PDTC对LPS诱导急性肺损伤大鼠肺组织ICAM-1mRNA表 的调节作用1.doc

精品论文 pdtc对lps诱导急性肺损伤大鼠肺组织icam-1mrna表 的调节作用1王大龙冷玉芳兰州大学第一医院麻醉科，兰州（730000）摘要：目的：探讨二硫代氨基吡咯烷 (pyrrolidine dithiocarbamate，pdtc)对内毒素（lps）诱导急性肺损伤大鼠肺组织细胞间黏附分子-1（icam-1）mrna 表达的影响及其可能 的保护机制。方法：72 只 wista 大鼠随机分为三组：对照组（c 组 ），lps 组(l 组)，pdtc+lps 组(p 组)。其中根据腹腔注射内毒素到取肺组织的时间分为 1、3、6、12h 亚组，每组六只。 观察大鼠肺组织病理变化，肺组织湿/干重(w/d)比变化，同时使用 rt-pcr 法检测大鼠肺组 织 icam-1mrna 表达。结果：与 c 组比，l 组大鼠腹腔注射内毒素后，肺组织 icam-1mrna 表 达明显增强（p0.05），病理学显示肺组织结构破坏严重，肺组织湿 /干重比（w/d）明显 增大（p0.05）。与 l 组比，p 组应用 pdtc 后 icam-1mrna 表达明显减少（p0.05）,肺组 织结构的破坏有明显减轻，肺组织湿/干重比（w/d）明显减小（p0.05）。结论：应用 pdtc 能明显抑制 icam-1mrna 表达，对 lps 诱导急性肺损伤有一定保护作用。提示 pdtc 的肺保 护作用机制可能与抑制 icam-1 的转录，进而抑制炎症反应有关。关键词：pdtc；核因子-b；icam-1；内毒素；肺损伤中图分类号：r655.31. 引 言：急性肺损伤（ali）/急性呼吸窘迫综合征 (ards)是由严重感染、创伤和体克等多种病 因所致的弥漫性肺实质损伤，其在分子水平上表现为众多促炎性细胞因子、粘附分子的过 度表达，伴有多种炎症介质的产生。炎症形成级联反应，导致肺组织广泛损害，并累及诸 多肺外器官，其中，核因子 -b（nf-b）在调控炎症介质的基因表达上起着关键作用。 多种炎症介质基因的启动子和增强子中含有b 位点，如细胞间黏附因子-1（icam-1）、白 细胞介素-1（il-1）、白细胞介素-6（il-6）、肿瘤坏死因子-（tnf-）等。活化的 nf- b 可调控上述介质基因的表达 1,2。研究证明，抗氧化剂二硫代氨基吡咯烷(pyrrolidine dithiocarbamate，pdtc)能够通过抑制重要的核转录因子-b(nuclearfactor-kappab，nf- b)活化，减少致炎细胞因子表达与合成释放3.4 ，因此本实验建立大鼠内毒素性肺损伤模 型，研究 pdtc 对 lps 诱导急性肺损伤大鼠肺组织 icam-1mrna 影响，以探讨 pdtc 肺损伤的 保护作用及其机制。1 本课题得到甘肃省基础研究计划资助（0710rjza038 ）- 7 -精品论文2. 材料与方法2.1材料实验动物及主要试剂： wista 大鼠（由兰州大学医学院实验动物中心提供） 72 只，雌 雄各半，200250g，lps（ecoli055:b5）购自 sigma 公司，pdtc 购自 sigma 公司，核酸提 取试剂购自百泰克，rna 试剂盒购自 fermentas 公司。72 只 wista 大鼠随机分为三组：对照组（ c 组），lps 组(l 组)，pdtc+lps 组(p 组)。 其中根据腹腔注射内毒素到取肺组织的时间分为 1、3、6、12h 亚组，每组六只。l 组和 p 组采用腹腔注射 lps8mg/kg（5mg/ml）制作内毒素性肺损伤模型，c 组注射同体积的生理盐 水。p 组在腹腔注射内毒素前 30min，尾静脉注射 pdtc120mg/kg（60mg/ml），l 组和 c 组 给予同体积的生理盐水。按分组规定的时间点，10水合氯醛 350mg/kg 腹腔注射麻醉，开 胸心脏放血处死，采集标本。2.2方法221rt-pcr 检测用 pcr 专用器械迅速取右肺下叶，经预冷的 depc 水冲洗表面的血液后立即置于液氮中 速冻，-80冰箱保存，待用于 rt-pcr。用 rna 提取试剂 trizol 提取肺组织总 rna，反转 录合成 cdna 第一条链。取反转录产物 2l 进行 pcr 反应（94变性 5min，59复性 30s，72延伸 1min，35 个循环）。扩增组织中 icam-1 的引物为:5-aggtatccatccatcccaca-3和 5-agtgtctcattcccacggag-3，片段长度为 388bp；扩增内对照-actin 的引物为: -actin 引物 5-gtgggccgctgtaggcaccaa-3和 5-ctctttgatgtcgcacgatttc-3，片 段长度为 540bp。由上海赛百盛有限公司合成。pcr 扩增产物用 1%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙 锭染色显示，凝胶图像分析系统分析，以 icam-1mrna/-actinmrna 电泳带的荧光强度比 值作为 icam-1mrna 的表达量指标。222肺组织病理检查取左肺下叶，4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋，he 染色后光镜下观察肺组织形态学变化。223 肺组织湿/干重比值（w/d）取左肺下叶，滤纸拭去表面血液，称湿重后（w）置于 80烤箱烘烤 48 小时使肺组织 达恒重后称干重（d），计算 w/d 比值，224 统计学处理采用 spss11.0 软件进行统计学分析，计量资料以均数标准差（ x s）表示。统计 分析采用单因素方差分析（anova），p0.05 为差异有统计学意义。3. 结果31rt-pcr 检测 icam-1mrna 表达结果c组大鼠肺组中icam-mrna只有少量表达；l组icam-1mrna表达量从注射内毒素后1h就开 始显著增加，与c组有差异（p0.05），直到12h达到高峰；在p组，icam-mrna随时间的变化规律与l组相同，但是应用pdtc后能明显的抑制内毒素引起的icam-1mrna的表达。与l组相比，p组在1、3、6、12h四个时间点icam-1mrna的表达量都显著的降低（p0.05）。见表1、 图1。表 1 各组肺组织中 icam-mrna 的表达水平比较（n=6， x s）组别1h3h6h12hc组l组p组0.400.0180.720.028*0.520.023*0.410.0260.920.023*0.650.037*0.390.0191.020.054*0.730.032*0.410.0201.120.039*0.810.020*与 c 组相比，*p0.05；同一时间点与 l 组相比，p0.05图 1 各组肺组织中 icam-mrna 的表达水平1，2为c组；3，4，5，6分别为lps1h、3h、6h、12h组；7，8，9，10分别为pdtc+lps1h、3h、6h、12h组。32肺组织光镜病理学结果c组在光镜可见肺泡结构完整，肺泡壁无水肿，无炎症细胞浸润；l组可见片状出血， 光镜下可见基本上看不到完整的肺泡结构，肺间质有严重的水肿、淤血，大量的炎症细胞 浸润；p组，肺泡结构受到轻微破坏，能看到代偿增大的肺泡，无明显的水肿、淤血，仅有 少量的炎症细胞浸润。见图2。图.2 各组腹腔注射内毒素 6 小时后病理（he200）33 肺组织湿/干重比值（w/d）与c组相比，p组和l组w/d比值在相同时间点均明显升高（p0.05），与l组相比p组， w/d比值在相同时间点均明显降低（p0.05）。有统计学意义。表1 各组肺组织中w/d比值（ x s，n=6）组别1h3h6h12hc组l组p组4.270.164.610.08*4.360.10*4.260.114.830.12*4.560.24*20.14*4.830.16*4.260.235.750.27*5.240.38*与 c 组相比，*p0.05；同一时间点与 l 组相比，p0.054. 讨论在ali时，影响肺血管内皮细胞的有害物质可破坏内皮细胞的完整性，诱导其血液动力 学和血液流变学的改变，促进肺内皮细胞与循环血细胞的相互作用，导致血管通透性增加， 肺水肿形成。因此，肺血管内皮细胞损伤的评估较为重要，而其释放的粘附分子是损伤活 化的标志物，肺组织w/d的变化可以很好的反映肺泡血管的通透性及肺间质的改变程度。lps 主要与巨噬细胞表面的toll受体结合，启动胞内信号传递链，促进 ib亚型的降解并活 化nf-b的dna结合能力，启动基因转录，表达和释放多种细胞因子，发挥其毒性作用5,6,7。 本研究中，l组注射lps后，大鼠呼吸加快，肺组织的 icam-mrna表达增强，w/d增加，并且 光镜观察到明显的肺损伤的形态学变化，证明了成功的建立了ali模型。icam-1 是一类大分子糖蛋白，属于免疫球蛋白基因超家族，可以表达于多种类型的细 胞，它通过介导细胞与细胞间，细胞与细胞外基质间的粘附作用，参与一系列生理及病理 过程8。目前的研究认为大量的多形核白细胞（pmn）黏附于肺血管内皮细胞、在肺内扣押 并释放生物活性介质是 ali 发生的主要机制之一；通过有效的减少或清除肺内的 pmn 而控 制炎症反应，可以减轻 ali9。icam-1 在肺组织中的表达增强 ,一方面通过与其配体即表达 于 pmn 表面的 cd11/cd18 相结合有助于 pmn 与血管内皮细胞相黏附 ,促使 pmn 移行于血 管外;另一方面 pmn 与靶细胞黏附结合后 ,形成了 pmn 与靶细胞之间的一个较紧密且相对稳 定的微环境 ,此微环境有利于 pmn 释放的毒性介质在局部保持较高浓度 ,从而对靶细胞发 挥有效的毒性作用，进而导致肺实质细胞损伤及持续细胞因子释放 10。本研究中，与 c 组 比较，l 组的 icam-1mrna 表达增加，光镜下可见肺泡结构基本消失，肺间质淤血水肿，肺 组织间隙有大量的 pmn 聚集扣押，表明在 lps 的刺激下，大量激活的 pmn 向肺组织转移， 聚集在肺组织并激活，继而产生肺损伤。同时 icam-1mrna 表达随时间变化增强，炎症反应 加重。icam 的表达受到多条信号传导通路的调控。目前研究认为 icam-1 的表达可能与 nf- b 的活化有关。nf-b 是一种细胞内普遍存在的转录因子，具有和某些基因启动子区固定 核苷酸序列结合而启动基因转录的功能；正常情况下，与其抑制物 ib 结合，存在于静止期细胞的胞浆中。已证实，icam-1 基因启动子上含有 nf-b 结合位点，各种细胞外的刺激信号使胞浆中未活化的 nf-b 激活进入胞核，促进其细胞粘附分子的表达；细胞粘附分子又可反过来进一步活化 nf-b，由此形成一个反馈调节，使炎症不断放大。nf-b 诱导 icam-1 表达和增强 pmn 粘附的作用已通过很多试验证实11、12。研究证明，pdtc 是一种抗氧化剂， 也是 nf-b 的特异性抑制剂，可在 nf-b 活化通道的不同水平发挥抑制作用，如抑制 nf- bp65 亚单位，抑制ib（nf-b 抑制剂）的降解或减少 nf-b 的核移位，从而减少致炎 细胞因子表达与合成释放3.4。本研究中，与 c 组相比，p 组 icam-1mrna 表达仍有增加，病 理学显示肺泡结构受到轻微破坏，能看到代偿增大的肺泡，无明显的水肿、淤血，仅有少 量的炎症细胞浸润，w/d 比值也较大，可能与 pdtc 只干预了部分 ali 的发病机制有关。与l 组相比，icam-1mrna 表达减轻，病理学损伤减少，w/d 减小。表明 pdtc 通过减少 icam-1mrna 表达，进而减轻 pmn 在肺组织内的聚集和激活，抑制肺损伤时的炎症反应。综上所述，pdtc 预先给药对 lps 诱导的大鼠 ali 有一定的保护作用，可能与减少肺组 织的 icam-1mrna 表达，进而抑制 pmn 的聚集和激活有关。参考文献1. wilkins paseahorn t. acute respiratory distress syndrome. vet 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group, l group and p group were divided 1h,3h , 6h,12 h subgroups(n=6) in accordance with the time between intraperitoneal injection of endotoxin to take the lung tis sue. observation of pathological changes in lung tis sue, lung wet / dry we