PKC-MARCKS信号转导系统在急性多发脑梗死大【精品论文大全】.doc

精品论文推荐pkc-marcks 信号转导系统在急性多发脑梗死大鼠海马中的作用1张允岭 1，张綦慧 1，白文 2，张锦 1，韩振蕴 1，娄金丽 1，郑宏 1，闫妍 11. 北京中医药大学东方医院，北京 （100078）2. 北京大学人民医院，北京 （100044）e-mail:摘要：目的，研究急性多发脑梗死大鼠海马 marcks 磷酸化动态变化与急性缺血损害的关系。方法采用改良 kaneko 法建立急性多发脑梗死动物模型，观察模型 1h、6h、24h、72h、7d 组大鼠海马病理组织学改变，应用免疫组织化学和 western blotting 方法检测缺血各 时间点大鼠海马 marcks 磷酸化表达变化。结果，海马组织病理学以缺血 24h 后病理改变为著。急性缺血海马 marcks、p-marcks 均为过高表达，24h 表达最高，过表达最显著，24h 后表达降低，7d 表达略回升，形成动态变化。结论，急性多发脑梗死大鼠海马 24h 后缺 血损害明显，24h 海马 marcks 磷酸化过表达最显著，在急性脑缺血状态下大鼠海马 marcks 磷酸化过高表达，与缺血损害关系密切。 关键词：急性多发脑梗死；大鼠海马；marcks；磷酸化中图分类号：细胞内存在着多种信号转导方式和途径，明确细胞信号转导的过程对于认识细胞在整个 生命过程中的增殖、分化、代谢及死亡等诸方面的表现和调控方式，进而在分子水平认识各 种疾病的发病机制具有重大的意义1。底物蛋白磷酸化是各信使系统作用的最后通路，同时 又是各信使系统间进行调控的枢纽2。蛋白激酶 c（protein kinase c, pkc）作为一种重要的 蛋白激酶和细胞内信号分子，与神经细胞的多种活动有关，如轴突的生长、树突棘的形成、 基因表达、长时程增强以及神经递质的释放等3,4。marcks（myristoylated alanine-rich c kinase substrate）是 pkc 特异性底物蛋白，在 pkc 的作用下，发生磷酸化反应，参与跨膜 信息传递与脑组织的发育，参与细胞的转移、粘附、分泌，以及细胞的内摄、外放和吞噬作 用5-7。既往研究发现，在急性多发脑梗死状态下大鼠海马 marcks 和 p-marcks 表达异常 升高，与缺血损害关系密切8。在脑缺血损害导致细胞变性死亡、功能丧失过程中，是否存 在着 marcks 磷酸化表达的动态变化，这种变化是否与神经细胞变性坏死相关，至今尚未 有明确报道。本研究通过对于急性缺血不同时间点大鼠海马 marcks 磷酸化表达动态变化 与海马缺血损害的关系的研究，以探讨急性缺血海马 marcks 磷酸化表达的动态变化与急 性缺血损害的关系。1材料与方法1.1实验动物及分组健康雄性 wistar 大鼠 119 只，体重 34025 克，购自北京维通利华实验动物技术有限公1本课题得到 2004 年度高等学校博士学科点专项科研基金资助课题、2005 年教育部科学技术重点项目的资 助。- 8 -司，许可证编号：scwk（京）2002-2003。按数字表法随机分为 7 组，正常组、假手术组、模型 1h、6h、24h、72h、7d 组，每组 17 只大鼠。1.2模型制备采用同种系体外微栓子注入法（改良 kaneko 法10），于大鼠右侧颈外动脉注入同种系大 鼠血栓栓子溶液 0.3ml。假手术组手术方法相同，但注射为等量的生理盐水。根据 bederson 评分标准对造模后大鼠进行神经系统症状观察11，并记录评分，分 0 分、1 分、2 分、3 分、4 分、5 分共 6 个分值。1.3材料与仪器羊抗 marcks 多克隆抗体、羊抗 p-marcks 多克隆抗体、donkey a cro igg/hrp、ecl 购自 santa cruz biotechnology；leupeptin、pepstatin a、np-40、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰 胺、aps、sds、甘氨酸、tween-20、tris 碱、temed、溴酚蓝、甘油、硼酸均为 sigma 产品；dtt 为 mcrck 产品；pmsf 为 serva 产品；nc 膜购自 millipore 公司；3mm 滤纸为 walkerman 产品；脱脂奶粉为 fluka 产品；甲醇为 riedel-de 产品；蛋白定量试剂盒、预染蛋 白 marker（116、94、47、37、27.5、19.3 kda）购自北京赛百盛基因技术有限公司；免疫 组织化学试剂盒、pbs 由北京中杉金桥生物技术有限公司提供；异丙醇、浓盐酸、无水酒精 为分析纯，购自北京化工厂。紫外分光光度计为 amersham biosciences 3300 pro uv/vis 型、垂直电泳仪为 amersham biosciences mini ve 型、半干转移槽为 amersham biosciences hoefer te 70 型、成像、扫描 及图像分析系统为 syngene 成像及分析软件。1.4取材方法1.4.1光镜标本大鼠于 10水合氯醛麻醉后，剪开胸腔，暴露心脏，9#针头穿刺左心室并剪开右心耳， 用 37、0.9生理盐水 200ml+12500u 肝素钠灌洗，至右心耳流出液无色透明，再用 4多 聚甲醛灌洗固定，待大鼠僵硬后，再迅速断头取脑，继续置于 4多聚甲醛溶液中固定至少24h 以上。从额极至枕叶每间隔 2mm 连续冠状切片，常规梯度酒精脱水，石蜡包埋，连续 切片（4m），he 染色及 marcks、p-marcks 免疫组织化学检测。1.4.2电镜标本大鼠于 10水合氯醛麻醉后，剪开胸腔，暴露心脏，9#针头穿刺左心室并剪开右心耳， 用 37、0.9生理盐水 200ml+12500u 肝素钠灌洗，至右心耳流出液无色透明，再用 4、3戊二醛溶液灌洗固定，迅速断头取脑，于患侧海马、额叶皮层部位取 1cm3 组织块，继续 置于 3戊二醛中后固定 2h，分别用 1四氧化锇作用 2h，梯度酒精脱水，环氧丙烷置换， epon812 环氧树脂包埋，lkb-v 型超薄切片机切片，厚度 5060nm，电子染色，用透射电子显微镜观察细胞形态及超微结构。1.4.3组织总蛋白的提取大鼠断头、取脑（整个过程应在 5 分钟之内完成），取患侧海马组织置入匀浆 buffer 中（1g:10ml），4条件下研磨匀浆，并加入蛋白酶抑制剂 pmsf（10mm）10l。将匀浆液 于 4条件下静置 30 分钟，其间振荡 3 次，每次 10 秒钟。之后在 4条件下 13,000 rpm 将 匀浆液离心 20 分钟。取上清液，即得组织总蛋白溶解液，应用蛋白测定试剂盒对溶解液中 蛋白含量进行测定，分装后在-80条件下保存。1.5实验方法1.5.1marcks、p-marcks 免疫组织化学方法石蜡切片，常规脱蜡至水。3h2o2 去离子水孵育 5 分钟。蒸馏水冲洗，pbs 浸泡 5 分 钟。滴加 3h2o2 去离子水孵育 5 分钟，倾去，勿洗。滴加 1：200 marcks 或 p-marcks，37 2 小时。pbs 冲洗，3min3 次。生物素标记兔抗山羊 igg 二抗工作液，室温 10 分钟。 pbs 冲洗，3min3 次。滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温 10 分钟。pbs 冲洗，3min3 次。dab 显色，自来水充分冲洗。复染，脱水，透明。中性树脂封片。1.5.2sds-page 电泳及 western blotting配制凝胶溶液（5积层胶；8分离胶）。蛋白样品与 3样品缓冲液以 2:1 混合，98 煮沸 5 分钟，按 7g / 孔上样。以 20ma 恒流电泳 4h。根据凝胶面积按 0.65 ma/cm2 稳流电 转移 2h。按 0.1ml/cm2 加入 5blotto 预杂交液，封闭 4过夜。一抗 marcks、p-marcks 的浓度分别为 1：1000 及 1：500。冰上摇 2h。tbs-t 洗 3 次，每次 15min。辣根过氧化物 酶标记的驴抗羊 igg 抗体反应液，浓度为 1：2000 及 1：1000，室温下摇床杂交 1h。显影： 按 0.125 ml/cm2 膜面积取 ecl a 液与 b 液等量混合，将 nc 膜浸入显色液中，反复振荡，30 秒钟后取出，置于 gene gnome system bio imaging 仪器的小暗盒中，调整曝光 时间，应用 genesnap 软件拍照，并保存图像。用 genetools 分析软件测定条带的光密度值， 以光密度值代表 marcks 蛋白的相对表达量。1.6统计学处理结果以均数标准差（s）表示，以 spss 11.5 统计软件进行单因素方差分析。2结果2.1急性多发脑梗死大鼠外观造模大鼠共 85 只，存活 75 只，存活率 88.24，造模后 24h，各组大鼠有不同程度的 神经功能缺损表现。正常组、假手术组大鼠可以站立，步态灵活，用手提起大鼠尾部，大鼠 四肢对称伸出；模型组大鼠症状轻重程度不等，轻者出现动作缓慢或运动减少，易激惹，重者出现转圈或不能站立、或有追尾运动、身体向一侧倾倒，完全偏瘫，或抽搐、大小便失禁等，用手提起大鼠尾部，大鼠患侧前肢屈曲，后肢伸直，四肢伸出不对称。2.2急性多发脑梗死大鼠神经功能缺损积分将模型 24h、72h、7d 组，在造模后 24h 的同一时间点检测神经功能缺损评分，三组评 分分别为 2.18、2.12、2.41（平均为 2.24），表明造模后 24h，大鼠出现明显神经功能缺损。2.3光镜下各组大鼠海马组织病理改变正常组：神经细胞多层排列，且紧密、整齐，核膜清晰，核仁明显。假手术组：神经细 胞的数目及排列与正常组无明显差异。缺血 1h：神经细胞结构接近正常，未见明显病变。 缺血 6h：神经细胞数目排列稀疏，不整齐，细胞有减少、脱失。缺血 24h：脑组织出现坏死， 间质水肿，神经细胞排列不整齐，有脱失，高度肿胀，细胞浆透亮，核固缩。缺血 72h：神 经细胞排列稀疏，不整齐，数目明显减少，脱失现象严重，形状不规则，核固缩。缺血 7d： 神经细胞排列稀疏，数目明显减少，细胞体积缩小，核固缩。图 1 正常组：海马区齿状核、海马 ca4 区神经细胞丰富，排列整齐，未见病变。（he100）图 2 模型组：24h 海马区神经细胞有脱失，残存细胞内水肿，核固缩，贴近海马周围见筛状软化灶。（he100） 图 3 正常组 marcks 表达：海马 ca1 区神经细胞胞浆内可见少量棕黄色颗粒（sp200）图 4 模型组 marcks 表达：缺血 24h 海马 ca4 区神经细胞胞浆内可见少量棕黄色颗粒 （sp200）图 5 模型组 p-marcks 表达：缺血 6h 海马 ca1 区神经细胞胞浆内可见少量棕黄色颗粒（sp200）图 6 模型组 p-marcks 表达：缺血 24h 海马 ca1 区神经细胞胞浆内可见少量棕黄色颗粒 （sp200） 图 7 模型组电镜： 缺血 6h 间质液化，神经细胞空泡变性，内质网扩张。（2，000）图 8 模型组电镜：缺血 24h 神经细胞脱髓鞘。（14，000）2.4蛋白质浓度测定：使用 excel 软件，以标准蛋白 bsa 的浓度为横坐标，od595nm 为纵坐标作图，并计 算出方程式：y = 37.80765x + 4.104243。根据方程式计算待测蛋白样品的浓度。图 9蛋白标准曲线standard curve0.9absorbance ( 595nm )0.20.10-0.1 010203040-0.2bsa protein amount ( g )2.5marcks、p-marcks 在急性多发脑梗死大鼠海马的动态表达结果见表 1、表 2、图 10、图 11。n=6, 表 1 marcks 在急性多发脑梗死大鼠海马的表达（s）组别marcks 光密度值 正常组207089.021625.7假 手术 组167413.817957.3模型 1h 组 275087.717481.2 模型 6h 组 255318.432809.7 模型 24h 组353348.635402.4* 模型 72h 组244091.024435.5 模型 7d 组 298856.839963.4注：模型 24h 组与其它各组相比 * p0.017d 组假手术组正常组模型 1h 组模型 6h 组模型 24h 组模型 72h 组模型图 8 marcks 在急性多发脑梗死大鼠海马的表达n=6, 表 2 p-marcks 在急性多发脑梗死大鼠海马的表达（s）组别p-marcks 光密度值 正 常 组262376.124552.3假手术组256595.633892.1 模型 1h 组281399.233314.8 模型 6h 组290171.1 7595.8 模型 24h 组347615.125475.9* 模型 72h 组275243.525226.9 模型 7d 组314140.324898.8注：模型 24h 组与其它各组相比 * p0.05假手术组正常组模型 1h 组模型 6h 组 模型 24h 组 模型 72h 组 模型 7d 组图 9 p-marcks 在急性多发脑梗死海马的表达3讨论现代研究认为，脑缺血缺氧性损害可破坏神经元之间，皮质和皮质下中枢之间的信号传递，引起脑的损害。在神经系统，蛋白激酶的活化，是细胞外信号调节靶细胞蛋白质磷酸化的最主要机制，神经递质作用的启动都是通过蛋白激酶激活底物蛋白而实现。细胞信息传递 的过程是以一系列蛋白质的构象和功能改变为基础的级联反应。蛋白质是一切生命活动的物 质基础，几乎在所有的生命过程中起着关键的作用。蛋白质的修饰如磷酸化对于蛋白质的活 化及执行功能具有非常重要的影响。蛋白质磷酸化作为真核细胞信号转导的核心，在生命系 统中发挥重要的作用。蛋白质磷酸化，被认为是各信使系统作用的最后通路，同时又是各信 使系统同时进行调控的枢纽。本实验应用免疫组织化学和 western blotting 方法检测各组大鼠海马 marcks 磷酸化表 达变化，结果显示急性缺血海马 marcks、p-marcks 均为过高表达，说明急性脑缺血损 害时 pkc marcks 信号转导系统的活性是增加的，对缺血损害的敏感性的差异与 marcks 调节功能有关，marcks 与脑缺血损害的发生发展的关系密切。在研究中缺血24h 时海马 marcks、p-marcks 过表达最多，变化最显著，与观察到海马缺血 24h 时脑 缺血缺氧损害最严重相符合，光镜下观察到海马区内有软化灶，脑组织坏死，间质水肿，神 经元排列不整齐，大片脱失，残存细胞内水肿，细胞核固缩等病变，电镜下观察到间质液化， 神经细胞空泡变性，脱髓鞘，内质网扩张。且此时神经功能缺损较重，可能提示脑缺血损害 后 24h 恰是神经细胞变性坏死的最高峰。本实验结果显示急性脑缺血可诱导海马 marcks 蛋白及磷酸化过表达状态，进而激活和过度刺激 pkcmarcks 信号转导系统，并导致 marcks 磷酸化和信号转导异常，与急性缺血后神经元坏死密切相关。细胞的信号转导是多通路、多环节、多层次和高度复杂的可控过程。细胞在对外源信号 进行识别、转换和传递时，大多具有瀑布似逐级将信号加以放大的作用。信号从一个细胞传 递到下一个细胞，直至进入靶细胞内部的机制涉及信号分子传递链的形成13。急性脑缺血 发生时，会促进这条链上某些环节过度活跃，最终活化或改变信号转导通路的下游分子 pkc 的活性，从而促进 pkc 底物 marcks 的磷酸化，并发挥其生物学功效。现代研究认为细 胞内各种不同信号通路不是彼此孤立的，而是构成一个复杂的信号网络系统，对于 pkc-marcks 信号转导系统的研究，有利于以此为基点进一步研究与急性脑缺血相关的信号转导系统网络的关系。参考文献1 冯作化主编.医学分子生物学.人民卫生出版社.2003; 1142 关新民主编.医学神经生物学纲要.科学出版社.2003:125-1263 aarham wc . tate wp . metaplasticity , a new vista across the field of synaptic plasticity prog . neurobiol .1997 ; 52 ( 4 ) :303-323.4 ranakers gm , gerendasy dd , de-graan pn . substrate phosphorylation in the protein kinase c gamma knockout mouse . j biol chem .1999 ; 274 ( 4 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