程的推测,被污染食油呈蓝绿色原因是蓝色的酞菁颜料与食油的黄色混色所致。 在高温下颜料随醇酸树脂一起溶解在食油中，当油温下降至室温后颜料随醇酸树脂沉降。颜料与醇酸树脂亲和力强，这些醇酸树脂可能是制备色母的原料。 分离过程曾经用二氯甲烷洗脱硅胶上的蓝色颜料，看到的溶解现象只是一种假象，实际上仅是硅胶微粒在溶剂中分散,分析过程使用的仪器及分析条件,BrukerEQUINOX 55傅里叶变换红外光谱-红外显微镜联用仪 。 DSQ台式低分辨质谱仪（美国 Thermo） 分析条件：EI电离源，电离电压70eV；离子源温度250。直接进样杆进样，最高温度350。 Voyager GC-MS联用仪,色谱条件： PBX5石英毛细管柱 （25 m0.22 mm0.25 m）； 氦气流速1 mL/min； 进样模式：不分流进样，进样量1ul 升温程序：60保持3 min ，以20/min升至250，保持2 min 。 质谱条件：EI电离源，接口温度230；离子源温度200；检测电压 400 V。采集延迟时间min。,降解-GC-MS法鉴定难挥发化合物,不溶解 不挥发 质谱谱库检索不到,酞菁颜料是一个典型例子 助焊剂中一个难溶难挥发成份的剖析 聚氨酯助剂中一个未知成份的剖析,助焊剂添加剂剖析：,分离到一种白色粉末 IR分析显示为酰胺类物质 EI-MS图见下页，无法检索 由于样品不溶于所有溶剂，无法进行NMR及其他分析。,EI-MS图,采用化学降解方法：,C17H35-CO-NH-CH2CH2-HN-CO-C17H35 1) NaOH（强热） 2) HCl+H2O H2NCH2CH2NH2 + 2C17H35-COOH,(A),GH2N2甲酯化,C17H35COOCH3 (B),HS-SPME-GC-MS分析,GC-MS分析,聚氨酯延迟催化剂中 一个未知成份剖析,含量0.5%,1. 乙二醇 2. 三乙烯二胺 3. 2-乙基己酸,未知成分的质谱图：,检索不到,？,未知成分的分离纯化,分离方法： 1. 减压蒸馏（除去大量主成分） 2. 甲酯衍生化后氮吹，除去少量残留2-乙基己酸,减压蒸馏残留物，含未知物96.3%,原样，未知成分含量0.5%,减压蒸馏残留物甲酯化后， 氮吹，含未知物99.9%,未知成分提纯到99.9%,纯化后的样品进行IR分析，在1730mc-1有明显的酯类官能团峰，由此设计一个酯交换反应： KOH-MeOH R-O-CO-R R-O-H + RCOOCH3,反应完成后小心中和、除水后GC-MS分析,醇,酸甲酯,甲醇,未知物,醇,进一步用NMR分析，最后确定未知成分的结构：,2-（N-(2-羟基丙基)-N-哌嗪基）乙醇-2-乙基己酸酯，分子式：C17H34N2O3 ,分子量：314,降解-GC-MS的用途：,对难挥发物质定向降解后找到母体信息 对无标准谱图的新化合物进行定向拆分后，通过降解为已知小分子来推测原化合物的结构,运用降解-GC-MS分析的前提：,了解化合物类型，如：红外光谱法确定化合物所含典型官能团 样品需要充分纯化 找到适当（定向）的化学反应使未知的大分子化合物分解成已知的可以检索的小分子,归纳：经典的衍生化-气相色谱分析的扩