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ING 4和FP 248基因检测在白血病和消化道肿瘤中的临床意义,学生 李继刚 导师 许文荣 江苏大学基础医学与医学技术学院 2008年06月06日,一 研究背景,1. ING 4基因 (1) ING 4基因的生物学特性及功能,p13.31,ING 4，8个外显子,诱导P21表达上调,（2） ING 4的变异与肿瘤发生的关系,神经母细胞瘤细胞株,肺 癌 细 胞 株,乳 腺 癌 细 胞 株,结直肠癌细胞株,ING 4 变异,白血病？,健康人心、脑、肝、肺、肾组织,ING4-V1:30%35% ING4-V2:42%50%,成人及胎儿心、脑、肝、肺、肾 肿瘤组织,白血病？ 消化道肿瘤？,本研究检测白血病患者骨髓 中主要剪接方式,(3) ING 4 在多种肿瘤组织中表达下调,ING 4,神经胶质瘤,头颈部鳞状细胞癌,肺癌,消化道肿瘤 白血病,？,2.原癌基因FP 248,8q24.3，FP248，3个外显子,8,与肝癌有关,FP 248蛋白质， 208aa,其他肿瘤 ？,二 研究内容和研究意义,1.研究目的 建立检测ING 4和FP 248基因的real time RT-PCR和nested RT-PCR方法，并分析ING 4和FP 248基因对白血病和消化道肿瘤的诊断意义。,3. 研究内容,建立采用RT-PCR和real-time RT-PCR检 测ING 4和FP 248 mRNA表达的方法,研究ING 4 和FP 248在多种肿 瘤细胞株中的表达水平,ING 4和FP 248基因在 白血病中的临床意义,ING 4 和FP 248基因在消化道 肿瘤中的临床意义,3.研究意义 为白血病和消化道肿瘤的诊断和预后提供新的更为便捷的方 法和指 标，也为这些疾病的基因治疗提供了两个靶基因。,注:A：ING 4 标准品扩增曲线；B：ING 4标准品扩增产物融解曲线，C：ING 4标准曲线 . 图1. ING 4 标准品,三 方法建立,1.成功建立了采用real-time RT-PCR检测ING 4和FP 248基因表达的方法,注：A：FP 248标准品扩增曲线； B：FP 248标准品扩增产物融解曲线 C：FP 248标准曲线. 图2. FP 248 标准品,注： A： GAPDH 标准品扩增产物融解曲线； B：GAPDH标准品扩增曲线； C：GAPDH标准曲线。 图3. GAPDH标准品,2.成功建立了采用Western 印迹技术检测ING 4蛋白质表达的方法； 3.成功建立了采用免疫组织化学技术检测组织中ING 4蛋白质表达的方法。,表1.real-time RT-PCR关键参数,1.实验设计,四、肿瘤细胞株中ING4 和FP 248基因 表达检测,肿瘤细胞,抽提总RNA,检测ING 4 mRNA,检测FP248 mRNA,注： A.细胞株中ING 4基因及部分标准品扩增曲线 标准品浓度：102copies/l和103copies/l及 108copies/l.,2.研究结果,A,B. real-time RT-PCR测定结果 1：SW480；2：SGC；3：U937；4：hBM-MSC.,B,C. RT-PCR测定结果 1：SW480；2：SGC；3：U937；4：hBM-MSC.,C,图4. FP248 在肿瘤细胞中的表达,注： A.real-time RT-PCR 扩增曲线。B. real-time RT-PCR 检测FP248 mRNA 实验重复3次。 1：U937；2：SGC； 3：hBM-MSC；4：PLA801-95D；5：A549。C. RT-PCR检测 FP 248 mRNA b：blank；1： U937；2：SGC；3：hBM-MSC；4：PLA801-95D；5：A549；6：PC3；7：SW480；M：DNA marker (100bps DNA Ladder)。 图5. FP248 在肿瘤细胞中的表达,A,B,C,五、 ING 4和FP 248基因检测在白血 病中的表达及临床意义,表.骨髓标本和标本资料,注：以上标本由江苏大学附属医院提供,骨髓和外周血,分离单个核细胞,抽提总RNA,逆转录并检测 ING 4 基因表达,检测FP 248 mRNA,分析临床意义,分析临床意义,抽提DNA,测序,测序,1.研究方案,注：I.部分骨髓及外周血标本中ING4基因扩增曲线 II：白血病患者骨髓中ING 4表达水平 1：健康对照； 2：缺铁性贫血患者骨髓；3：免疫性血小板减少患者骨髓；4：ALL患者骨髓；5：CLL患者骨髓； 6：CML患者骨髓；7：CML急性变患者骨髓；8：M2骨髓；9： MDS骨髓。III：白血患者外 周血ING 4 1：健康对照；2：M2； 3：AML；4：CML；5：ALL。IV： Western 印迹检测结果 A1：缺铁性贫血； A2：AML；B1：缺铁性贫血；B2：CML；C1：缺铁性贫血；C2：ALL。 图6. ING 4基因在白血病患者骨髓及外周血中的表达水平,I,II,III,2.研究结果,IV,注：A,B 和C. ING4基因cDNA测序部分图谱 框内部 分 为第四和第五外显子接头处易缺失序列。 A：AML, n=4; B：CML，n=5；C：ALL，n5。,A,B,C,D,图7. ALL患者骨髓中ING4基因组DNA测序部分图谱,D. ALL患者骨髓中ING4基因组DNA测序部分图谱 框内 部分为第四和第五外显子接头处易缺失序列，左为基因组DNA第四外显子部分序列，右为第五外显子部分序列，n=5。,注：I.部分白血病标本及对照组标本中FP 248定量扩增曲线. II. real-time RT- PCR测定结果 1：缺铁性贫血和健 康人骨髓； 2：CML患者骨髓；3.两例女性CML患者急性变后骨髓；4：两例女性CML患者急性变骨髓，HA 和DAT化 疗2周后； 5：ALL患者骨髓； 6： M2患者骨髓；7：M3患者骨髓；8：5例M2外周血；9：健康体检者外周血。 III.RT-PCR测定结果 A.白血病患者骨髓和外周血中FP 248 mRNA 表达 1：健康体检者外周血；2：M2外周血； 3：CML患者骨髓；4：CML急性变患者骨髓；5：ALL患者骨髓；6：M2患者骨髓；7：M3患者骨髓；8-12： 缺铁性贫血患者骨髓；13：blank；M：DNA marker（DL2000）。 B. ALL患者外周血中FP 248 mRNA表达 1：健康体检 者外周血；24：ALL患者外周血；M：DNA marker（DL2000）。C. ALL患者骨髓中FP 248 mRNA表达 1:blank； 2：ALL骨髓；3：缺铁性贫血患者骨髓；M：DNA marker（DL2000）。 图8. 白血病骨髓或外周血中FP 248 mRNA的表达,I,II,表2.白血病标本中FP 248 mRNA阳性率,III,P0.05,六、ING 4和FP 248基因表达检测在 消化道肿瘤中的临床意义,表3.消化道肿瘤病例资料,注：示采集手术前外周血和手术1周后外周血，健康体检者外周血资料同第五部分,1.研究方案,胃癌 结肠癌 直肠癌,组织,检测ING4蛋白质,检测ING4 mRNA,外周血,检测FP248 mRNA,分 析 临 床 意 义,检测FP248 mRNA,检测ING4 mRNA,食道癌组织,A,B,C,D,a,b,注：A .ING 4基因扩增曲线 B.ING 4基因相对定量结果 1.结肠癌；2和3为直肠癌；416为胃癌。 C. Western 印迹检测ING 4蛋白表达水平 p：阳性对照；a：胃癌；b.结肠癌；c：直肠癌；d：食道癌； e：食道癌； 1表示癌旁组织，2表示癌组织。 D.免疫组化技术检测 ING 4在胃癌组织中的表 达 （100） a.胃癌旁组织；b.胃癌组织 图9. ING 4消化道肿瘤组织中表达,2. 研究结果,注：A.胃癌结肠癌直肠癌中各分期中ING 4 基因表达 未见显著性差异(P0.05)。 B和C. ING4表达水 平与组织分化程度的关系 组织分化水平越低，ING 4表达越低（ P0.05) . D. ING 4表达水平与 患者预后的关系 2年内复发或转移的患者表达水平显著低于未 复发的患者（ P0.05) 。 图10. 消化道肿瘤组织中ING 4基因表达水平与消化道肿瘤分期、组织分化程度以及患者预后的关系,表4.消化道肿瘤分期及组织分化程度,分期方法：Robson 分期法,高分化,中分化,中低分化,低分化,未复发,复发,注. I.部分消化道组织中FP248基因扩增曲线 IIreal-time定量PCR结果 a. 胃癌 ，b. 结肠癌，c. 直肠 癌 。1：癌旁组织； 2：癌组织；3：癌旁淋巴结；III.RTPCR结果 1：结肠癌；2：直肠癌； 38：胃癌；9：食道癌；N：癌旁组织；C：癌组织；L：淋巴结转移灶；B：blank；S：标准 品； M：DNA marker (100bps DNA Ladder)。 图11. real-time定量PCR检测FP 248 在 消化道肿瘤中的表达,I,II,III,表5. 癌组织和淋巴结组织中FP 248 mRNA阳性率,注：A.胃癌、结肠癌和直肠癌中FP 248表达与病理分期之间的关系 未见显著性差异(P0.05). B和C：FP 248 mRNA表达水平与组织分化程度的关系 分化程度越低，FP 248 mRNA表达水平越高(P0.05)。D. FP 248 基因表达水平与患者预后的关系 2年内复发的患者FP 248基因表达水平显著于未复发者(P0.05)。 图12.消化道肿瘤组织中FP 248 基因表达水平与消化道肿瘤分期、组织分化程度以及患者预后的关系,表4.消化道肿瘤分期及组织分化程度,分期方法：Robson 分期法,高分化,中分化,中低分化,低分化,未复发,复发,注：A. RT-PCR。B. nested RT-PCR。blank：空白对照。a、b和c：胃癌; d和e：结肠癌；f和g：直肠癌；h：marker，DL2000；i：健康体检。1为手术前，2为手术后。 图13. ING4基因在消化道肿瘤患者外周血单个盒细胞中的表达,注：a、b、c为癌组织阳性的胃癌患者，d、e、f为 癌组织阳性的结肠癌患者，g、h为癌组织阳性的直肠 癌患者，M为 DNA marker (DL2000)。 图14. nested RT-PCR检测消化道肿瘤患者外周血单个核细胞中FP 248的表达,表6.手术前后外周血单个核细胞中FP 248 mRNA阳性率,表7. 外周血单个核细胞中FP 248 mRNA阳性率与预后的关系,与健康对照组相比，P0.05，2检验,与手术一周后为阴性的患者相比，P0.05，2检验,七.结论,ING4基因表达下调和FP248基因与胃癌等消化道肿瘤和白血病的发生发展可能存在相关性，检测这两个基因的表达有助于消化道肿瘤的诊断和预后。 采用nested RT-PCR检测外周血单个核细胞中FP248基因是筛选消化道肿瘤的好方法。,致谢,特别感谢许文荣教授的悉心指导！ 衷心感谢钱晖老师和朱伟老师的关心和帮助！ 感谢各位专家的百忙之中指导本人答辩！ 感谢我的同学和师弟师妹们的帮助和支持！,发表文章,1. 李继刚， 许文荣， 钱 晖，朱 伟 ，王 胜，步雪峰，张 蕾 蕾，徐 静， 司煜安，陈 忠，周忠海，周洪兴，施晓凤. fp 248 mRNA在白血病和肿瘤中的诊断意义. 临床检验杂志， 2008 年第3期. 2.Jigang Li, We