DON毒素的提取、纯化1.doc

精品论文推荐don 毒素的提取、纯化1尹珺，张爱华，何成华，张海彬* 南京农业大学动物医学院，江苏南京（210095） e-mail：摘要：为了获得大量的、高纯度的脱氧雪腐镰刀菌烯醇（don），选择来源于赤霉病小 麦的禾谷镰刀菌进行培养，结果发现，禾谷镰刀菌在约含 25水的小麦培养基中 25振荡 培养，don 产量与培养天数呈近似抛物线关系，培养 10 天后，don 产量直线上升，30 天达最高值，此后便迅速下降。收集培养基，经过在乙腈水（84:16）溶液中振荡、过滤、石油醚脱脂、乙酸乙酯萃取、蒸发，并通过以无水硫酸钠加上弗罗里硅土为填料的层析柱提 取纯化得到了高纯度的 don 毒素，为该真菌毒素的深入研究提供了基础。 关键词：禾谷镰刀菌；培养 don；提取；纯化脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，缩写 don)又称呕吐毒素(vomitoxin)，属单端孢霉 烯族 b 族化合物。联合国粮农组织和世界卫生组织 1973 年联合召开的第三次食品添加剂和 污染物会议上，单端孢霉烯族毒素被定为最危险的自然发生食品污染物，列入国际研究的优 先地位。而其中 don 污染粮食最为普遍，严重危害人畜的安全，越来越受到国内外的重视 1-3。don 毒素与其他单端孢霉烯族毒素一样，属天然产物，极难通过人工合成途径获得。 don 的主要产生菌是禾谷镰刀菌(fusarium graminearum)，据报道还有其它一些镰刀菌也可产生 don，如粉红镰刀菌（f.roseum）、黄色镰刀菌(f.culmorum )、雪腐镰刀菌(f. nivale )、 燕麦镰刀菌(f. avenaceum)和串珠镰刀菌 (f. moniliforme等。而禾谷镰刀菌(f.graminearum) 是小麦赤霉病与玉米穗腐病的重要病原菌，大多在低温、潮湿和收割季节，在谷物庄稼中慢 慢生长1。don 一般在大麦、小麦、玉米、燕麦中含有较高的浓度，在黑麦、高梁、大米 中的浓度较低4。从赤霉病麦上分离出来的禾谷镰刀菌，固体培养基常用马铃薯葡萄糖琼脂(pda)培 养基或马铃薯蔗糖琼脂(psa)培养基，液体培养基常用察氏液体培养基，产毒培养基常 用天然小麦或玉米培养基5。本文将从赤霉病麦上分离出来的禾谷镰刀菌，接种到 pda 固 体培养基或察氏液体培养基，进行菌丝生长观察，并将孢子接种到产毒培养基天然小麦 培养基，在不同时间检测 don 产量，以期获得最佳产毒条件。利用毒素探讨小麦对赤霉病的抗性机制，筛选抗病突变体，研究 don 对人、畜的危害， 开发新的快速检测技术等已取得了进展6-9。因此，毒素的大量制备与提取已成为上述研究 工作的先决条件。本试验通过对禾谷镰刀菌小麦培养基中 don 毒素的提取法进行研究，建 立了一套简便、经济、高效的 don 毒素提取方法，为 don 的深入研究和应用提供基础。1. 材料与方法1.1 实验菌株禾谷镰刀菌，由南京农业大学陈利锋教授提供。1.2 试剂与溶液配制1.2.1 试剂三氯甲烷、石油醚(6090c)、甲醇、乙腈、乙酸乙酯、无水硫酸钠等均为分1本课题得到国家自然科学基金项目（30471277）、教育部博士点基金项目（20040307043）和江苏省科技 公关项目（be2004317）的资助。- 6 -析纯；弗罗里硅土（硅镁吸附剂，100200 目）经 120c 活化 2h 备用。1.2.2 溶液配制察氏液体培养基： nano3 3.0g，kh2po4 1.0g，kcl 0.5g， mgso47h2o0.5g，feso4 0.01g，蔗糖 30.0g，蒸馏水 1000ml，ph 调至 6.0。接种时加适量硫酸链霉素，10g 蛋白胨，以促进产毒。马铃薯葡萄糖琼脂培养基（pda）：马铃薯 200g，葡萄糖 20g，琼脂 20g，蒸馏水 1000ml。 马铃薯去皮后包上纱布煮开，调整 ph 至 8.0，115c 灭菌 20min。小麦培养基：将小麦晾干，粉碎至末状。称取 50g 粉碎样品置于具棉塞的 250ml 锥形 瓶中，高压灭菌。加入 1214ml 灭菌蒸馏水，充分搅拌均匀。1.3 禾谷镰刀菌的培养1.3.1 接种禾谷镰刀菌于察氏液体培养基或 pda 平板，25c 培养数天，观察禾谷镰刀菌的生 长情况。1.3.2 吹打禾谷镰刀菌察氏液体培养基，使孢子混匀，接种 2ml 于 50g 小麦培养基，25c 霉 菌培养箱中培养，经常摇匀培养基。于培养的第 10d、20d、30d、40d、50d，随机取 5 个培 养瓶置 80c 下杀菌 1h，烘干粉碎后进行 don 的提取和 hplc 定量分析。1.4 don 的提取取样品 50g，加 100ml 乙腈水（84:16）振荡 30min（重复 12 次），过滤到分液 漏斗，加约两倍体积石油醚脱脂，弃上层石油醚，收集下层乙腈水层，90c 水浴挥干， 少量乙酸乙酯溶解，离心，取上清夜过柱（乙酸乙酯甲醇（95:5）洗柱），90c 水浴减 压挥干，1.5ml 乙酸乙酯溶解残渣，离心，并转入定容瓶中，吹 n2 挥干，乙腈（氯仿）定 容至 0.5ml。同时，用乙酸乙酯水，甲醇水代替乙腈水（84:16）进行提取，用无水 硫酸钠+弗罗里硅土作为填料过柱纯化后 hplc 定量分析，比较三种提取液的效果。1.5 don 的纯化1.5.1 层析柱制备：在层析柱底部加入适量玻璃棉或脱脂棉，加入 10m1 乙酸乙酯甲醇溶 液。用无水氧化铝+活性炭或无水硫酸钠+弗罗里硅土按下列顺序湿法装柱:无水硫酸钠或 无水氧化铝 1.5g弗罗里硅土或活性炭 8g无水硫酸钠或无水氧化铝 2g脱脂棉少量。1.5.2 过柱、洗脱：当柱内溶剂液面降至上层脱脂棉与无水硫酸钠界面时，用移液管将澄清 的提取液移入柱内，用少量乙酸乙酯甲醇溶液淋洗刻度试管移入柱内。当液面再次降至脱 脂棉与无水硫酸钠界面时，分次加入 150ml 乙酸乙酯甲醇溶液，洗脱速度控制在0.5ml/min 左右，接收洗脱液至圆底烧瓶中。于旋转蒸发器上减压浓缩至干，得到 800l don层析纯浓缩液，hplc 定量分析。2. 结果2.1 pda 平板培养结果由图 1-a，b 可见，禾谷镰刀菌在 pda 平板上 37 c 培养 3 天，气生菌丝生长旺盛， 呈白色，菌落基质呈白色，部分基质呈红色。禾谷镰刀菌培养 8 天，气生菌丝生长旺盛，长 满平板，菌落基质呈红色，部分基质呈深红色（图 1-c，d）。abcd图 1 禾谷镰刀菌在 pda 平板上培养 3 天(a,b)和 8 天(c,d)的菌落a，c：正面；b，d：反面fig. 1 bacterial colony of fusarium graminearum on pda plate after three (a,b) or eight (c,d) days cultivationa，c：the obverse side；b，d：the reverse side2.2 察氏液体培养基培养结果禾谷镰刀菌属于需氧菌，在察氏液体培养基中在 25 c 恒温气浴振荡条件下，由于能吸 收到大量的氧气，该菌生长更加旺盛，在液面以下菌丝生长旺盛。图 2 禾谷镰刀菌在察氏液体培养基中培养 7 天的菌落fig. 2 bacterial colony of fusarium graminearum in czapek liquid medium after seven-days cultiviation2.3 产毒量与时间的关系从图 3 可以看出，don 产量并非随培养天数的增加而提高，而是呈近似抛物线型关系。 在 30 天左右产毒量最高，30 天以后，don 产量迅速下降。毒素含量（g/g）60040020000102030405060 时间（天）time (d)图 3 禾谷镰刀菌产毒量与培养时间的关系fig. 3 the relationship between the output of don and cultivation time of fusarium graminearum2.4 don 的提取通过试验比较三种萃取溶液，发现用乙腈水（84:16）分步提取法获得的粗毒素 don的提取效率高，是一种较为简便、经济、高效的禾谷镰刀菌粗毒素提取法（表 1）。表 1 用三种提取液粗提 don 方法的比较table.1 comparison of the efficiency with three extraction solution for extracting don提取液提取溶液描述过柱后 don 的提取量氯仿无水乙醇（75:15） 甲醇水（20:80） 乙腈水（84:16）溶液浑浊,难过滤 溶液浑浊,难过滤 溶液澄清,透明,易过滤28.6mg/kg30.4 mg/kg42.1mg/kg2.5 don 的纯化比较 don 的国家检测标准毒素提纯用的层析柱填料无水氧化铝+活性炭和其他毒 素提取常用的无水硫酸钠+弗罗里硅土层析柱填料，活性炭填料吸附柱虽然使样品的杂质减 少了，但回收率有下降趋势，且过柱时间很长。弗罗里硅土填料吸附柱不仅使杂质显著减少， 而且回收率较高，过柱时间较短。故采用弗罗里硅土吸附柱净化效果较好（表 2）。表 2 don 两种层析柱提取方法的比较table.2 comparison of the efficiency with two columns for extracting don方法纯化效率过柱时间过柱后 don 的提取量无水氧化铝+活性炭无水硫酸钠+弗罗里硅土溶液杂质较多溶液较澄清24 小时约 8 小时32.9mg/kg40.5 mg/kg3. 讨论3.1 禾谷镰刀菌的培养及产毒相关条件本试验发现，用棉塞代替橡胶塞，使得禾谷镰刀菌处于有氧、半开放的环境中，大大促 进了其生长。小麦培养基加约25水利于禾谷镰刀菌生长。禾谷镰刀菌适宜在潮湿的环境中 生长，而当超过这个比例后，不利于镰刀菌生长,可能是影响了氧气的吸收。陆鸣等报道， don产量是呈近似抛物线型关系。是由于don的转化还是降解，其机理尚待进一步探讨10。 本人通过反复实验，证实了don的产量随培养天数呈抛物线型关系的观点。3.2 don 的提取和纯化don 易溶于水和极性溶剂甲醇、乙醇、乙腈、丙酮和乙酸乙酯，但不溶于正己烷和乙 醚。而且 don 对热较稳定，一般的烹调及加热不能破坏其毒性。正是利用它的这些特性， 使 don 得以从烘干粉碎的霉变小麦中萃取出来11。don 的纯化除了本试验所用的两种层 析柱填料以外，免疫亲合柱所具有的灵敏度高、选择性好、耗时少、使用方便和节省溶剂等 优点，正成为真菌毒素分析的一种重要的前处理手段，得到越来越广泛的应用。免疫亲和柱 的主要缺点是价格较高，目前还只有几种真菌毒素有商用免疫亲合柱，有的样品上柱前还需 先净化，有时还存在回收率较低的问题。免疫亲合柱适用于自然条件下生长的谷物中的毒素 检测，目的是调查赤霉病的污染情况12。而本试验目的是得到大量高纯度的 don 毒素，培 养基中所含的毒素远远高于自然条件下赤霉病污染的谷物，也远远超过免疫亲合柱最大吸附 毒素量，所以不适宜用免疫亲合柱。总之，本文建立了禾谷镰刀菌最佳产毒培养方法，并用乙腈水（84:16）分步提取法 获得粗毒素 don，采用弗罗里硅土吸附柱净化杂质少，回收率高，过柱时间较短。用该法 可以获得大量 don，为开展与 don 相关的研究提供原料。参考文献1 larsen jc, hunt j, perrin i, et al. workshop on trichothecenes with a focus on don: summary reportj.toxicology letters,2006, 153 (1):1-22.2 pfohl-leskowicz a. mycotoxins - food safety aspects euro-maghrebin symposiumj. mol nutr food res.2006, 50(6):467-469.3 martins ml, martin hm. determination of in wheat-based breakfast cereals marketed in portugalj. journal offood protection, 2001,64(11): 1848-1850.4 吴艳萍，靳慧霞. 植物产品中真菌毒素的危害及其检测方法j. 粮食与饲料工业，2001(7)：45. 5 张从宇，王敏，陈茂敏. 小麦赤霉病菌生物学特性研究j. 安徽农业科学，2003, 3l (5): 753-754.6 chen p, liu w, yuan j. development and characterization of wheat-leymus racemosus translocation lines with resistance to fusarium head blightj. theor appl genet 2005 ,111(5):941-948.7 swamy hv, smith tk, macdonald ej. et al. effects of feeding a blend of grains naturally contaminated with fusarium mycotoxins on swine performance, brain regional neurochemistry, and serum chemistry and the efficacy of a polymeric glucomannan mycotoxin adsorbentj. j anim sci. 2002, 80(12):3257-3267.8 le drean g, auffret m, batina p, et al myelotoxicity of trichothecenes and apoptosis: an in vitro study on human cord blood cd34+ hematopoietic progenitorj. tociol in vitro. 2005, 19(8): 1015-1024.9 尹珺，张洪英，张海彬，等. 脱氧血腐镰刀菌烯醇（don）理化检测方法的研究j. 畜牧兽医学报，2006,38(10):6-8.10 陆鸣，王裕中，陈怀谷，等. 禾谷镰刀菌产毒素培养条件及粗毒素提取法j. 江苏农业学报，1992, 8(1):30-40.11 krska r, baumgartner s, josephs r. the state-of-the art in the analysis of type-a and trichothecend mycotoxins in cerealsj. fresenius j anal chem. 2001, 371: 285-299.12 杨欣, 刘秀梅. 免疫亲合柱在真菌毒素检测中的应用 国外医学卫生学分册j. 2001,28(2): 117-120.isolation and purification of deoxynivalenolyin jun, zhang aihua, he chenghua, zhang haibincollege of animal medicine, nanjing agriculture university, jiangsu nanjing (210095)abstractfusarium graminearum was cultured in order to obtain a plenty of don