2001-2003年杭州地区婴幼儿腹泻轮状病毒VP7型别分析.pdf

书书书 论著 作者单位： 310003 杭州， 浙江大学医学院附属儿童医院消化科 20012003 年杭州地区婴幼儿腹泻 轮状病毒 vp7 型别分析 童美琴 陈黎勤 尚世强 赵正言 【摘要】 目的 研究杭州地区秋冬季婴幼儿腹泻轮状病毒 （rv） 的感染特点及 rv 分子流行病 学特点。方法 收集 20012003 年秋冬季来本院就诊拟诊为病毒性肠炎患儿的粪便共 683 份， 采用 乳胶凝集试验 （lat） 检测 a 组 rv， 阳性者再用酶联免疫吸附试验 （elisa） 分型检测 rv vp7 （g） 血 清型； 将 elisa 确定 vp7 （g） 血清型的标本进一步做逆转录-聚合酶链反应 （rt-pcr） 扩增及 rv 基因 测序， 证实其 vp7 （g） 血清型。结果 683 份标本中， rv 阳性 297 份， 检出率为 43. 5% （297/683） ； elisa 分型： vp7 （g） 血清型以 g1、 g3 型为主， 其中 g1 型占 36. 7% （109/297） 、 g3 型占 30. 9% （92/ 297） ， 其余 g2、 g4、 混合型和未分型分别占 4. 0%（12/297） 、 7. 1%（21/297） 、 11. 8%（35/297） 和 9. 4% （28/297） ；每年流行的 vp7 （g） 血清型的主流不同， 2001 年以 g1 型为主， 占 54. 9% （45/82） 、 g3 型占 14. 6% （12/82） ， 2003 年以 g3 型为主， 占 43. 2% （63/146） 、 g1 型占 29. 5% （43/146） 。rt- pcr 扩增、 基因序列测定和同源性分析证实了 elisa 分型的可信性。结论 20012003 年杭州地区 秋冬季婴幼儿腹泻 rv vp7 （g） 血清型以 g1、 g3 型为主， 且每年流行的主流血清型不同。 【关键词】 轮状病毒， 感染； 腹泻， 婴儿 analysis of vp7 serotype of rotavirus in infantile diarrhea in hangzhou area from 2001 to 2003 tong mei-qin， chen li-qin，shang shi-qiang，zhao zheng-yan.department of gastroenterology， childrens hospital affiliated to the medical college，zhejiang university，hangzhou 310003，china 【abstract】 objective to investigate molecular epidemiologic features of rotavirus（rv）infection in infantile diarrhea in hangzhou area. methods stool specimens of 683 infants with suspected acute viral enteritis in the autumn and winter of 20012003 were collected. rv （group a） was detected by using latex agglutination test（lat） . vp7 serotype（g）positive specimens were detected by using enzyme linked immunosorbent assay （elisa） and then the rna of the virus was determined with reverse transcription polymerase chain reaction（rt-pcr） .cdna of vp7 gene fragment was sequenced by automatic gene analyzor（abi3730）and compared with the rv vp7 gene sequences stored in genebank. results rv was detected in 297 of 683 （43. 5%） specimens by lat. the highest frequency of rv（group a）detected was 52. 9%（228/431）in patients aged 718 months. the prevalent serotypes were g1（36. 7%，109/297） and g3（30. 9%，92/297） ，followed by mixed type （11. 8%， 35/297） ，untyped（9. 4%， 28/297） ，g4 （7. 1%， 21/297）and g2 （4. 0%， 12/297） . the prevalent serotypes seen each year were different. g1 （54. 9%， 45/82）was the major serotype in 2001 followed by g3（14. 6%， 12/82） . in 2003，the major serotype was g3 （43. 0%， 63/146）and followed by g1 （29. 5%， 43/146） . the reliability of elisa was confirmed by rt-pcr，gene sequencing and homology analysis. conclusion the main prevalent serotypes of vp7 of rotavirus were g1 and g3. the dominant serotypes of rotavirus varied in hangzhou area from 2001 to 2003. 【key words】 rotavirus，infections； diarrhea，infanile 为了探讨杭州地区婴幼儿腹泻轮状病毒 （rv） 分子流行病学特点， 我们于 20012003 年婴幼儿秋 冬季腹泻流行季节， 对本院门诊和住院拟诊为病毒 性肠炎的 683 例 （每年约 200 例） 患儿的粪便进行 了粪便 rv 病毒检测和 vp7 型别及基因序列的研 究， 现报道如下。 对象和方法 一、 研究对象和标本 本组共 683 例， 均为腹泻 2 周内患儿， 大便为水 样、 无黏液脓血便。男性 423 例， 女性 260 例， 男: 女 为 1. 63: 1； 年龄 38 d 3 岁； 其中 6 个月 157 例、 595中华儿科杂志 2005 年 8 月第 43 卷第 8 期 chin j pediatr，august 2005，vol 43，no. 8 12 个月 281 例、 18 个月 150 例、 24 个月 61 例、 24 个月 34 例。每例均留取粪便 2 5 g 待检。 二、检测方法 所有标本均取 0. 5 g 立即用乳胶凝集试验 （lat） 检测 a 组 rv， 剩余标本 -20冻存待检； rv 阳性组用酶联免疫吸附试验 （elisa） 检测 rv vp7 （g） 血清型； 再将 elisa 确定 vp7 （g） 血清型的标 本进一步做逆转录-聚合酶链反应 （rt-pcr） 扩增及 rv 基因测序， 证实其 vp7 （g） 血清型。 1. lat： 所有标本均取0. 5 g 立即用 lat 检测 a 组 rv 1。试剂盒购自美国 microgen bioproducts 公 司。乳胶颗粒试剂由被 rv 致敏的兔抗 rv 抗体包 被， 阴性对照为兔正常免疫球蛋白。具体操作步骤 和结果判断按试剂盒说明书要求进行。 2. elisa： 经 lat 初筛 rv 阳性的标本用 elisa 作 vp7 （g） 血清型分型。本试验采用组特异单克隆 抗体 （mab） 作包被抗体。rv vp7 （g） 血清型分型 采用特异 mabs elisa， 方法详见文献 2， 3。试验中 所用试剂和标准病毒株 g1 型 （sav） 和 g3 型 （wq） 均购自中国疾病预防控制中心病毒预防控 制所， 其中 mabs 由日本 serotec 株式会社和美国 nih 公司提供。 3. rt-pcr：外引物： 5-ggctttaaaagagag- aatttccgtctgg-3 （1 28 bp） ， 5- ggtcacatc- atacaattctaatctaag-3 （1036 1062 bp） ； 内引 物： 5-caagtactcaaatcaatgatgg-3 （ 314 335 bp） ， 5-cgtttctggtgaggagttg-3（480 498 bp） ， 由上海捷倍思基因诊断技术公司合成， taq dna 聚合酶和 dntp 购自美国 promega 864-t 公司， 禽类成髓细胞瘤病毒 （ avian myeloblastosis virus， amv）逆转录酶购自美国 invitrogen 公司。具体操 作参照 taniquchi 等 4的常规方法。 4. 核苷酸序列分析： 将 rt-pcr 扩增产物送上 海博亚生物技术有限公司用 abi3730 全自动基因 分析仪 （abi 公司， 美国 ） 对 rt-pcr 扩增的 vp7 基 因片段 cdna 直接进行核苷酸序列测定。所得基因 序列 发 送 至 互 联 网 （ http： / / www. ncbi.nlm. nih. gov） 用 blast 工具进行同源性检索。 三、统计学方法 本组资料采用 x2检验， p 24 个月 2 例，检出率为 4. 7% （2/43） ， 两组检出率相 比差异有统计学意义 （ x2= 36. 44， p 0. 05） 。 表 1 不同年龄组 rv 检出率 年龄病例数rv 阳性数检出率 6 个月1576138. 9% 12 个月28115755. 9% 18 个月1507147. 3% 24 个月6169. 8% 24 个月3425. 9% 合计68329743. 5% 二、rv 血清分型 2001 年 82 份 阳 性 标 本 中 g1 型 45 份 （54. 9%） 、 g3 型 12 份 （14. 6%） ； 2002 年 69 份中 g1 型 21 份 （30. 4%） 、 g3 型 17 份 （24. 6%） ； 2003 年 146 份中 g1 型 43 份 （29. 5%） 、 g3 型 63 例 （43. 2%）（表 2） 。 表 2 20012003 年 297 份 rv 阳性标本 elisa 分型 年份g1g2g3g4混合型*未分型 2001 年452121085 2002 年214178712 2003 年4366332011 合计1091292213528 注： *其中 g1 + g3 型 14 份； g1 + g4 型 12 份； g3 + g4 型 5 份； g1 + g2 + g3 和 g1 + g3 + g4 型各 2 份 三、 基因测序结果 从 lat 及 elisa 检测 rv 阳性的标本中随机 选取 3、 45 号和 19、 55 号标本经 rt-pcr 扩增， 其扩 增产物电泳图与 rv 毒株一致 （图 1， 2） ； 扩增的 cdna 片 段 测 序 后 发 送 至 互 联 网（ http： / / www. ncbi. nlm. nih. gov） ， 用 blast 工具进行同源性 检索后证实其核苷酸序列均为 rv （a 组） vp7 基因 片段。3、 45 号标本的基因序列与基因库中的 g1 型 rv 株 mp126 有高度的同源性 （均与基因库编号 af386915 有 98% 的核苷酸序列相同） ， 19、 55 号 标本的基因序列与基因库中的 g3 型 rv 株 rota399 有高度的同源性 （分别与基因库编号 ab011973 有 100%和 97% 的核苷酸序列相同） 。提示 3、 45 和 695中华儿科杂志 2005 年 8 月第 43 卷第 8 期 chin j pediatr，august 2005，vol 43，no. 8 19、 55 号标本中分离出的 rv 分别为 g1 和 g3 型， 而 elisa 检测结果 3、 45 和 19、 55 号标本 rv 也分 别是 g1 和 g3 型， 两者结果一致。 m： marker， 1： g1 型毒株 san， 2、 3： 3、 45 号标本 图 1 轮状病毒 vp7g1 型 rt-pcr 扩增产物琼 脂糖凝胶电泳图 m： marker， 1： g3 型毒株 wq， 2、 3： 19、 55 号标本 图 2 轮状病毒 vp7g3 型 rt-pcr 扩增产物琼 脂糖凝胶电泳图 讨论 a 组 rv 是婴幼儿腹泻最主要的病毒病原 5， 因腹泻住院的儿童 20% 70% 是由 rv 感染引起 的 6。由于 rv 的型别繁多、 易变、 交叉保护性差等 特点使对 rv 感染的预防困难重重， 因此做好预防 rv 感染还需各地区积累研究资料。为了解杭州地 区婴幼儿 rv 感染的特点， 本研究连续3 年在 rv 流 行季节收集了婴幼儿腹泻患儿的粪便标本， 对 rv 分子流行病学特点进行了探讨。 一、lat、 elisa 分型、 rt-pcr 扩增和基因测 序在 rv 检测中的应用比较 lat 和 elisa 分型均属免疫学方法， 两种方法 检出率相关性好 1。从理论上说， elisa 的敏感性 和特异性均很高 7。但在实际操作中， 由于粪便的 标本成分复杂， 有些成分可能干扰抗原和抗体的特 异性结合从而导致结果判断错误或在分型实验中无 法分型。本组试验中有 9. 4% （28/297） 未能分型， 可能为标本干扰因素， 也可能为 g1 g4 型外的其 他 rv 少见血清型。把 elisa 和 rt-pcr 联合应 用， 可以提高其敏感性。经 rt-pcr 扩增产物进行 核苷酸序列测定和同源性分析确定 rv 血清型是 rv 分子流行病学研究准确、 有效的手段。有研究 报道， 对 vp7 624 663 核苷酸序列的分析， 可以预 测 rv 的血清型 8。和已知型别的标准株相比较， 如果此区的核苷酸序列同源性大于 85%， 则可判断 该病毒与标准株为同一型别。本组试验的 4 个标本 经核苷酸序列同源性分析， 其同源性均大于 95%， 分别被确定为 rv g1 和 g3 血清型， 与 elisa 的分 型结果一致， 说明 elisa 分型对 rv 血清型鉴定是 可行的。 二、 rv 的基因编码及分型 rv 结构蛋白 vp4 （由第 4 基因编码） 、 vp7 （可 由第 7、 8 或 9 基因编码） 是刺激产生保护性抗体的 中和抗原 6。根据 vp7 和 vp4 特异性不同将 rv 分为 g、 p 两个血清型， 至今已发现 14 个 vp7 血清 型 （g1 g14） ， 其中 g1 g4、 g8 g10、 g12 可感染 人类， 最常见的是 g1 g4 型。vp7 的抗原特异性 与编码基因的核苷酸序列有关， vp7 基因有 9 个独 立的可变区， 这些可变区在同一血清型中高度保守， 而不同血清型间高度变异。如果可变区的核苷酸序 列的同源性大于 85%， 则可判断为同一血清型 9。 本组 2 个标本分别与基因库中 g1 型 126 株 rv 同 源性达 98%和 100%， 可判断为 g1 型； 另 2 个标本 与基因库中 g3 型 399 株 rv 同源性达 98% 和 100%， 提示为 g3 型。与其 elisa 分型结果一致。 vp4 血清型分型较复杂， 目前至少已有 20 多种 p 基 因型及 11 个 p 血清型， 基因型与血清型密切相关。 引起婴幼儿腹泻的 p 型 rv 血清型多属 p1a 或 p1b， 基因型则多为 p 8 、 p 4 。g、 p 最为普遍的 组合是 g1p1a、 g2p1b、 g3p1a 和 g4p1a。不同国 家、 地区， 不同年份流行的 rv 的 g、 p 型别及其组合 可发生变化， 形成 rv 的复杂、 多变的分子流行病学 特征 7。 三、 rv 肠炎发病概况 683 份粪便标本， 用 lat 检出 rv 297 例， 检出 率 43. 5%。检出率与性别无关， 而与年龄相关性 大， 主要集中在 7 18 个月龄，检出率为 52. 9% （228/431） 。 四、 rv 血清型的转变 基因测序结果证实了 elisa 的分型。从这 3 年的 rv vp7 （g） 血清型检测的结果中可以看到， 本 地区秋冬季婴幼儿腹泻 rv vp7 （g） 血清型以 g1 型 36. 7% （109/297） 、 g3 型 30. 9% （92/297） 为主， 且 每年流行的主流血清型不同。 国内外学者报道 rv 流行的 g 血清型有转变的 795中华儿科杂志 2005 年 8 月第 43 卷第 8 期 chin j pediatr，august 2005，vol 43，no. 8 趋势 10。rv 流行的主要血清型的多变， 随地区和 时间的不同而有较大的变异， 世界各地均在研制预 防性疫苗， 经美国几个大的研究机构证实四价重配 株疫苗 （rrv-tv） ， 可对所有 rv 疾病提供 50% 的 保护力， 以及对严重感染提供约 75% 的保护力 11。 本研究结果提示， 20012003 年杭州地区 rv vp7 血清型以 g1、 g3 型为主， 且每年流行的主流血清型 不同。为更好的防治婴幼儿 rv 肠炎， 建议国内在 研制预防疫苗时也应考虑混合型多价疫苗为好。 参考文献 1童美琴， 洪芳. 轮状病毒肠炎粪便的病原快速检测. 浙江预防医 学， 2000， 12： 62. 2方肇寅， 郑素泉， 史之册， 等. 应用 elisa 检测新生儿轮状病毒 感染. 中华实验和临床病毒学杂志， 1988， 2： 14-16. 3方肇寅，董红， 温乐英， 等. 婴幼儿 a 组轮状病毒的单克隆抗体 elisa 分型. 中华实验和临床病毒学杂志， 1988， 2： 9-12. 4taniquchi k，urasawa t，morita y，et al.direct serotyping of human rotavirus in stool using serotype 1-，2-，3-，and 4-specific monoclonal antibodies to vp7. j infect dis， 1987， 155： 1159-1166. 5童美琴， 陈洁， 俞惠民， 等. 杭州地区儿童病毒性肠炎病原学分 析. 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