体外培养成肌细胞贴壁速度与细胞物理性状.doc

精品论文体外培养成肌细胞贴壁速度与细胞物理性状及成熟度间的关系1车晓霞 1，郭杰 2， 任超超 1，许妍 1，王邦康 1，白玉兴 11 首都医科大学附属口腔医学院正畸科，北京（100050）2 山东大学口腔医学院正畸科，山东济南（250012）e-mail: 摘要：目的：探讨体外培养成肌细胞差速贴壁机制，研究成肌细胞不同贴壁速度与物理性状和成熟度间的关系。材料和方法：本研究包括两个部分。第一部分是从 7 日龄 sd 大鼠后 肢肌肉分离成肌细胞进行体外培养，第三代采用差速贴壁法传代，分别在贴壁 20min、 1h、2h 和 26h 时收获细胞，采用流式细胞仪检测细胞的大小和颗粒度分布特征及 cd34, pax7, m-cadherin 的表达情况。第二部分是采用 70、55、40、35、25 和 15%等六步 percoll 密度 梯度离心法分离原代成肌细胞，流式细胞仪检测各组细胞 cd34, pax7, m-cadherin 的表达。 结果:流式细胞仪检测体外培养成肌细胞第三代差速贴壁法传代的结果显示快速贴壁细胞 小，所含颗粒多，而贴壁较慢的细胞大，所含颗粒少，26h 后还未贴壁的细胞小，但所含颗 粒相对更少；cd34, pax7 等阳性细胞主要出现在较晚贴壁的细胞中。流式细胞仪检测 percoll六步密度梯度离心分离的原代成肌细胞，结果显示在 15-25% percoll 分离组分中富集 cd34,pax7 阳性细胞。结论: 本研究结果提示细胞贴壁速度与物理性状和成熟度密切相关，可以采 用 15-25% percoll 密度梯度离心法快速分离具有干细胞特征的肌肉形成细胞。关键词： 成肌细胞；细胞贴壁；细胞密度；细胞培养体外培养的成肌细胞是通过酶消化后从肌肉中分解释放出来的单核细胞，具有肌肉形成 能力，进行移植后可以作为一种治疗遗传性肌病和基因转染载体的方法，但到目前为止尚未 取得满意的应用效果。kuang s(1)等的研究结果显示根据干细胞表达标志分离出来的成肌细 胞可以显著提高移植后细胞的存活率。近些年的研究表明，从表达分子标记的角度来看，肌肉中不同表型的细胞可以认为处于 静止、激活、增殖及分化等不同的肌肉形成阶段。pax7，一种盒型配对转录因子，特异性地 表达在静止和新激活的肌肉卫星细胞中，在成体骨骼肌中具有维持干细胞库作用(2) 。 m-cadherin是一种位于肌纤维和肌肉卫星细胞间的粘附分子，也经常被用来定义肌肉卫星细 胞。然而，wrbel e,等(3)的研究提示m-cadherin参与大鼠肌肉卫星细胞的分化。cd34阳性细 胞存在于肌肉间充质组织中，在刚从肌肉中分离出来的细胞中，cd34+/45-肌上皮前体细胞 仅表达c-met mrna，但不表达其它成肌相关的标记分子，如myod、myf-5、m-cadherin和 pax-7等，然而，在3天后，这些标记分子相继表达(4)。研究者们经常利用细胞的差速贴壁能力来纯化体外培养的成肌细胞，但是对其机制尚不 明了。我们假设细胞的这种能力不仅与成熟程度有关，同时也受到细胞物理性状的影响，由此设想建立一种方法，根据某一物理性状来分离纯化具有干细胞特征的肌肉细胞。本研究通过两个部分来验证这一假设。第一部分是将体外培养的成肌细胞按照差速贴壁方法进行传 代，分别在不同的时间点收集细胞。流式细胞仪检测所收集细胞的大小和所含颗粒特征，以 及 cd34、 pax7、m-cadherin 等分子标记的表达；第二部分是采用多步 percoll 密度梯度离1本课题得到教育部博士学科专项基金的资助（20050025003 幼成年大鼠下颌功能性前伸后翼外肌改建机制 的对比研究）。- 6 -心法直接分离肌肉来源的单核细胞，并用流式细胞仪观察 cd34, pax7 及 m-cadherin 阳性细胞的分布特征。1. 材料和方法1.1 成肌细胞准备1.1.1成肌细胞体外培养与传代常规分离制备 7 日龄雄性 sd 大鼠后肢肌肉组织(5) ，0.2%型胶原酶(worthington biochemicals)及 0.25%胰蛋白酶(sigma) 37下分别消化后，100 目滤网过滤，离心后收集细 胞，接种在没有包被多聚赖氨酸的培养瓶中使细胞预贴壁 20min，两次，去除成纤维细胞。 将没有贴壁的细胞按照 5104 接种在预先包被多聚赖氨酸的培养瓶中，加入增殖培养基 (dulbeccos modified eagles medium 中加入 20%胎牛血清，及浓度为 102u/ml 的青链霉素 gibco)进行体外培养；或者进行 percoll 密度梯度离心分离。体外培养的成肌细胞生长到铺满培养瓶底 80%左右后传代。在细胞第三次传代时采用差 速贴壁法进行，分别在 20min、1h、2 h 及 26h 收获贴壁细胞；并收获在 2h 和 26h 没有贴壁 的细胞，流式细胞仪检测每组不同成肌分子标记的表达。1.1.2密度梯度离心分离直接从肌肉中获得的单核细胞本研究中采用的 percoll 密度梯度离心方案是对 kstner s. 等(6)方案的修订，如图 1 所 示。将含有 70, 55, 40, 35 25 和 15% percoll (amersham biosciences) 的生理盐水溶液，各两 毫升，依次置于 15ml 离心管中，形成六步密度梯度离心体系，从顶端缓慢加入从肌肉中直 接分离出来的细胞混悬液，室温下 1,250g 水平离心 20 min 后，分别在不同的密度界面间收 集细胞，如图 1，包括 15-25%界面及 25-35%界面，35-40% 间的细胞层次不清，所以与 40-55% 界面间的细胞合并为 35-55%组，生理盐水洗两次去除 percoll 颗粒后进行流式细胞仪检测。1.2流式细胞仪检测1.2.1流式细胞仪检测成肌细胞的分子标记表达 体外培养的第三代成肌细胞经差速贴壁传代后获得的不同细胞亚群，及 percoll 密度梯度离心后分离的新鲜肌肉细胞的不同亚群按照 11 06/ml 密度悬于 500l 的 pbs 中，分别加入 cd34 (santa cruz 1:50)、pax7(r&d system, inc 1:30)、m-cadherin (santa cruz 1:50)一抗，37下孵育 30 分钟，pbs 清洗 2 次，再加入 fitc 标记的荧光二抗(santa cruz)，室温下孵 育 30 分钟， pbs 清洗 2 次， 上流式细胞仪(bd company)检测各组细胞相应的抗体表达， 设立荧光对照。1.2.2流式细胞仪检测成肌细胞的大小及颗粒分布特征 采用流式细胞仪检测差速贴壁分离的体外培养成肌细胞不同亚群的大小及颗粒分布，如图 2 所示。方法为根据细胞对照组确定阈值，计算相应荧光对照组阳性细胞比率。1.3统计分析采用四格表卡方检验流式细胞仪检测荧光对照组与抗体检测组相比阳性细胞率是否具 有统计学意义，以 p0.01 为标准。图 1 percoll 密度梯度离心法分离大鼠后肢肌肉来源细胞示意图figure 1 schematic representation of the percoll density fractionation of cells isolated from the hindlimb muscles of neonatal rat.abc图 2 采用流式细胞仪计算细胞大小及颗粒分布的方法示例。图 a 显示的是 1h 贴壁细胞的散点分布图；图 b和图 c 显示的细胞大小和颗粒分布的柱形图，各图中分别设立相应的计算阈值。细胞大小的计算阈值 m 为223，颗粒为 266。figure 2 size and granule distribution of muscle-derived cells with differential adherent velocity detected by flow cytometry the distribution of the 1h adherent cells shown as the scatterplots in a. the size and granule calculated methods using flow cytometry were shown in b and c histograms. markers were set to calculate the percentage of the corresponding cells to the total cells.2. 结果（1）流式细胞仪检测体外培养的成肌细胞经差速贴壁传代后不同亚群的成肌分子标志 表达流式细胞仪检测体外培养的成肌细胞经差速贴壁传代后不同亚群的成肌分子标志表达 的结果见表 1。从表 1 中可以看出，cd34 阳性细胞主要出现在 2h 未贴壁细胞和 26h 贴壁 与未贴壁细胞中，而 pax7 阳性细胞主要富集于 2h 贴壁细胞中。除了 26h 未贴壁细胞，其 余各组细胞中 m-cadherin 阳性细胞率均有统计学意义。表 1 体外培养的肌肉形成细胞差速贴壁后分子标记物的表达table 1 myogenic markers expression of cultured muscle cells fractionated by differential adherent velocity20min贴 壁细胞1h2h贴 壁贴壁 细胞细胞2h未贴壁 细胞26h贴壁 细胞26h未贴壁细胞荧 光0.062.814.931.331.350.55cd354.78*2.46*1.51*pax70.151.986.19*2.62*3.96*1.33*m-cad1.32*13.69*8.60*10.50*3.19*0.99对照备注：* 代表实验组与荧光对照组相比，相应抗体阳性细胞率具有统计学意义， p0.01。(2)流式细胞仪检测体外培养成肌细胞经差速贴壁传代后不同亚群的大小及颗粒分布 特征流式细胞仪检测体外培养成肌细胞经差速贴壁传代后不同亚群的大小及颗粒分布特征 结果见表 2，从中可以看出快速贴壁细胞与贴壁速度慢的细胞相比，细胞小，所含颗粒较多， 贴壁慢的细胞相对较大，所含颗粒较少。26 小时未贴壁的细胞体积小，但所含颗粒也很少。表 2 流式细胞仪检测体外培养的肌肉形成细胞经差速贴壁后的不同亚群细胞的大小及颗粒分布特征 table2 flow cytometric characteristics of the size and granule distribution of muscle-derived cell separated by differential adherent velocity大小 细大 小 颗 粒胞 亚 群分 布%颗粒%20min 贴壁细胞1.8311.431h贴壁细胞8.151.322h 贴壁细胞27.953.6026h 贴壁细胞35.753.1026h 未贴壁细胞2.721.09（3） 流式细胞仪检测原代肌肉细胞不同密度亚群的成肌分子标记表达流式细胞仪检测原代肌肉细胞不同密度亚群cd34、pax7和m-cadherin等的表达，从未进 行分离的总细胞组到35-55%percoll界面间细胞组，结果见表3。从表3中可以看出，cd34 和 pax7 阳性细胞主要出现在15-25% 和 25-35%percoll界面间，而m-cadherin阳性细胞主要富 集于25-35%percoll界面间，35-55% percoll界面间的细胞组中pax7、cd34和m-cadherin阳性 细胞与对照组相比没有统计学意义，说明表达这些分子标记的细胞密度较小。表3 流式细胞仪检测密度梯度离心分离出的肌肉形成细胞不同亚群的成肌分子标记表达table 3 myogenic markers expression of different subgroups derived from the primary muscle cells separated bypercoll density gradient centrifugation总细胞组15-25%25-35%35-55%fluo-co+%3.58+%2.48+%2.19+%2.9ntrolcd3413.24*23.35*3.77*2.4pax76.49*12.00*4.56*4.8m-cadh erin6.12*4.506.09*2.0备注：* 代表实验组与荧光对照组相比，相应抗体阳性细胞率具有统计学意义， p0.01。3. 讨论很多研究旨在获得大量的具有干细胞特征的肌肉形成细胞，在体外培养过程中差速贴壁 法常用于分离纯化肌肉细胞(7,8)。huard j 的研究小组建立了一种以 24 小时为间隔的序列贴 壁技术(9)，肌肉来源的细胞被分为早期贴壁细胞、晚期贴壁细胞和肌肉来源的干细胞。流式 细胞仪检测不同贴壁时间获得的细胞成肌分子表达的结果显示，连续三个 24 小时贴壁获得 的细胞 sca-1 和 cd34 阳性表达呈阴性，desmin 表达阴性，m-cadherin 的阳性细胞率介于40% 和 80%之间； 四个 24 小时后仍未贴壁细胞表现为 sca-1 和 cd34 阳性，m-cadherin阴性，desmin 阳性细胞率低于 30%。rouger k等 (10) 采用免疫细胞化学染色的方法检测m-cadherin、 pax7和 desmin的表达 来判断细胞处于成肌进程的不同阶段。晚期贴壁细胞表现为m-cadherin 阳性细胞率为62.74.8%，而早期贴壁细胞m-cadherin阳性细胞率为83.22.2%；而晚期贴壁细胞的pax7阳 性细胞率明显高于早期贴壁细胞。我们的实验结果显示体外培养传代后的成肌细胞cd34和 pax7阳性细胞也较晚贴壁，而m-cadherin的阳性细胞在26 小时前贴壁的细胞中都有表达。最近的一些研究结果提醒我们细胞的物理形状与它们的成熟度相关，从形态学的观察来 看，肌肉细胞中可以分辩出 round 和 thick 两种细胞 (11)， round 细胞高水平表达 pax7， 而 thick 细胞表达相应的成肌分化信号。成肌细胞移植实验显示 round 细胞修复肌纤维比 thick 细胞更加有效。从肌肉中获得的细胞也表现出细胞大小的差异，从 4 到 10 mum 不等 (12)，并与特定的成肌分子标记表达相关，显示出这些细胞处于不同的成肌阶段。我们的研 究中通过流式细胞仪对肌肉细胞大小及所含颗粒状态的分析，提示我们细胞贴壁速度不同可 能与的细胞密度有关。密度梯度离心是一种按照细胞密度分离不同细胞亚群的方法。kastner s.等(6) 采用五步 密度梯度离心方法分离在体外培养了 8 天的肌肉卫星细胞，以 myod/mef2a 作为阳性细胞 标志，结果发现在 55% percoll 组分中这种细胞阳性率最高，而在 2535% 和 35%组分中显 著降低。随着研究的深入，这些年来研究者们逐渐认识到 pax7 和 cd34 阳性细胞比 myod/mef2a 阳性细胞更加具有干细胞特征(13)，因此我们增加 15% percoll 组分，以分离 更具有干细胞特征的肌肉形成细胞，结果显示 pax7 和 cd34 阳性细胞主要富集于 15-25% 和25-35% percoll 界面间；而处于稍晚成肌阶段，表达 m-cadherin 的阳性细胞主要富集于25-35% percoll 界面间；表达这些标志的阳性细胞在 35-55% percoll 界面间的细胞中均为阴 性。所以，我们可以采用 15-25% percoll 密度梯度离心的方法快速分离肌肉来源的干细胞。参考文献1 kuang s, kuroda k, le grand f, et al. asymmetric self-renewal and commitment of satellite stem cells in muscle. cell. 2007,129(5): 999-10102 perez-ruiz a, ono y, gnocchi vf, et al. beta-catenin promotes self-renewal of skeletal-muscle satellite cells.j cell sci. 2008, 121:1373-13823 wrbel e, brzska e, moraczewski j. m-cadherin and beta-catenin participate in differentiation of rat satellite cells. eur j cell biol. 2007,86(2):99-1094 tamaki t, akatsuka a, ando k, et al. identification of myogenic-endothelial progenitor cells in the interstitialspaces of skeletal muscle. j cell biol. 2002,157(4):571-5775 rando ta, blau hmprimary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. j cell biol. 1994, 125(6):1275-12876 kastner s, elias mc, rivera aj, et al. gene expression patterns of the fibroblast growth factors and theirreceptors during myogenesis of rat satellite cells. j histochem cytochem 2000, 48(8):1079-10967 blau, h. m., and c. webster. isolation and characterization of human muscle cells. proc. nati. acad. sci. usa1981, 78(9):5623-5627.8 qu,z., balkir, l., van deutekom, et al. development of approaches to improve cell survival in myoblasttransfer therapy. j. cell biol. 1998,142(5): 1257-12679 lee jy, qu-petersen z, cao b, et al clonal isolation of muscle-derived cells capable of enhancing muscle regeneration and bone healing. j cell biol. 2000 ,150(5):1085-110010 rouger k, fornasari b, armengol v et al. progenitor cell isolation from muscle-derived cells based on adhesionproperties. j histochem cytochem. 2007, 55(6): 607-61811 hashimoto n, murase t, kondo s, et al. muscle reconstitution by muscle satellite cell descendants with stem cell-like properties. development. 2004,131, 5481-549012 jouvion g, rouger k, fornasari b, et al. functional properties of muscle-derived cells related to morphologicalcharacteristics. histochem cell biol. 2006,126(5): 603-61613 yablonka-reuveni z, day k, vine a, et al. defining the transcriptional signature of skeletal muscle stem cells. j anim sci. 2008,86, e207- e 216adherent velocity of myoblast related to physicalcharacteristics and extent of maturationxiaoxia che1, jie guo2, chaochao ren1, yan xu1, bangkang wang1, yuxing bai11 dept. of orthodontics faculty of stomatology capital university of medical sciences, beijing（100050）2 dept. of orthodontics faculty of stomatology, shandong university, jinan（250012）abstractobjective：to seek into the mechanism of the differential adherent velocity of myoblast cultured invitro. we assumed that this ability was not only related to the extent of maturation, but also to the physical characteristics of these cells. methods: experiments presented in the current study included two parts. in the first part, the cultured third passage myoblats were transferred according to the differential adherent velocity and acquired at 20min, 1h, 2h and 26h. the size and granule distribution, also cd3