实验七酶的性质影响因素实验

实验七 酶的性质影响因素实验一、目的要求了解酶的活性影响酶促反应与pH、温度、抑制剂和活化剂对酶活性的重要影响。二、原理影响酶活性的因素比较多，如温度、pH、活化剂、抑制剂等，本实验就这些因素对酶活性的影响进行试验。酶活性对pH极为敏感，每种酶通常只能在一定pH范围内表现活力，并且有一个表现为具有最高活性的pH，偏离最适pH较远，酶的活性越低，甚至消失，不同酶有不同的最适pH，如胃蛋白酶的最适pH为1.9，而胰蛋白酶的最适pH为8.1。人的唾液淀粉酶在pH3.89.4之间表现其活性，最适pH约为6.8。不同酶的最适pH值不同。然而，酶的最适pH受底物性质和缓冲液性质的影响。例如，在磷酸缓冲液中，其最适pH为6.4-6.6，在醋酸缓冲液中则为5.6。酶的活性受温度的影响也很大。一般说来，在一定温度范围内，酶活性随温度升高，活性增大，并且有一个使活性达到最大值的最适温度，偏离最适温度越远，酶的活性越小，甚至丧失（一种酶的最适温度，并非完全固定，它可受作用时间的长短，pH的变化等因素影响，一般作用时间长，最适温度低，而作用时间短，则最适温度高。但一般来说，偏离值不会很大）。人的唾液淀粉酶活性随着温度的升高而升高，直到37左右，温度更高时酶的活性则下降。有些酶促反应需要加入某种物质，反应速度才加快，如唾液淀粉酶遇Cl-时，活性增高，这种增高酶活性的物质，称为活化剂，其它的阴离子，如Br-、NO3-和I-对该酶也有激活作用，但较微弱；相反，在酶促反应中，有些物质能足以阻抑酶促反应速度，这种物质称为抑制剂，如Cu2+就是唾液淀粉酶的抑制剂。激活剂和抑制剂影响酶活性的剂量是很少的，并且常具有特异性。所以，酶的活性有时还受其它一些物质的影响。在本实验中，以稀释的唾液作为淀粉酶液。唾液内的淀粉酶可将淀粉逐步水解成各种不同大小的糊精分子，最终产物为麦芽糖和少量的葡萄糖。它们遇碘呈不同的颜色。直链淀粉（即可溶性淀粉）遇碘呈蓝色；糊精按分子从大到小的顺序，遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色和红色或橙黄色，最小的糊精和麦芽糖遇碘不显颜色： 由于在不同温度，不同pH，或者在有激活剂或抑制剂存在的条件下唾液淀粉酶的活性高低不同，则淀粉被水解的程度不同，所以，可由酶反应混合物遇碘所呈现的颜色来判断，从而可了解上述诸因素对酶活性的影响。但需注意在碱性条件下碘会发生歧化反应，部分碘形成无色的碘酸盐、次碘酸盐，此时应增加碘液加入量。上述四种因素是影响酶活性的几种主要因素，因而也是影响酶反应速度的主要因素，酶活性高，与之作用的一定量的底物反应时间就越短，反之则长。故可用时间来表示影响酶活性的强弱。三、实验材料、器材与试剂（一）实验材料1.唾液淀粉酶的制备 (1)提取：实验者先用水漱口清洁口腔，然后含一小口（约5mL）蒸馏水于口中轻嗽一、二分钟。 (2)稀释：将酶提取液用水定容至100mL。作为唾液淀粉酶的样品液。 （由于不同人或同一人不同时间收集到的唾液淀粉酶的活性并不相同，稀释倍数可以是50300倍，甚至超过此范围。）（二）器具1.试管及试管架2.吸管3.白瓷板4.烧杯5.水浴锅6.量筒7.漏斗与滤纸8.滴管（三）试剂1.冰水；2.0.1%CuSO4溶液；3.0.3%NaCl的1%淀粉溶液：先用蒸馏水配制好0.3%NaCl溶液，然后称取1g可溶性淀粉与少量的0.3%NaCl溶液混合，之后倾入沸0.3%NaCl溶液直至稀释到100mL，需新鲜配制。4.磷酸缓冲液（pH5.8，6.2，7.0，7.6，8.0五种）；pH0.2mol/LNa2PO40.2 mol/LNaH2PO45.88.0mL92.0mL6.218.5mL81.5mL7.061.0mL39.0mL7.687.0ml13.0mL8.094.5mL5.5mL6.碘化钾-碘溶液：称取2g碘和6g碘化钾溶于100mL蒸馏水中。7.1%Na2SO4；8.1%NaCl。四、操作方法1pH对酶活性的影响（1）取试管一支（设为6号管）加入pH7.0的缓冲液3mL，0.3%NaCl的1%淀粉溶液1mL及稀释唾液2mL，震荡，将试管置于37水浴锅内保温，并立即计时，每隔12min用滴管从试管中吸1滴样品于白瓷板上与碘液作用，当颜色出现橙黄色时，从水浴中取出试管，记录保温时间。（2）取试管五支，编号，分别加入pH5，pH6.2，pH7.0，pH7.6，pH8.0的磷酸盐缓冲液3mL及各管均加入0.3%NaCl的1%淀粉液1mL，然后各管加入稀释唾液2mL，摇匀，立即置水浴锅中37保温。（3）当各管保温时间与第6号试管相等时，依次从水浴锅中拿出试管，并立即加入碘液一滴，观察并记录各管颜色，然后确定唾液淀粉酶的最适pH。2温度对酶活性的影响（1）取试管三支，编号，各管均加入稀释唾液2mL，然后将第3管唾液在酒精灯上煮沸。（2）将第1、3管置37恒温水浴锅中保温约5min，第2管置冰水中冷却约5min。（3）分别在各试管中加入0.3%NaCl的1%淀粉液1mL，振荡试管后，各管仍在原温度下作用约20min（三管时间要一致）。（4）将第2管倒出一半于另一试管（设为第4号）中，4号管又置37恒温水浴约20min。（5）在第1、2、3管中各加入一滴碘液，观察颜色并记录结果。（6）第4号管温浴20min后取出，亦滴入一滴碘液，观察颜色变化，并比较第2管颜色。（7）比较各管颜色，解释结果。3抑制剂和活化剂对酶活性的影响（1）取试管四支，编号，各加入稀释唾液2mL，然后于第1管中加入1mL 1%NaCl，第2管加入1mL0.1%CuSO4，第3管加入1mL1%Na2SO4，第4管加入1mL蒸馏水。（2）各管加入1mL0.3%NaCl的1%淀粉液，振荡各试管，然后置于37水浴锅内保温，约5min后，每隔1min从第1管中取出试液1小滴于白瓷板上与碘液反应，直至与碘反应呈橙黄色时，将四支试管从水浴中取出。（3）每管取1滴试液于白瓷板上与碘液反应，比较各管颜色，若加入1%Na2SO4的第3管颜色仍为浅蓝色或蓝色时，则将第2、3、4管再放入37 恒温水浴，直到第3管与碘液反应为橙黄色时，将三支试管同时从水浴锅中取出。（4）每支试管滴入1滴碘液，振荡，比较各管颜色。五、注意事项1. 反应试管应清洗干净,不同酶液,试剂及其滴管不能交叉混用;2. 使用混合唾液,或通过预试选出合适的唾液稀释度,效果更为显著. 3 氯化钠溶液为唾液淀粉酶的激活剂。激活剂和抑制剂不是绝对的，有些物质在低浓度时为激活剂，而在高浓度时则