叶绿体的提取

叶绿体的分离原理：研磨叶片得到的匀浆，经过滤、离心可制备叶绿体。叶绿体的被膜比较脆弱，分离叶绿体应在等渗的缓冲液溶液中，04度温度下进行。叶绿体活力会随着离体时间延长而不断下降，因此，分离工作尽可能在短时间内完成。仪器与用具：冰箱；离心机；扭力天平；显微镜；pH计；研钵；量筒；移液管；离心管；脱脂纱布等。分离器皿都须在0度下预冷。试剂：1. 分离介质：含0.33 mol/L山梨醇，50 mmol/L Tris-HCl（或Tricine）pH7.6，5 mmol/L MgCl2，10 mmol/L NaCl，2 mmol/L EDTA，2 mmol/L 异抗坏血酸纳。 配法：称60 g山梨醇、6.06 g Tris、1 g MgCl26H2O、0.6 g NaCl、0.77 g EDTA-Na2、0.4 g 异抗血酸钠，溶解后用1 mol/L HCl调pH至7.6，定容至1000 ml。2. 悬浮和测定介质：0.66 mol/L 山梨醇，2 mmol/L MgCl2，2 mmol/L MnCl2，4mmol/L EDTA，10 mmol/L 焦磷酸钠，100mmol/L Tris-HCl pH7.6。 配法：称60g山梨醇、0.2g MgCl26H2O、0.2g MnCl24H2O、0.75g EDTA-Na2、2.23g Na4P2O710H2O、6.06g Tris，溶解后用1 mol/L HCl调pH至7.6，定容至500ml。3. 悬浮和测定介质：测定介质稀释1倍。方法：1. 选用生长健壮，最好是连续几个晴天下生长的菠菜叶片，洗净后去除中脉，放入04度冰箱或冰瓶中预冷。2. 分离介质3050ml，置于研钵中，并在冰箱中预冷至现薄冰。3. 取冷却的菠菜叶片1020g，撕碎后放入研钵，用手工快速研磨0.301min，注意不要用力过猛，也不必研磨过细，以叶片磨成小块时即可，研磨后将匀浆用两层新纱布过滤。4. 将滤液装入预冷过的两个离心管，经天平平衡后，用离心机以1000r/min离心2min。5. 倾去上层液，沉淀即为叶绿体。随后每管加2ml悬浮和测定介质，并用吸管冲散沉淀。叶绿体悬浮液合并后放冰瓶中备用。6. 用滴管吸取少量叶绿体，加少量悬浮和测定介质稀释，置显微镜（400600倍）下，观察叶绿体的形态。叶绿体被膜完整度的测定原理：由于铁氰化钾不能透过被膜，故完整叶绿体在等渗介质中不能进行铁氰化钾光还原的Hill反应。而失去完整被膜的叶绿体，铁氰化钾可以进入类囊体进行Hill反应。而失去完整被膜的叶绿体，铁氰化钾可以进入类囊体进行Hill反应。根据这一原理，比较胀破的叶绿体Hill反应速率就可以计算叶绿体被膜的完整度。仪器与用具：氧电极测氧全套装置Rubisco（RuBP羧化酶）活性的测定原理：根据Cavinl循环得知，在RuBP羧化酶作用下1 mol RuBP与1 mol CO2反应生成2 mol 3-磷酸甘油酸，后者在3-磷酸甘油酸激酶和3-磷酸甘油醛脱氢酶作用下，被NADH还原成3-磷酸甘油醛，其反应如下： RuBP羧化酶，Mg2+RuBP+CO2 + H2O 23-PGA 3-PGA激酶，Mg2+23-PGA + 2ATP 21，3-二磷酸甘油酸 + 2ADP 3-磷酸甘油醛脱氢酶21，3-二磷酸甘油酸 + 2NADH 23-二磷酸甘油酸 + 2NAD+ +2Pi从上述总式可以看出，每固定1 mol CO2就有2 mol NADH被氧化，NADH的减少量可用分光光度计在340 nm下测出，进而计算出RuBP羧化酶的活性。仪器与用具：分光光度