GB4789.3-2016食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数.pdf

中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准G B4 7 8 9 .32 0 1 6食品安全国家标准食品微生物学检验 大肠菌群计数2 0 1 6 - 1 2 - 2 3发布2 0 1 7 - 0 6 - 2 3实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国 家 食 品 药 品 监 督 管 理 总 局发 布G B4 7 8 9.32 0 1 6 前 言 本标准代替G B4 7 8 9. 32 0 1 0 食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠 菌群计数 、G B/T4 7 8 9.3 22 0 0 2 食品卫生微生物学检验 大肠菌群的快速检测 和S N/T0 1 6 92 0 1 0 进出口食品中大肠菌群、 粪大肠菌群和大肠杆菌检测方法 大肠菌群计数部分。本标准与G B4 7 8 9.32 0 1 0相比, 主要变化如下: 增加了检验原理; 修改了适用范围; 修改了典型菌落的形态描述; 修改了第二法平板菌落数的选择; 修改了第二法证实试验; 修改了第二法平板计数的报告。G B4 7 8 9.32 0 1 61 食品安全国家标准食品微生物学检验 大肠菌群计数1 范围本标准规定了食品中大肠菌群(C o l i f o r m s) 计数的方法。本标准第一法适用于大肠菌群含量较低的食品中大肠菌群的计数; 第二法适用于大肠菌群含量较高的食品中大肠菌群的计数。2 术语和定义2.1 大肠菌群 C o l i f o r m s在一定培养条件下能发酵乳糖、 产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。2.2 最可能数 M o s tp r o b a b l en u m b e r;MP N基于泊松分布的一种间接计数方法。3 检验原理3.1 MP N法MP N法是统计学和微生物学结合的一种定量检测法。待测样品经系列稀释并培养后, 根据其未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度, 应用统计学概率论推算出待测样品中大肠菌群的最大可能数。3.2 平板计数法大肠菌群在固体培养基中发酵乳糖产酸, 在指示剂的作用下形成可计数的红色或紫色, 带有或不带有沉淀环的菌落。4 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外, 其他设备和材料如下:4.1 恒温培养箱:3 6 1。4.2 冰箱:25。4.3 恒温水浴箱:4 61。4.4 天平: 感量0.1g。4.5 均质器。4.6 振荡器。4.7 无菌吸管:1m L( 具0.0 1m L刻度) 、1 0m L( 具0.1m L刻度) 或微量移液器及吸头。4.8 无菌锥形瓶: 容量5 0 0m L。4.9 无菌培养皿: 直径9 0mm。G B4 7 8 9.32 0 1 62 4.1 0 p H计或p H比色管或精密p H试纸。4.1 1 菌落计数器。5 培养基和试剂5.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨(l a u r y l s u l f a t e t r y p t o s e,L S T) 肉汤: 见A.1。5.2 煌绿乳糖胆盐(b r i l l i a n tg r e e nl a c t o s eb i l e,B G L B) 肉汤: 见A.2。5.3 结晶紫中性红胆盐琼脂(v i o l e t r e db i l ea g a r,V R B A) : 见A.3。5.4 无菌磷酸盐缓冲液: 见A.4。5.5 无菌生理盐水: 见A.5。5.6 1m o l/LN a OH溶液: 见A.6。5.7 1m o l/LHC l溶液: 见A.7。第一法 大肠菌群MP N计数法6 检验程序大肠菌群MP N计数的检验程序见图1。图1 大肠菌群MP N计数法检验程序G B4 7 8 9.32 0 1 63 7 操作步骤7.1 样品的稀释7.1.1 固体和半固体样品: 称取2 5g样品, 放入盛有2 2 5m L磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内 ,80 0 0r/m i n 1 00 0 0r/m i n均质1m i n 2m i n, 或放入盛有2 2 5m L磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中, 用拍击式均质器拍打1m i n 2m i n, 制成11 0的样品匀液。7.1.2 液体样品: 以无菌吸管吸取2 5m L样品置盛有2 2 5m L磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶( 瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠) 或其他无菌容器中充分振摇或置于机械振荡器中振摇, 充分混匀, 制成11 0的样品匀液。7.1.3 样品匀液的p H应在6.57.5之间, 必要时分别用1m o l/LN a OH或1m o l/LHC l调节。7.1.4 用1m L无菌吸管或微量移液器吸取11 0样品匀液1m L, 沿管壁缓缓注入9m L磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中( 注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面) , 振摇试管或换用1支1m L无菌吸管反复吹打, 使其混合均匀, 制成11 0 0的样品匀液。7.1.5 根据对样品污染状况的估计, 按上述操作, 依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次,换用1支1m L无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕, 全过程不得超过1 5m i n。7.2 初发酵试验每个样品, 选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液( 液体样品可以选择原液) , 每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨(L S T) 肉汤, 每管接种1m L( 如接种量超过1m L, 则用双料L S T肉汤) ,3 61培养2 4h2h, 观察倒管内是否有气泡产生,2 4h2h产气者进行复发酵试验( 证实试验) , 如未产气则继续培养至4 8h2h, 产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。7.3 复发酵试验( 证实试验)用接种环从产气的L S T肉汤管中分别取培养物1环,移种于煌绿乳糖胆盐肉汤(B G L B)管中,3 61培养4 8h2h, 观察产气情况。产气者, 计为大肠菌群阳性管。7.4 大肠菌群最可能数(MP N) 的报告按7.3确证的大肠菌群B G L B阳性管数, 检索MP N表( 见附录B) , 报告每g(m L) 样品中大肠菌群的MP N值。第二法 大肠菌群平板计数法8 检验程序大肠菌群平板计数法的检验程序见图2。G B4 7 8 9.32 0 1 64 图2 大肠菌群平板计数法检验程序9 操作步骤9.1 样品的稀释按7.1进行。9.2 平板计数9.2.1 选取2个3个适宜的连续稀释度,每个稀释度接种2个无菌平皿, 每皿1m L。同时取1m L生理盐水加入无菌平皿作空白对照。9.2.2 及时将1 5m L2 0m L融化并恒温至4 6的结晶紫中性红胆盐琼脂(V R B A) 约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿, 将培养基与样液充分混匀, 待琼脂凝固后, 再加3m L4m L V R B A覆盖平板表层。翻转平板, 置于3 61培养1 8h2 4h。9.3 平板菌落数的选择选取菌落数在1 5C F U1 5 0C F U之间的平板, 分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落( 如菌落直径较典型菌落小) 。典型菌落为紫红色, 菌落周围有红色的胆盐沉淀环, 菌落直径为0.5mm或更大, 最低稀释度平板低于1 5C F U的记录具体菌落数。9.4 证实试验从V R B A平板上挑取1 0个不同类型的典型和可疑菌落, 少于1 0个菌落的挑取全部典型和可疑菌落。分别移种于B G L B肉汤管内,3 61培养2 4h4 8h, 观察产气情况。凡B G L B肉汤管产气,即可报告为大肠菌群阳性。G B4 7 8 9.32 0 1 65 9.5 大肠菌群平板计数的报告经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以9.3中计数的平板菌落数, 再乘以稀释倍数, 即为每g(m L)样品中大肠菌群数。例:1 0-4样品稀释液1m L, 在V R B A平板上有1 0 0个典型和可疑菌落, 挑取其中1 0个接种B G L B肉汤管, 证实有6个阳性管, 则该样品的大肠菌群数为:1 0 0 6/1 0 1 04/g(m L)=6.01 05C F U/g(m L) 。若所有稀释度( 包括液体样品原液) 平板均无菌落生长, 则以小于1乘以最低稀释倍数计算。G B4 7 8 9.32 0 1 66 附 录 A培养基和试剂A.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨(L S T) 肉汤A.1.1 成分胰蛋白胨或胰酪胨2 0.0g氯化钠5.0g乳糖5.0g磷酸氢二钾(K2H P O4)2.7 5g磷酸二氢钾(KH2P O4)2.7 5g月桂基硫酸钠0.1g蒸馏水10 0 0m LA.1.2 制法将上述成分溶解于蒸馏水中, 调节p H至6.80.2。分装到有玻璃小倒管的试管中, 每管1 0m L。1 2 1高压灭菌1 5m i n。A.2 煌绿乳糖胆盐(B G L B) 肉汤A.2.1 成分蛋白胨1 0.0g乳糖1 0.0g牛胆粉(o x g a l l或o x b i l e) 溶液2 0 0m L0.1%煌绿水溶液1 3.3m L蒸馏水8 0 0m LA.2.2 制法将蛋白胨、 乳糖溶于约5 0 0m L蒸馏水中, 加入牛胆粉溶液2 0 0m L( 将2 0.0g脱水牛胆粉溶于2 0 0m L蒸馏水中, 调节p H至7.07.5) , 用蒸馏水稀释到9 7 5m L, 调节p H至7.20.1, 再加入0.1%煌绿水溶液1 3.3m L, 用蒸馏水补足到10 0 0m L, 用棉花过滤后, 分装到有玻璃小倒管的试管中, 每管1 0m L。1 2 1高压灭菌1 5m i n。A.3 结晶紫中性红胆盐琼脂(V R B A)A.3.1 成分蛋白胨7.0g酵母膏3.0g乳糖1 0.0gG B4 7 8 9.32 0 1 67 氯化钠5.0g胆盐或3号胆盐1.5g中性红0.0 3g结晶紫0.0 0 2g琼脂1 5g 1 8g蒸馏水10 0 0m LA.3.2 制法将上述成分溶于蒸馏水中, 静置几分钟, 充分搅拌, 调节p H至7.40.1。煮沸2m i n, 将培养基融化并恒温至4 55 0倾注平板。使用前临时制备, 不得超过3h。A.4 磷酸盐缓冲液A.4.1 成分磷酸二氢钾(KH2P O4)3 4.0g蒸馏水5 0 0m LA.4.2 制法贮存液: 称取3 4.0g的磷酸二氢钾溶于5 0 0m L蒸馏水中, 用大约1 7 5m L的1m o l/L氢氧化钠溶液调节p H至7.20.2, 用蒸馏水稀释至10 0 0m L后贮存于冰箱。稀释液: 取贮存液1.2 5m L, 用蒸馏水稀释至10 0 0m L, 分装于适宜容器中,1 2 1高压灭菌1 5m i n。A.5 无菌生理盐水A.5.1 成分氯化钠8.5g蒸馏水10 0 0m LA.5.2 制法称取8.5g氯化钠溶于10 0 0m L蒸馏水中,1 2 1高压灭菌1 5m i n。A.6 1m o l/LN a O H溶液A.6.1 成分N a OH4 0.0g蒸馏水10 0 0m LA.6.2 制法称取4 0g氢氧化钠溶于10 0 0m L无菌蒸馏水中。G B4 7 8 9.32 0 1 68 A.7 1m o l/LH C l溶液A.7.1 成分HC l9 0m L蒸馏水10 0 0m LA.7.2 制法移取浓盐酸9 0m L, 用无菌蒸馏水稀释至10 0 0m L。G B4 7 8 9.32 0 1 69 附 录 B大肠菌群最可能数(MP N) 检索表B.1 大肠菌群最可能数(MP N) 检索表每g(m L) 检样中大肠菌群最可能数(MP N) 的检索见表B.1。表B.1 大肠菌群最可能数(MP N) 检索表阳性管数0.1 00.0 10.0 0 1MP N9 5