两个斑茅ＢＣ１无性系染色体核型及染色体遗传分析1.doc

豆丁网精品论文两个斑茅无性系染色体核型及染色体遗传分析1邓祖湖 1，赖丽萍 2，林炜乐 2，符成 3，林彦铨 21 农业部甘蔗生理生态与遗传改良重点开放实验室，福州（350002）2 福建农林大学作物科学院，福州（350002）3 广州甘蔗糖业研究所，广州（510642）e-mail：摘要：本文对两个斑茅 bc1 后代，崖城 0121 和崖城 0136 进行 its 签定和染色体计 数与核型分析，以探讨斑茅后代的染色体遗传行为。研究结果表明，崖城 0121 的体细胞染色体核型公式为 2n104100m+4sm（4sat），最长与最短染色体的长度比为 4.25，平均 臂比 1.35，染色体属 2c 型，分子鉴定结合细胞学研究认为其为斑茅的真实后代，其染色体遗传为 n+n；崖城 0136 经 its 签定为真实杂种，其体细胞染色体核型公式为 2n132130m+2sm，最长与最短染色体的长度比为 3.94，平均臂比 1.27，染色体属 2b 型，结合其 性状的进展，推断亲本向其传递染色体可能以 2n+n 的方式进行。关键词：斑茅，甘蔗，its 鉴定，核型分析，染色体遗传行为甘蔗是我国优势农产品，为我国乃至世界最重要的糖料作物1。甘蔗一方面具有广泛的 种质血缘基础，目前的栽培甘蔗品种大都含有甘蔗属 35 个种的血缘，但同时由于甘蔗大 多数无性系不易开花，花期差异大，花粉量和花粉育性等开花习性差异及配合力等原因影响， 致使在甘蔗杂交育种常规组合选配中，可使用的亲本材料少，由于长期近亲杂交，品种间的 遗传性逐渐趋于一致，从而限制了品种生产力的进一步提高2 。必须不断创新种质才能选 育出突破性新品种。.世界甘蔗育种发展趋势是通过扩大甘蔗种质基础，开发近缘属、种植物的利用来提高甘 蔗的产量、糖分和生活力。为扩大异质性，各国育种家不断进行了甘蔗种间、近缘属间和远 缘属间杂交，通过染色体数目分析推断，甘蔗远缘杂交存在2n+n、n+n、n+2n、2n+2n等多 种类型，并且n常常不是一倍体的原来数目，常有增减，即存在“不平衡杂种”3。斑茅（s.arundinaceum retz）是甘蔗的近缘属植物，具有生长旺盛、抗旱耐瘠、抗病虫性强、宿根性好、适应性广、生态竞争能力强等优良性状4-6。因此,斑茅的杂交利用越来越 受到国内外甘蔗育种界的重视，期望通过甘蔗与斑茅远缘杂交把斑茅的优异特性导入甘蔗 中，寻求甘蔗育种新的突破7-9。但，斑茅杂交利用尝试几十年，进展缓慢，至今尚未选到 经鉴定为斑茅真实杂种的可供生产或育种应用的品种或亲本材料10.11。其原因主要有：（1） 杂种鉴定难；（2）后代花粉育性低；( 3)杂交后代遗传机理不明，染色体（性状）的遗传与 分离规律不清。然而，由于甘蔗细胞的多倍性和异质性，染色体数目多、体积小等原因，使 得核型分析较难进行12.13，因而甘蔗细胞学研究进展缓慢。为更了解甘蔗与斑茅杂交后代的染色体遗传行为，提高斑茅在甘蔗育种上的利用效 率。本文对两个斑茅 bc1 无性系崖城 0121 和崖城 0136 进行了染色体核型分析，旨在 了解甘蔗与斑茅杂交 bc1 代的染色体行为，以便为斑茅在甘蔗育种上的充分利用提供一定 的细胞学理论依据。1本课题得到国家自然科学基金（30671329）、教育部博士点基金（20050389003）和福建省自然科学基金（2006j0309）资助。通讯作者：林彦铨。tel e-mail：1 材料与方法1.1 材料选取保育住福建农林大学甘蔗综合研究所资源圃，崖城96-40和栽培种cp84-1198的后代 崖城0121和崖城0136为材料，其系谱图为：拔地拉海南斑茅 92-77崖城 96-40cp84-1198崖城 0121崖城 0136图 1 谱系图1.2 研究方法1.2.1 甘蔗斑茅 bc1 杂种真实性鉴定 根据农业部甘蔗生理生态与遗传改良重点开放实验室建立的已授权的发明专利“甘蔗斑茅杂种的 dna 鉴定方法”，利用据 its 区保守序列设计的两对 its 区特异引物（ef1 和 er1；ef2 和 er2）对崖城 96-40 和 cp84-1198 的杂交后代崖城 0121 和崖城 0136 进行真实性 鉴定；pcr 扩增反应在 eppendorf mastercycler gradient 扩增仪上进行，扩增程序为 95oc 预 变性 5 min，93oc 变性 50s，52oc 退火 20s，72oc 延伸 40s，共 30 个循环，最后 72 保温 5 min。1.2.2 染色体玻片制备 适温诱根：在湿润 28oc 条件下，使带节茎段发根 2-3cm，斑茅用基部茎段促根。 预处理：当根长 2-3cm 时，除去根冠，剪下根尖，立即投入饱和 -溴萘溶液中，在 暗室中进行室温处理 4 小时。 固定：将预处理过的根尖置于甲醇冰乙酸（3：1）溶液中，在冰箱固定 12 小时以 上。 酶解：固定过的根尖在蒸馏水中浸洗 5-6 遍，然后置于 500u/ml 纤维素酶（东京化成 工业株式会社，25u/mg,）和 250u/ml（东京化成工业株式会社，2.5u/mg,）果胶酶的混合液 中，在 31oc 下酶解 4-6 小时（不同的材料或同一材料的不同大小的根尖酶解时间不同）。后低渗：酶解后的根尖用蒸馏水浸洗 5-6 遍，然后置于蒸馏水中后低渗 30 分钟。涂片：取一干净的玻片，夹几个根尖置于玻片上，滴一滴固定液，快速用镊子敲碎， 去掉大块残渣，涂均，在火焰上微烤，烘干。染色：制好的片子在 ph 值为 6.87.0 的 giemsa 染液中染色 30 分钟。1.2.3 染色体计数及核型分析每个样品取 20 个完整细胞在 dialux 20eb 1000 倍高倍镜下进行染色体计数，选取分 散性好的细胞，通过 pixera 与微机连接拍摄，之后测量其长度。在放大的图片上剪取染色 体，根据染色体的形态特征以及对测量得到的数据进行分析，进而进行同源配对，排成核型 图。核型分析按李懋学等14的标准经适当的修改后进行。核型分析有关参数按下列公式计算：某号染色体长度1）相对长度（100%）全部染色体总长度100长臂2）臂比短臂最长染色体3）染色体长度比最短染色体2 结果与分析2.1 甘蔗斑茅杂交后代 bc1 杂种真实性鉴定利用农业部甘蔗生理生态与遗传改良重点开放实验室建立的甘蔗斑茅真实杂种鉴定技 术鉴定崖城 96-40 与商业栽培种 cp84-1198 回交的后代崖城 01-21 和崖城 0136。结果显示， 以 ef2 和 er2（图 2），ef1 和 er1（图 3）为引物，斑茅 9277、崖城 96-40 和崖城 01-36 都扩增出斑茅特有条带，而拔地拉和 cp84-1198 没有相应条带，说明崖城 0136 为甘蔗斑 茅的真实杂种，而崖城 0121 在以 ef1 和 er1 为引物下扩增出特异条带，在 ef2 和 er2 中没有扩增出条带，这点与郑雪芳的结果一致，该文中 115 号样品为崖城 0121，尚难断 定是否为斑茅的真实杂种15，需与其它方法结合来初步判断为甘蔗斑茅的真实杂种，拟进 一步进行细胞学遗传分析。图 2 引物 ef2/er2 扩增结果fig2 amplification patterns of the hybrid and backcross progeny from the cross of s. officinarum l. and e.arundinaceum using ef2er2图 3 引物 ef1/er1 扩增结果fig3 amplification patterns of the hybrid and backcross progeny from the cross of s. officinarum l. and e.arundinaceum using ef1er1注：m：dl2000 1：badila 2：海南 92-77 3、崖城 96-40 4、cp84-1198 5、崖城 01-21 6、崖城 01-36note: m、dl2000 1、badila 2、hainan92-77 3、ya96-40 4、cp84-1198 5、ya01-21 6、ya01-362.2 甘蔗斑茅远缘杂交后代杂种细胞学分析2.2.1 崖城 0121崖城 01-21 的体细胞染色体数众数为 2n104（102106），绝对长度 1.265.54um， 其形态特征见图 8。表 1 列出的是崖城 01-21 的 52 对染色体的相对长度、臂比及类型。从 图 8、图 10 及表 1 可见，崖城 01-21 的染色体中，第 5 和 8 号染色体臂比介于 1.713.00， 为亚中部着丝点染色体（sm）,其余 50 对染色体臂比 1.011.70，为中部着丝点染色体（m）， 而且第 6 和 9 号染色体具随体。最长与最短染色体的长度比为 4.25，平均臂比 1.35，核型公 式为 2n104100m+4sm（4sat），染色体属 2c 型，其染色体核型模式图可见图 10。2.2.2 崖城 0136崖城 01-36 的体细胞染色体众数为 2n132（128134），绝对长度 1.455.72um，其 形态特征见图 9。表 2 列出的是崖城 01-21 的 66 对染色体的相对长度、臂比及类型。从图 9、 图 11 及表 2 可见，崖城 01-21 的染色体中，第 9 号染色体臂比介于 1.713.00，为亚中部着 丝点染色体（sm）,其余 65 对染色体臂比 1.011.70，为中部着丝点染色体（m）。最长与最 短染色体的长度比为 3.94，平均臂比 1.27，核型公式为 2n132130m+2sm,，染色体属 2b 型，其染色体核型模式图可见图 11。表 1 崖城 01-21 的染色体核型参数table 1 parameters of chromosome in ya01-21长臂long ram短臂short arm总长totalarm ratio(long/short)81.462.951.914.861.542.581.674.251.542.541.604.141.592.801.183.982.372.181.593.771.372.231.393.621.602.441.113.552.201.981.563.541.272.061.353.411.532.081.303.381.601.771.493.261.191.701.471.551.503.051.031.551.473.021.051.551.463.011.061.761.222.981.441.561.412.971.111.721.262.981.371.631.182.811.391.461.352.811.081.701.042.741.631.431.212.641.181.491.122.611.331.591.012.601.571.481.122.601.321.361.222.581.111.491.072.561.391.351.182.531.141.450.872.321.671.261.042.301.21染色体编号number相对长度 relative length %臂比类型type1m2m3m4m5sm6sat7m8sm9sat10m11m12m13m14m15m16m17m18m19m20m21m22m23m24m25m26m27m28m29m30m31m32m331.370.922.291.50m341.261.022.281.24m351.181.042.221.13m361.280.932.211.38m371.120.932.051.20m381.160.872.031.33m391.070.942.011.14m401.050.911.961.15m411.040.871.911.20m420.960.931.891.03m431.040.791.831.32m441.010.811.821.25m450.960.841.801.14m460.990.791.781.25m471.040.741.781.41m481.010.751.761.35m490.890.761.651.17m500.840.751.591.12m510.890.591.481.51m520.730.561.291.30m染色体编号表 2 崖城 01-36 的的染色体核型参数table 2 parameters of chromosome in ya01-36相对长度 relative length %臂比类型number长臂long ram短臂short arm总长totalarm ratio(long/short)type13.382.345.721.44m23.292.255.541.46m32.812.495.301.13m42.741.664.401.65m52.561.754.311.46m62.311.854.161.25m72.331.824.151.28m82.081.954.031.07m92.731.294.022.12sm102.431.543.971.58m112.111.833.941.15m122.341.563.901.50m132.041.853.891.10m142.061.773.831.16m152.111.673.781.26m162.071.663.731.25m172.031.683.711.21m181.971.683.651.17m192.011.613.621.25m201.901.633.531.17m211.941.573.511.24m221.981.413.391.40m231.811.563.371.16m241.781.533.311.16m251.741.573.311.11m262.041.253.291.63m271.891.383.271.37m281.851.403.251.32m291.861.343.201.39m301.641.553.191.06m311.681.503.181.12m321.741.343.081.30m331.681.383.061.22m341.651.403.051.18m351.531.493.021.03m361.831.193.021.54m371.741.252.991.39m381.731.192.921.45m391.661.242.901.34m401.471.282.751.15m411.561.192.751.31m421.521.212.731.26m431.571.132.701.39m441.581.082.661.46m451.591.032.621.54m461.341.262.601.06m471.281.262.541.02m481.341.192.531.13m491.451.082.531.34m501.291.192.481.08m511.371.092.461.26m511.04m531.311.072.381.22m581.05m551.370.992.361.38m561.261.022.281.24m571.151.082.231.06m581.230.972.201.27m591.360.842.201.62m601.170.982.151.19m611.051.022.071.03m621.070.982.051.09m631.030.901.931.14m641.030.901.931.14m650.980.791.771.24m660.740.711.451.04m3 结论与讨论3.1 结论根据以上实验结果可以看出：（1）崖城 0121 和崖城 0136 两甘蔗无性系都在不同程度上具亚中部着丝点染色体， 染色体分属 2c 和 2b 型。两参试材料具有中部着丝点染色体比例依次为：崖城 0121崖 城 0136。（2）平均臂比为：崖城 0121崖城 0136。（3）崖城 0121 的 4 条染色体具有随体。（4）虽然崖城 0121 在以 ef2 和 er2 、ef1 和 er1 为引物的 its 签定中，只在 ef1 和 er1 为引物下有扩增出特异条带，不能据此断定也不能排除为斑茅真实杂种。但，结合 核型分析，其染色体数为 2n104，而经本实验室研究，其母本崖 96-40 和父本 cp84-1198 的染色体分别为 70 条和 120 条，可以断定它是斑茅杂种，且染色体按 nn 的方式遗传，因 除远缘杂种的低代杂种外，甘蔗的高代杂种染色体一般都在 110-140 范围，因而该无性系不 可能是机械混杂的结果，在细胞学上证实崖城 0121 为真实的甘蔗斑茅杂交后代。（5）崖城 0136 在以 ef2 和 er2 、ef1 和 er1 为引物的 its 签定中，都出现了斑茅 的特有条带，分子鉴定其为斑茅的真实杂种，其染色体 2n132 条，若按标准 n+n 遗传其染 色体应为 2n95 条，若按 n+2n 遗传，其染色体应当为 2n155 条，染色体差异的条数分别 为 37 条和 23 条，染色体条数差异如此多的“不平衡杂种”尚未见报道。按标准的 2n+n，其 染色体应为 2n130 条，差异 2 条，较为符合，且崖城 0136 在茎径、空绵心、糖分等遗 传进展不如其它 n+n 遗传的 bc1 快，在本杂交系谱中，若是按 n+2n 遗传，高贵化进程应 更快，因此细胞学结合亲子性状遗传进展初步认为其亲本染色体以 2n+n 的方式进行遗传。3.2 讨论甘蔗亲子代染色体传递往往不符合经典的细胞遗传规律。多种甘蔗属间杂种的细胞学研 究表明，各种杂种按 nn，2n+n，n+2n，2n+2n 的配子类型结合，尽管倍数水平不同，但 杂种的配对仍以同源联会的形式进行，并且大多为二价体，表明在属间杂交和甘蔗育种中， 可利用染色体数目不减半的配子和同源染色体的配对，进行有效的基因转移13.16。吴能奕等 11、dhont17、戴艺民18 、刘文荣19、邓祖湖20等以不同材料进行研究发现，甘蔗与斑 茅有性杂交的 f1 染色体配对方式为 n+n。关于斑茅 f2 代染色体遗传行为，至今只有刘文荣 在以崖城 013 为材料的研究中提出 f2 代染色体配对方式为 n+n19。本研究中的材料 badila 的体细胞染色体数目为 2n=80，海南斑茅 92-77 的体细胞染色体数为 2n60，崖城 96-40 的 体细胞染色体数为 2n70 ，因此得出拔地拉海南斑茅 92-77 的后代崖城 9640 染色体配 对方式为典型的 n+n。而本文以崖城 96-40cp84-1198 杂交后代崖城 01-21 和崖城 01-36 的 体细胞进行染色体核型分析，崖城 01-21 染色体数为 2n=104，比按 n+n 理论染色体数目 2n=95 多了 9 条染色体，我们亦初步推断崖城 96-40 和 cp84-1198 向崖城 01-21 传递染色体的方式 仍为 n+n，因 bremer 对同源配对的深入研究表明，式中的 n 并不是一倍体的原来数目，常 有增减，并称这种后代为“不平衡杂种”3。如同一交配组合 ek28poj2364 产生的 poj2725， poj2875，poj2883 和 poj2878 的染色体 2n 分别为 107、110、115 和 117-121，poj2725 和 poj2878 差异 1014 条染色体之多，超过一个基因组（假定 x10）以上3。崖城 01-36 染色体数为 2n132，比按 n+n 染色体配对遗传方式 2n=95 多出 37 条染色体，比按 n+2n 染色体配对遗传方式 2n=155 少 23 条染色体, 染色体条数差异如此多的“不平衡杂种”尚未见报道，而与 2n+n 染色体配对遗传方式 2n130 基本相符，并结合崖城 01-36 高贵化的遗传进展还不如平常的按 n+n 遗传的 bc1 如崖城 01-03、崖城 01-21 等，因而初步 推断其亲本以 2n+n 的方式传递染色体给它。上述结果表明，甘蔗斑茅杂交 bc1 后代染色体 遗传的复杂性，同一组合的后代染色体差异达 28 条之多，染色体除以 n+n 的配对方式进行 遗传外，还可能存在以 2n+n 的配对方式进行遗传。甘蔗与割手密的杂交后代 f1 基本上是 以 2n+n 的配子类型遗传，bc1 也常出现以 2n+n 的配子类型，所以甘蔗斑茅杂交 bc1 后代2n+n 的配对方式进行遗传也是完全可能的。 当然，由于甘蔗染色体的异质性和多倍性，染色体数目又多，减数分裂时会出现各种不规则的分裂，给甘蔗的细胞遗传学研究带来很大难度。因此，单纯从细胞学水平的计数和核 型分析不一定都能准确阐明甘蔗斑茅远缘杂交后代染色体遗传行为的问题，借助基因组原位 杂交技术则能大大提高斑茅杂种后代染色体遗传行为研究的准确性，这有待进一步的试验。参考文献1.王鉴明.甘蔗育种新展望j.四川甘蔗,1991,(2) :2-4. 2.陈如凯,林彦铨,张木清等.现代甘蔗育种的理论与实践m.北京:中国农业出版社,2003.53-65,246-254. 3.bremer g.the cytology of sugarcanea cytological investigation of some cultivated kinds and their parentsgenvtica(the hague),1924,6:497-525. 4.何顺长.云南省甘蔗野生资源开发利用前景的探讨j.云南农业大学学报,1987,2(1)：105-111 5.沈万宽.斑茅的杂交利用价值探讨j.甘蔗(福建).2002,9. 6.杨清辉,李富生等.斑茅染色体和植物学性状观察研究j.云南农业大学学报,1997,12(4)：253-256. 7.何红.广西甘蔗种属间杂交现状及问题j.广西甘蔗,1994,(1):13-17. 8.刘少谋.几个斑茅后代作为甘蔗杂交亲本的利用效果j.甘蔗糖业,1992,(3):1-6.9.gill,b s et al,(甘海鹏译).甘蔗属间杂种的遗传转移途径j.国外农学甘蔗,1987,(2):1-7 10.廖兆周,唐明德等.甘蔗、斑茅及其杂种的过氧化物酶、同工酶j.植物学报,1988,30(2 ):214-219 11.吴能奕,戚经文.甘蔗斑茅远缘杂种的鉴别j.华南农业大学学报,1987,8(2):28-31. 12.黄东益,郑成,庄南生.甘蔗染色体组构成系统演化的研究j.热带作物学报,2000,21(1):43-51 13.郑成木.甘蔗核型及其染色体数目变化的研究j.热带作物学报,1993,14(1):47-51. 14.李懋学编著.植物染色体研究技术m.北京:东北林业大学出版社,1991.15 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