DB21 3004-2013 牛羊组织中β-受体激动剂残留检测 超高效液相色谱-串联质谱法.doc

发布辽宁省卫生厅2013-09-08实施2013-03-08发布牛羊组织中-受体激动剂残留检测超高效液相色谱-串联质谱法Determination of -agonists residues in cattle and sheep tissues by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometryDB 21/30042013DB21辽宁省地方标准ICS 67.050X22DB 21/30042013目 次前言1 范围12 规范性引用文件13 测定方法13.1 方法原理13.2 试剂13.3 仪器和设备23.4 测定步骤23.5 结果计算和表述44 检测方法灵敏度、准确度和精密度54.1 灵敏度54.2 准确度54.3 精密度55 附录A（资料性附录）-受体激动剂特征离子质量色谱图6A.1 标准溶液特征离子质量色谱图6A.2 空白加内标样品溶液特征离子质量色谱图7A.3 回收样品溶液特征离子质量色谱图8DB 21/30042013前 言本标准按照GB/T 1.1-2009规定编制。本标准由辽宁省畜牧兽医局提出并归口并解释。本标准由辽宁省卫生厅发布。本标准参照农业部1025号公告-18-2008动物源性食品中-受体激动剂残留检测 液相色谱-串联质谱法。本标准起草单位：农业部饲料质量及畜产品安全监督检验测试中心（沈阳）。本标准主要起草人：刘敬先 徐丽佳 苗翠 刘笑 王丽娜 李楠 李廷 曹忠君 程屹 马雷 赵小冬。DB 21/30042013牛羊组织中-受体激动剂残留检测 超高效液相色谱-串联质谱法1 范围本标准规定了牛肉、牛肝、羊肉、羊肝中特布他林、西马特罗、沙丁胺醇、非诺特罗、氯丙那林、莱克多巴胺、克伦特罗、妥布特罗和喷布特罗残留检测的制样和液相色谱-串联质谱测定方法。本标准适用于牛肉、牛肝、羊肉、羊肝中特布他林、西马特罗、沙丁胺醇、非诺特罗、氯丙那林、莱克多巴胺、克伦特罗、妥布特罗和喷布特罗单个或混合物残留量的检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规则和试验方法农业部1025号公告-18-2008 动物源性食品中-受体激动剂残留检测 液相色谱-串联质谱法3 测定方法3.1 方法原理试料中的-受体激动剂残留经乙酸铵提取和-盐酸葡萄糖醛苷酶的酶解后，用高氯酸沉淀提取液中蛋白和部分杂质，调pH值过混合阳离子固相萃取柱净化，超高效液相色谱-串联质谱法测定。3.2 试剂以下所用的试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂；水为符合GB/T6682规定的一级水。3.2.1 标准品：特布他林、西马特罗、沙丁胺醇、非诺特罗、氯丙那林、莱克多巴胺、克伦特罗、妥布特罗和喷布特罗，纯度均95.0 %。3.2.2 同位素内标：克伦特罗-D9、莱克多巴胺-D3、沙丁胺醇-D3，纯度均92.0 %。3.2.3 甲醇：色谱纯（Fisher Scientific）。3.2.4 乙腈：色谱纯（Fisher Scientific）。3.2.5 甲酸：色谱纯，纯度99.0%。3.2.6 甲酸水溶液（0.2 %）：取1 mL甲酸至500 mL容量瓶中，用水定容至刻度。3.2.7 乙酸铵：分析纯，含量98.0%。3.2.8 乙酸铵缓冲液（0.2 mol/L）：称取15.4 g乙酸铵，溶解于1000 mL水中，用适量乙酸调pH值至4.6。3.2.9 高氯酸：分析纯，含量为70 %72 %。3.2.10 氢氧化钠：分析纯，含量96.0%3.2.11 氢氧化钠溶液（10 mol/L）：称取40 g氢氧化钠到200 mL烧杯中，加入100 mL水后，摇匀放冷。3.2.12 氨水：分析纯，含（NH3）量为25%28%。3.2.13 氨化甲醇溶液（5%）：取5 mL氨水至100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。3.2.14 盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶（-Glucuronidase/aryl sulfatase，2 mL，Merck Germany）。1DB 21/300420133.2.15 标准储备液（100 g/mL）：准确称取适量的特布他林、西马特罗、沙丁胺醇、非诺特罗、氯丙那林、莱克多巴胺、克伦特罗、妥布特罗和喷布特罗对照品，用甲醇分别配制成100 g/mL的标准储备液，28 冰箱中保存，有效期为3个月。3.2.16 混合标准中间液（1 g/mL）：分别准确吸取1.0 mL的特布他林、西马特罗、沙丁胺醇、非诺特罗、氯丙那林、莱克多巴胺、克伦特罗、妥布特罗和喷布特罗标准储备液至100 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，28 冰箱中保存，有效期为1个月。3.2.17 同位素内标储备液（100 g/mL）：分别取三种同位素内标，各自用甲醇配成浓度约为100 g/mL的储备液，28 冰箱中保存，有效期为3个月。3.2.18 混合同位素内标工作液（100 g/L）：将上述三种同位素内标储备液，用0.2%甲酸水溶液稀释成约100 g/L的混合工作液，28 冰箱中保存，有效期为1个月。3.2.19 混合标准及内标工作液（10 g/L）：准确吸取1.0 mL的混合标准中间液（3.2.16）和10.0 mL混合同位素内标工作液（3.2.18）至100 mL容量瓶中，用0.2%甲酸水溶液稀释至刻度，28 冰箱中保存，有效期为1周。3.3 仪器和设备3.3.1 超高效液相色谱-串联质谱仪（配电喷雾离子源）。3.3.2 涡旋混合器。3.3.3 冷冻离心机。3.3.4 恒温定时振荡器。3.3.5 旋转蒸发仪。3.3.6 固相萃取装置。3.3.7 MCX固相萃取柱(CNW ，for -agonists)：60 mg/3 mL。3.3.8 氮吹仪。3.4 测定步骤3.4.1 样品处理试料的制备包括：取适量新鲜或冷冻的空白或供试组织，绞碎后，以10000 r/min的转速均质5 min使其均匀。上述制备过的牛肉、牛肝、羊肉、羊肝样品，于-20 以下贮存。取均质后的供试料品，作为供试试样。取均质后的空白样品，作为空白试样。取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为阳性添加试料。3.4.2 酶解准确称取2 g0.02 g试样于50 mL离心管内，加入100 L内标工作液（3.2.18），再加入10.0 mL乙酸铵溶液（3.2.8），再加入-盐酸葡萄糖醛苷酶（3.2.14）40 L，涡旋混匀，于37下避光恒温振荡16 h。3.4.3 提取酶解后放置至室温，涡旋混匀，10000 r/min高速离心10 min，倾出上清液与另一50 mL离心管内，加入0.5 mL高氯酸（3.2.9），涡旋混匀，10000 r/min离心10 min后，将上清液转移至另一50 mL离心管内，用NaOH溶液（3.2.11）调pH值至2.50.2，备用。3.4.4 净化2DB 21/30042013固相萃取柱（3.3.7）依次用甲醇、水各3 mL活化，取备用液全部过柱，再依次用水、甲醇各3 mL淋洗，抽干，用4 .0 mL氨化甲醇溶液（3.2.13）洗脱；洗脱液在50下用氮气吹干。残余物用0.5 mL甲酸水溶液（3.2.6）溶解，涡旋混匀，过0.22 m水相微孔滤膜，供超高效液相色谱-串联质谱仪测定。3.4.5 标准曲线的制备分别量取混合标准及内标工作液（3.2.19）2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，至10mL容量瓶中，用0.2%甲酸稀释至刻度，制成2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 g/L的标准曲线。3.4.6 液相色谱参考条件 色谱柱：BEH C18(50 mm2.1 mm，1.7 m)，或相当者； 流动相：A相：0.1 %甲酸乙腈溶液；B相：0.1 %甲酸水溶液；梯度洗脱：0 min 1 min，维持5 %A；1 min 3 min，5 %A线性变化至50 % A；3 min 4 min，50 % A线性变化至60 %A；4 min 5 min，60 % A线性变化至99%A；5 min 5.5 min，99 % A线性变化至5%A； 5.5 min 7.5 min，维持5%A；流速：0.4 mL/min；柱温：30 ；进样量：10 L。3.4.7 质谱参考条件离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；电离电压：3.2 kV；源温：120；雾化温度：350；锥孔气流速：50 L/h；雾化气流速：650 L/h；目标药物保留时间、母离子与锥孔电压、子离子与碰撞能量见表1、表2。表1 9种-受体激动剂保留时间、定性定量离子对及锥孔电压、碰撞能量目标药物名称保留时间（min）定性离子对（m/z）定量离子对（m/z）锥孔电压(V)碰撞能量(eV)特布他林1.30225.97124.89225.97151.87225.97151.87302515西马特罗1.33219.98130.95219.98202.10219.98202.10304010沙丁胺醇1.35240.08146.96240.08222.08240.08146.96302010非诺特罗1.69304.05106.93304.05134.92304.05106.93403520氯丙那林2.07213.93153.82213.93195.86213.93153.823520153DB 21/30042013表1（续）莱克多巴胺2.05302.10107.00302.10163.91302.10163.91403015克伦特罗2.24276.95202.78276.95258.96276.95202.78401510妥布特罗2.25227.98153.84227.98171.77227.98153.84352015喷布特罗3.36292.14201.02292.14235.98292.14235.98452010表2 3种-受体激动剂内标保留时间、定量离子对及锥孔电压、碰撞能量目标药物名称保留时间（min）定量离子对（m/z）锥孔电压(V)碰撞能量(eV)沙丁胺醇-D31.34243.04150.763025莱克多巴胺-D32.04305.05166.774030克伦特罗-D92.24285.98203.940153.4.8 测定法作单点或标准曲线校准，按内标法以峰面积比计算。试样及阳性添加的上机溶液中特布他林、西马特罗、沙丁胺醇、非诺特罗、氯丙那林、莱克多巴胺、克伦特罗、妥布特罗和喷布特罗的峰面积均应在仪器检测的线性范围之内。试样上机溶液中的离子相对丰度与阳性添加溶液中的离子相对丰度相比，须符合表3的要求。标准溶液、空白样品溶液、回收样品溶液中各特征离子的质量色谱图分别见附录A中图A.13。表3 离子相对丰度的允许偏差范围相对丰度（%）允许偏差（%）502020-502510-203010503.4.9 空白试验取空白试料，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。3.5 结果计算和表述单点校准： Ci= （1）4 或标准曲线校准：由 =+ （2）DB 21/30042013求得和，则 Ci =(-b). （3） 按下式计算试样中-受体激动剂残留量： X= . （4） 式中：试样溶液中相应-受体激动剂的浓度，g/L；试样溶液中相应-受体激动剂内标的浓度，g/L；标准溶液中相应-受体激动剂的浓度，g/L；标准溶液中相应-受体激动剂内标的浓度，g/L；试料溶液中相应-受体激动剂的峰面积；试料溶液中相应-受体激动剂内标的峰面积；标准溶液中相应-受体激动剂的峰面积；标准溶液中相应-受体激动剂内标的峰面积； 试样中相应-受体激动剂的残留量，g/kg； 溶解残余物所得试样溶液体积，mL； 组织样品的质量，g。注：计算结果须扣除空白值，结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。4 检测方法灵敏度、准确度和精密度4.1 灵敏度特布他林、西马特罗、沙丁胺醇、非诺特罗、氯丙那林、莱克多巴胺、克伦特罗、妥布特罗和喷布特罗在牛肉、牛肝、羊肉、羊肝中的检测限为0.25 g/kg，定量限为0.50 g/kg。4.2 准确度 在1.0 g/kg10.0 g/kg添加浓度范围内，克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇用内标法计算回收率范围为70%120%；特布他林、西马特罗、非诺特罗、氯丙那林、妥布特罗、喷布特罗用外标法计算回收率为60%110%。4.3 精密度批内相对标准偏差15 %，批间相对标准偏差20 %。5DB