生物制药学

动物细胞制药生产用动物细胞的要求和获得 ； 动物细胞的大规模生产流程； 动物细胞的生产特征 （动物细胞的培养条件和培养基）； 动物细胞培养技术（培养方法和操作技术） ；内容：细胞是一切动、植物体的基本结构单位细胞培养的概念p 组织培养或细胞培养：将组织或细胞从机体取出。在体外模拟机体体内的生理条件下进行培养，使之生存和生长；（课本）p 动物细胞培养：体外培养，即在无菌条件下，从机体中取出组织或细胞，或利用已经建立的动物细胞系，模拟机体正常生理状态下生存的基本条件，让细胞在培养容器中生存、生长和繁殖的方法。p 组织培养：动物组织在体外条件下的保存或生长，此时可能有组织分化，并保持组织的结构和功能。细胞工程的概念p 细胞工程是以细胞为单位，按人们的意志，应用细胞生物学、分子生物学等理论和技术，有目的地进行精心设计，精心操作。使细胞的某些遗传特性发生改变，从而达到改良或产生新品种的目的，以及使细胞增加或重新获得产生某种特定产物的能力，从而在离体条件下进行大量培养、增殖，并提取出对人类有用的产品。微生物动物细胞植物细胞大小um1101010010100悬浮生长可以大多数不可以可以，但易成团，无单个细胞营养要求简单非常复杂较复杂生长速率快，0.5-5h慢15-100h慢24-74h代谢调节内部内部，激素内部，激素环境敏感不敏感特敏感较敏感细胞分化无有有剪切力敏感低非常高高细胞或产物浓度较高低低动物细胞的结构较原核细胞复杂得多，各种细胞都有明确的分工；细胞生长和基质依赖性p 生长基质（growth substratum）： 概念： 改变生长表面特性，促进细胞贴附的物质； 胞外基质成分：多聚赖氨酸、胶原。p 接触抑制（ contact inhibition）： 细胞在生长基质上分裂增殖，逐渐汇成片，当每个细胞与其周围的细胞互相接触时，细胞就停止增殖 特点：保持充足的营养，细胞仍可存活一段时间，但细胞密度不再增加； 大多数细胞有； 少数悬浮培养细胞无。按基质依赖性细胞的分类p 贴壁依赖性细胞（anchoraged-dependent cell）；p 非贴壁依赖性细胞（anchoraged-independent cell）或悬浮细胞；p 兼性贴壁依赖性细胞。贴壁依赖性细胞（anchoraged-dependent cell）p 概念：需要有适量带电荷的固体或半固体支持表面才能生长的细胞；p 细胞依靠自身分泌的或培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长、增殖；p 当细胞在该表面生长后，一般形成两种形态，即成纤维样细胞型或上皮样细胞型；兼性贴壁依赖性细胞: 理想的药物生产细胞系动物细胞的生理特点p 分裂周期长（一般1248h，不同种属，不同部位可能时间不同）；p 生长一般需贴附于基质，并有接触抑制现象；p 正常二倍体细胞的生长寿命是有限的（30代，50代，与细胞种族和年龄有关）；p 动物细胞对周围环境十分敏感；p 动物细胞对培养基的要求高；p 蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同。动物细胞蛋白质合成场所p 游离核糖体：合成的蛋白质用于细胞质基质内；p 粗糙内质网上的核糖体：合成的蛋白质是分泌性的和膜中整合的蛋白质，它们多数为糖蛋白。这些寡糖链，有的在内质网中加接（N链寡糖），有的在高尔基体内加接（O链寡糖）；p 蛋白质的糖基化作用：与细胞的许多生理功能密切相关，如细胞识别、表面受体、胞内消化和外排分泌物等；由生理特点得出的结论p 作为宿主，生产药品的不足： 条件； 成本； 产量。p 优点： 胞外产物； 翻译后修饰； 糖基化。转化细胞系p 概念：染色体的断裂变成异倍体，失去了正常细胞的特点，而获得了无限增殖的能力；哺乳动物细胞系p CHO细胞：（Chinese hamster ovary，CHO）中国仓鼠卵巢；p BHK21：幼仓鼠的肾脏（baby hamster kidney, BHK）；p Vero细胞CHO细胞p 最为普遍和成熟表达糖基化蛋白药物的细胞；p 目前广泛用于构建工程细胞的是一株缺乏二氢叶酸还原酶的营养缺陷突变株CHOdhfr-;BHK21成纤维样细胞，用于增殖病毒、制备疫苗（口蹄疫、狂犬病疫苗）和重组蛋白Vero细胞p 可支持多种病毒的增殖并制成疫苗： 如脊髓灰质炎疫苗； 狂犬病疫苗； 乙脑。昆虫细胞系生产抗体、试剂盒，生物学研究。细胞库的建立p 两个细胞库：原始细胞库（master cell bank,MCB）和生产用细胞库（manufactures working cell bank,MWCB）或称工作细胞库（working cell bank，WCB）。细胞系的保存p 短期保存： p 长期保存：p 防受伤的措施：p 冷冻、解冻方法。作业p 用基因工程方法生产重组药物时，为什么一些生物药物不能用原核细胞表达？p 最常用的两种药物生产哺乳动物源细胞系是什么，有什么特点？哺乳动物细胞最佳培养温度为（370.5）；耐受温度范围较窄，3537死亡：43以上低温抑制生长pH值：细胞的最适pH7.27.4人体：血液pH比较恒定，7.367.44p 氧气：高氧环境：O2浓度60%以上，对细胞毒性较大，抑制生长和增殖，出现染色体异常等现象；（一）动物细胞对培养基的要求高p 完全异养，容易利用相对低分子量的营养物；p 12种必需氨基酸；p 8种以上维生素；p 多种附加成分：生长类、细胞因子和贴壁因子及激素、结合蛋白质等；能源和碳源物质糖类p 主要：葡萄糖（常需要补丙酮酸钠）和谷氨酰胺；p 不能利用：多糖、双糖、寡糖等聚合物氮源氨基酸p 不能利用：多肽、蛋白质等高分子聚合物；p 12种AA必须添加：Arg、Cys、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Trp、Tyr、Val；（Tip，Hall，MTV，CT）p 细胞只能利用？型AA；p 谷氨酰胺:重要碳源和能源维生素：代谢和生长起调节和控制作用无机盐类：一般为生理盐水的离子浓度（0.9%）。生长类因子与激素p 激素：胰岛素是最常用的激素，p 贴附因子：胶原等；p 脂类化合物：细胞生长必需的，类脂及其前体和血清常平行使用。特别是缺陷性细胞，对某种脂类有很高的依赖性。合成培养基：缺点：不能直接使用；需要添加5-20血清，才能培养无血清培养基p 概念：全部用已知成分组配、不加血清的合成培养基；p 组成：合成培养基基础之上，添加激素与生长因子、结合蛋白、贴壁与伸展因子、低分子量营养因子；p 当前市场上可获得的适于各种细胞的无血清培养基见P99表38贴壁悬浮培养（假悬浮培养）微载体培养p 概念：细胞贴附于微载体上伸展和增殖，再悬浮于培养液中的培养过程；p 兼具贴壁和悬浮培养的双重优点动物细胞培养的操作方式：灌流式（perfusion）操作 灌流式操作 p 细胞和培养基一起加入反应器，反应过程中不断地将部分条件培养基取出，同时不断地补充新鲜培养基。p 灌流式操作在某些生物反应器中是唯一可行的操作方式， 红细胞生成素（erythropoietin，EPO）：对红细胞生成起特异性刺激作用的细胞因子。红细胞生成素是一种糖蛋白，在胎儿体内由肾脏及肝脏产生，而在成人体内主要由肾脏产生。肾功能受到损害，红细胞生成素的产生受阻，可导致贫血；EPO的理化性质：糖链占分子量的39%；糖基化程度与准确性对活性影响很大；rhEPO的表达研究：在哺乳动物细胞CHO、BHK细胞系统中表达，与天然红细胞生成素相似。工业生产中大规模生产使用。构建表达红细胞生成素的细胞株：然后筛选阳性克隆用胰酶消化抗性克隆培养出的细胞；抗体制药抗体是高等脊椎生物的免疫系统受到抗原刺激后，由成熟的B淋巴细胞产生的能够与该抗原发生特异结合的糖蛋白分子，它是机体免疫系统中最重要的效应分子，具有结合抗原、结合补体、中和毒素、介导细胞毒、促进吞噬等功能，从而发挥抗感染、抗肿瘤、免疫调节与监视等作用，因此，抗体又称为免疫球蛋白。单克隆抗体阶段p 多克隆抗体的不均一性，p 第二代抗体或细胞工程抗体：p 单克隆抗体与多克隆抗体最主要的区别是单克隆抗体为单一种B细胞所产生的一种均一的免疫球蛋白分子；基因工程抗体：将抗体的基因按不同需要进行改造和重组，然后导入适当的受体细胞中进行表达；单克隆抗体的生产流程： 抗原与动物免疫； 细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养； 筛选阳性克隆与克隆化； 杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定 ； 单克隆抗体的大量制备； 单克隆抗体的纯化p 第三代抗体：以1994年Winter以基因工程方法制备抗体为代表；p 单克隆抗体的缺陷：单克隆抗体多是由鼠B细胞与鼠骨髓瘤细胞经细胞融合形成的杂交瘤细胞分泌的，具有鼠源性，进入人体后会引起人抗抗体反应（HAMA反应）。参与体内免疫反应的来自骨髓的两类细胞： B淋巴细胞，有合成一种抗体的遗传基因； T淋巴细胞，帮助淋巴细胞产生抗体。有上百万种不同的B淋巴细胞系，含遗传基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体；当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞，被激活的B细胞分裂增殖，并合成多种抗体。单克隆抗体：是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的；由于这种抗体是针对一个抗原决定簇的抗体，又是单一的B淋巴细胞产生的，故称为单克隆抗体。因免疫动物品系和骨髓瘤细胞在种系发生上距离越远，产生的杂交瘤越不稳定、故一般采用与骨髓瘤供体同一品系的动物进行免疫此图用的是间接法测抗体，原理是用酶标记的抗体以检测已于固相结合的受检抗体，故称为间接法。克隆化：是指单个细胞通过无性繁殖而获得细胞集团的整个培养过程，这种细胞集团的每个细胞的生物学特性和功能完全相同一般经过大约3次的克隆化，才能达到100孔内均为抗体阳性细胞克隆；多克隆抗体阶段p 第一代抗体：以1890年Behring发现白喉抗毒素为代表；p 特点：用抗原免疫动物获得多克隆抗体；p 多克隆抗体：将某种天然抗原经各种途径免疫动物，成熟的B细胞克隆受到抗原刺激后，便产生抗体并将之分泌到血清和体液中，这种抗体实际是一种混合物，因此又称多克隆抗体；p 病原微生物含有多种抗原决定簇的抗原物质，因此这些抗体制剂也是多种抗体的混合物。酶工程酶工程：以应用的目的出发研究酶、应用酶的特异性催化功能并通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术固定化酶：是指限定或固定于特定空间位置的酶，具体来说，是指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失，而又能发挥催化作用的酶制剂。固定化酶：优点： 较长时间、多次使用，多数稳定性提高； 反应结束后易分离，产物易纯化，产品质量高； 反应条件易于控制； 酶利用效率高； 更适于多酶反应。p 缺点： 固定时，活力有损失； 成本； 只适于可溶性底物，较适于小分子底物。p 载体结合法：将酶结合到不溶性载体上，根据结合形式的不同，分为以下三类： 物理吸附法：用物理方法将酶吸附于不溶性载体上； 离子结合法：酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶性载体上； 共价结合法：酶以共价键结合于载体上，酶分子上非活性部位功能团与载体表面活泼基团间发生化学反应形成共价键。由于载体上的功能基团与酶分子上的侧链基团间不具有直接反应的能力，因此在偶联反应前，需先进行载体活化，在载体上引进某种活泼基团，然后此活泼基团再与酶分子上某一基团反应形成共价结合。重氮法：这是带芳香氨基载体的主要反应叠氮法：适用于含羟基、羧甲基等的载体。交联法(crosslinking定义：利用双功能试剂或多功能试剂(bifunctional or multi-functional)在酶分子间，酶分子与惰性蛋白间，或酶分子与载体间进行交联反应，以共价键制备固定化酶的方法；微囊化法制备固定化酶的方法p 界面沉淀法；p 界面聚合法；p 脂质体包埋方法；p 纤维包埋法。固定化酶在医疗治疗上的应用：作为“人工脏器”用于除去有害的毒性物质及有潜在毒害作用的代谢尾产物：如清除尿毒症病人体内积累的尿素；同种酶，采用不同的方法或不同载体固定化后，其最适温度可能不同。氨基酰化酶：世界上第一种工业化生产的固定化酶葡萄糖异构酶：世界上生产规模最大的一种固定化酶。将培养好的含葡萄糖异构酶的放线菌细胞用6065热处理15min，该酶就固定在菌体上，制成固定化酶，用于连续生产果葡糖浆。此外，也可用吸附法、结合法、凝胶包埋法、交联法或双重固定化法等进行固定化。(3) 天门冬氨酸酶：利用固定化细胞或固定化酶将延胡索酸转化生产天门冬氨酸。 青霉素酰化酶： 这是在医药工业上广泛应用的一种固定化酶。用于制造各种半合成青霉素和头孢霉素。用于酶进行催化反应的容器及其附属设备称为酶反应器酶反应器是用于完成酶促反应的核心装置。它为酶催化反应提供合适的场所和最佳的反应条件，酶工程在药物生产方面的应用：体外循环装置：人工肾脏1992年，美国FDA明确要求对于具有手性特性的化学药物，都必需说明其两个对映体在体内的不同生理活性、药理作用以及药物代谢动力学情况。pH的控制：可以从以2大方面进行控制：1 培养基：（1）调节好基础料的pH：灭菌后（消后）pH值往往降低；（2）在基础料中加入维持pH的物质2 补料调节pH值：（1）补料； 通过补料调节pH （2）加酸碱。当补料与调pH发生矛盾时，加酸碱调pH 需氧：生理特性，反映在摄氧率上，如营养物质浓度和菌种特性。基因工程制药基因工程干扰素的生产 基因工程大肠杆菌发酵生产工艺； 基因工程假单胞杆菌发酵生产工艺。p 基因工程假单胞杆菌发酵生产干扰素干扰素概念p 概念： （interferon，IFN）：机体受到病毒感染时，免疫细胞产生的一组结构类似、功能接近的细胞因子（或生物调节蛋白）；干扰素分类p 根据分子结构和抗原性的差异分为、等4个类型。每一类干扰素根据蛋白质肽链的氨基酸数量或氨基酸序列的不同分成不同的亚型，如干扰素有24种亚型，其中包括1b 2a 2b等亚型；干扰素比病毒颗粒小干扰素生产工艺路线（3）p 基因工程大肠杆菌发酵生产工艺；p 表达产物：无糖基化，N-met，无活性包涵体；p 工艺特点：发酵过程，随后变性、复性过程；p 优点：来源、纯度、活性、成本。双链cDNA接上dT或dG尾pBR322质粒加上dA或dC转化大肠