人工蛹虫草中N6-（2-羟乙基）腺苷的分离.doc

精品论文人工蛹虫草中 n6-（2-羟乙基）腺苷的分离纯化及其对小鼠 lewis 肺癌细胞的增殖抑制 作用的研究5卢丽丽1，舒特俊1，陈剑清1，吴祥甫1，张耀洲1,2（1. 浙江理工大学生命科学学院生物化学研究所,杭州 310018；2. 天津市国际生物医药联合研究院，天津 300457）摘要：n6-（2-羟乙基）腺苷是第一个生物来源的钙离子拮抗剂，具有很强的抗紫外辐射、10抗血小板凝集和镇痛等效用。关于其抗肿瘤方面的作用报道很少。本研究采用水提醇沉、制 备液相分离和结晶等简单的方法，从蛹虫草水提取物中分离出了 n6-（2-羟乙基）腺苷。并利用小鼠 lewis 肺癌细胞为模型，采用 mtt 法对其体外抗肿瘤效果做了初步研究，发现它对小鼠 lewis 肺癌细胞具有较强的抑制作用，且此种抑制作用呈时间-剂量依赖效应。此为探 索和拓展 n6-（2-羟乙基）腺苷的其他功效提供了一定的借鉴作用。15关键词：生物化学；n6-（2-羟乙基）腺苷；蛹虫草；抗肿瘤中图分类号：q58study on the isolution and purification of20n6-(2-hydroxyethyl)adenosine from cordyceps militaris and its inhitory effect on the lewis lung cancerlu lili1, shu tejun1, chen jianqing1, wu xiangfu1, zhang yaozhou1,2(1. institute of biochemistry,college of life science,zhejiang sci-tech university,hangzhou310018;252. tjab tianjin 300457)abstract:n6-(2-hydroxyethyl)adenosine is a kind of calcium antagonist of the first biological sources. it has strong resistance to uv radiation, and the effectiveness of anti-platelet aggregation and analgesic. little is reported about its role in the anti-tumor. method of water extraction and ethanol precipitation, preparative liquid chromatography and crystallization was used to isolate30and purify n6-(2-hydroxyethyl)adenosine in this study. mtt assay was used to preliminary investigated the inhibitory effect of n6-(2-hydroxyethyl)adenosine on tumor in vitro while the lewis lung cancer was used as model. result showed that n6-(2-hydroxyethyl)adenosine had a relatively strong inhibitory effect on lewis lung cancer with a time-dose depend effect. this study provided a certain reference for the exploration and expansion of the function of35n6-(2-hydroxyethyl)adenosine.key words: biochemisty; n6-(2-hydroxyethyl)adenosine; cordyceps militaris; anti-tumor.0引言蛹虫草cordyceps militaris (l.ex.fr) link，又名北冬虫夏草，蛹草，北虫草，蛹草菌等，40分类学上属于真菌门(eumycota)，子囊菌亚门(ascomycotinia)，核菌纲(pyrenomycetes)，球壳 目(sphaeriales)，麦角科(claviciptiaceae)，虫草属(cordyceps) 1。其与冬虫夏草同属异种， 是国内外公认的食药用真菌，民间用于肺炎、肾虚、腰痛等疾病的治疗2。研究表明蛹虫草基金项目：国家高技术研究发展计划“863”项目（2011aa100603） 作者简介：卢丽丽(1987-),女,研究生,生物化学与分子生物学 通信联系人：张耀洲(1964-),男,教授,家蚕生物反应器. e-mail: - 8 -具有与冬虫夏草极相似的作用，无毒副作用，可以作为冬虫夏草的代用品3，其在药用价值 方面有着巨大的开发潜力。蛹虫草中含有多种药理学活性成分，包括核苷类物质，多糖，甾45醇类及肽类等。n6-（2-羟乙基）腺苷是一种腺苷衍生物，是虫草的特有成分，已成为虫草制品的质量 控制指标之一4。它是第一个生物来源的钙离子拮抗剂5，具有很强的抗紫外辐射、抗血小 板凝结和镇痛等效用6，是集医药保健、化妆品和生物防治多项开发潜力于一身的生物资源 7，但其在抑制肿瘤生长方面的作用报道很少。本研究利用水提醇沉、制备液相和结晶等简50单的方法，从人工蛹虫草中分离纯化出了 n6-（2-羟乙基）腺苷，并利用小鼠 lewis 肺癌细 胞为细胞模型，对其在体外抗肿瘤方面的作用做了初步探索。551仪器与试剂图 1 n6-(2-羟乙基)腺苷fig. 1 chemical structure of n6-(2-hydroxyethyl)-adenosine1.1材料小鼠 lewis 肺癌细胞，由南开大学馈赠；人工蛹虫草，由本实验室培育。1.2仪器akta exploer，够于 ge 公司； 旋转蒸发仪，购自上海亚容生化仪器厂；台式冷冻离60心机，购自 thermo 公司；ymc-pack ods-a 反相色谱柱，购自博纳艾杰尔公司；二氧化碳 培养箱，购自 rs biotech 公司；倒置光学显微镜，购自日本尼康公司；全波长酶标仪， 购自 thermo 公司。1.3试剂甲醇为色谱纯，购自 honeywell 公司；无水乙醇，够自天津市北方天医化学试剂厂；65dmem 无血清细胞培养基，购自北京 thermfisher 科技生物制品有限公司；胰蛋白酶购自 roche 公司；细胞培养用青霉素和链霉素、胎牛血清（fbs）购自 invitrogen 公司；苔盼兰购自北京西美杰科技有限公司；mtt 购自 solarbio 公司； dmso，分析纯，购自天津市北方天医化学试剂厂。2实验与方法702.1n6-（2-羟乙基）腺苷的制备2.1.1n6-（2-羟乙基）腺苷的分离与纯化蛹虫草粗提物的制备称取 500 g 蛹虫草超微粉碎粉末，分别加水 8 倍，4 倍和 3 倍对其进行 3 次连续煎煮提取，每次煎煮 30 min，水沸腾时开始计时。煎煮提取结束后室温下 6000 rpm 离心 30 min，75收集合并上清液。上清液经旋转蒸发仪浓缩至适量，边搅拌边向浓缩液中加入 95%的乙醇， 至乙醇终浓度为 80%，4静置，沉淀过夜。收集乙醇上清液，上清液经旋转蒸发仪浓缩回 收乙醇后，转移至 60恒温鼓风干燥箱中干燥至恒重。2.1.2n6-（2-羟乙基）腺苷的分离与纯化 将干燥至恒重的乙醇上清液用流动相（15%甲醇-水溶液）配制成 100 mg/ ml 的溶液，80经制备液相进行分离。分离条件为：流动相为 15%甲醇-水溶液，监测波长为 260 nm，流速为 10 ml/min。制备液相所得色谱图见图 2，收集图 2 中的最后一个峰。分离结束后，使用 旋转蒸发仪浓缩最后一个峰的收集液，4结晶，得白色结晶形固体。图 2 制备液相色谱图85fig. 2 chromatogram of preparative liquid chromatography2.1.3n6-（2-羟乙基）腺苷的鉴定采用 esi-ms，nmr 和 ir 技术鉴定 n6-（2-羟乙基）腺苷。2.2mtt 法检测 n6-（2-羟乙基）腺苷对小鼠 lewis 肺癌细胞的生长抑制作用2.2.1细胞培养90小鼠 lewis 肺癌细胞用含 10%胎牛血清的 dmem 培养基，于 37、5%co2 培养箱中培 养。每 23 天换一次培养液，常规胰酶消化传代。2.2.2细胞毒性检测（mtt 法）1）采用 mtt 法检测 n6-（2-羟乙基）腺苷对小鼠 lewis 肺癌细胞的抑制效果，实验设 置空白对照组（只含培养液），阴性对照组（含细胞和相应量的溶剂），实验组，阳性药物95（虫草素）组。每组设 3 个复孔。2）取处于对数生长期，生长状态良好的细胞，将细胞进行常规胰酶消化后制备成细胞 悬液，用血细胞计数板计数，调整细胞浓度为 2.5104 个/ml，96 孔板中每孔接入 90 l 的100105110115120125细胞悬液。结束后，将细胞于 37，含 5% co2 的培养箱中培养 24 h，使细胞充分贴壁。3）细胞贴壁后，向实验组中加入 10 l 事先配制好的不同浓度的 n6-（2-羟乙基）腺苷 溶液，使 n6-（2-羟乙基）腺苷的终浓度为 400 g/ml，200 g/ml，100 g/ml，50 g/ml，25 g/ml，和 12.5 g/ml。阴性对照组中加入 10 l 的无菌水，阳性对照组虫草素的终浓度 分别为 12.5 g/ml ，25 g/ml，50 g/ml 和 100 g/ml。细胞继续于 37，含 5%的 co2 培养箱中分别培养 24 h，48 h 和 72 h。4）培养结束后每孔加入 10 l 5 mg/ml 的 mtt 溶液，37继续培养 4 h 后，小心吸取 弃掉培养液，每孔再加入 150 l 的 dmso，室温下于蜗旋混合器上振荡 10 min，以充分溶 解紫色结晶物质。5）于酶标仪下测定 570 nm 处的 od 值，630 nm 处校正。按下列公式计算 n6-（2-羟乙 基）腺苷对小鼠 lewis 肺癌细胞的抑制率：抑制率（%）=（实验组 od 值-阴性组 od 值）/(阴性组 od 值-空白组 od 值)100。6）数据结果采用 spss 13.0 进行分析。3结果与分析3.1n6-（2-羟乙基）腺苷的鉴定化合物经 esi-ms，nmr 和 ir 鉴定，结果见图 36。经结构解析，确定所得白色结晶 形粉末为 n6-(2-羟乙基)腺苷。解析结果如下：正离子模式电喷雾质谱(+)-esi-ms给出准分子离子峰 m/z 为： 311.97 m+h+；提示 分子组成为 c12h17n5o5。1d 1hnmr 谱中(dmso-d6, 400 mhz)的数据结果如下：8.358(1h, s,h-8)，8.216(1h，s，h-2)，7.699(1h，brs，n6h)，5.882(1h，d，j=6.3 hz，h-1)，5.447(1h，d，j=6.3 hz, 2-oh)，5.416(1h，dd，j=6.9，4.7 hz，5-oh)，5.189(1h，j=4.7 hz，3-oh)，4.769(1h，brs，oh-2)，4.605(1h，dd，j=11.3，6.0 hz，h-2)，4.148(1h，m，h-3)，3.959(1h，dd，j=6.6，3.6 hz)，3.665(1h，dt，j=12.1，3.9 hz，ha-5)，3.573(4h，brs，h-1”, 2”)1d 13cnmr 谱中(dmso-d6, 400 mhz)的数据结果如下：155.19(c-6)，152.77(c-2)，148.75(c-4)，140.25(c-8)，120.27(c-5)，88.40(c-1)，86.36(c-4)，73.94(c-2)，71.11(c-3)，62.13(c-5)，60.14(c-2”)，42.95(c-1)。ir 谱中：cm-1，3419.86(nh)，3305.66，3268.83，3151.46(oh)，1626.34(c=n)，参照 文献8报道的数据，鉴定化合物为 n6-(2-羟乙基)腺苷。130135图 3 化合物的 esi-ms 结果fig. 3 esi-ms spectrum of compound图 4 化合物的 13cnmr（dmso-d6, 400 mhz）谱图fig. 4 13cnmr (dmso-d6, 400 mhz ) spectrum of compound图 5 化合物的 1hnmr（dmso-d6, 400 mhz）谱图fig. 5 1hnmr (dmso-d6, 400 mhz ) spectrum of compound1403.2细胞毒性试验结果图 6 化合物的 ir 结果fig. 6 ir spectrum of compound145150实验用 12.5 g/ml，25 g/ml，50 g/ml，100 g/ml，200 g/ml，400 g/ml 的 n6-（2-羟乙基）腺苷作用于小鼠 lewis 肺癌细胞，经过 24 h、48 h、72 h 的培养后，采用 mtt法分析了药物对小鼠 lewis 肺癌细胞的生长抑制效果。结果见表 1 和图 7，结果显示，n6-（2-羟乙基）腺苷对小鼠 lewis 肺癌细胞具有细胞毒作用，此种作用呈现剂量-时间依赖效应。 采用 spss 13.0 计算半数抑制浓度的结果见表 2，表 2 显示，当作用时间为 72 h 时，n6-（2- 羟乙基）腺苷对小鼠 lewis 肺癌细胞半数抑制浓度为 48.49 g/ml。显示 n6-（2-羟乙基）腺 苷对小鼠 lewis 肺癌细胞具有较强的抑制作用，能够明显抑制细胞的生长。表 1 n6-（2-羟乙基）腺苷对小鼠 lewis 肺癌细胞的增殖抑制效果tab. 1 inhibitory effect of n6-(2-hydroxyethyl)adenosine药物药物作用浓度g/ml24 h 抑制率%( x s )%48 h 抑制率%( x s )%72 h 抑制率%( x s )%6.2512.5255.323.9711.544.5122.550.348.432.8817.790.0330.173.1711.332.4623.292.7837.631.33n6-（2-羟乙基）腺苷5032.955.3943.756.9451.192.9710047.514.2459.110.2167.873.2820062.914.8967.174.7975.472.2940082.392.9477.373.9987.290.73阳性对照（虫草素）12.527.191.2239.131.9754.045.792522.550.3430.173.1737.631.335079.950.0588.230.9292.871.7710089.011.7992.570.6799.581.62n6-（2-羟乙基）腺苷对小鼠lewis肺癌细胞的增殖抑制作用120100抑制率%80604020024 h48 h72 h浓度 g/ml155图 7 n6-（2-羟乙基）腺苷对小鼠 lewis 肺癌细胞的增殖抑制效果fig. 7 inhibitory effect of n6-(2-hydroxyethyl)adenosine表 2 不同作用时间的半数抑制浓度 ic50tab. 2 ic50 of different time药物作用时间 hic50 值 g/ml1604小结与讨论24105.164876.047248.49165170药物的体外细胞筛选是常用的研究手段，稳定、方便、经济；可研究药物作用的靶位； 时间、剂量等条件的稳定可控性；能够快速区分药物的体内间接作用与直接作用等优点使体 外筛选成为药物活性成分筛选的重要组成部分。体外筛药方法诸多，mtt 法以其快速，简 便，处理量大的优点被广泛用于体外抗肿瘤药物的筛选。研究应用水提醇沉，制备液相，结晶等简单的方法，从人工蛹虫草子实体中分离纯化出 了 n6-（2-羟乙基）腺苷，并采用 mtt 法初步分析了 n6-（2-羟乙基）腺苷对小鼠 lewis 肺 癌细胞的增殖抑制效果。结果显示