SNT1750-2006动物源性食品中抗生素类药物残留检测方法微生物抑制法.pdf

rS“ 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 S N / T 1 7 5 0 -2 0 0 6 动物源性食品中抗生素类药物残留 检测方法微生物抑制法 De t e r mi n a t i o n o f a n t i b i o t i c s r e s i d u e s i n a n i ma l d e r i v e d f o o d - MI A me t h o d 2 0 0 6 - 0 1 - 2 6发布2 0 0 6 - 0 8 - 2 6实施 中华人民共和匡 国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 辰 S N / T 1 7 5 0 -2 0 0 6 前 . . J - 曰 本标准参照了 日 本厚生省生活卫生局 1 9 9 6 年版的 食品卫生检查指针 第 6 章“ 动物用医药品、 饲 料添加物“ 。 本标准的附录 A是规范性附录， 附录 B是资料性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位: 中华人民共和国福建出人境检验检疫局、 中华人民共和国天津出人境检验检 疫局。 本标准主要起草人: 黄晓蓉、 李寿裕、 郑晶、 杨方、 陈彬、 罗茂凰。 本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准 。 S N / T 1 7 5 0 -2 0 0 6 动物源性食品中抗生素类药物残留 检测方法微生物抑制法 范 围 本标准规定了动物源性食品中产内酞胺类、 四环素类、 大环内醋类和氨基糖昔类药物残留检测的试 样制备、 保存和微生物抑制检测方法。 本标准适用于肉类、 蛋、 鱼和虾中的抗生素残留筛选检测， 阳性结果须用其他方法进行确证。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件， 其随后所有 的修改单( 不包括勘误的内容) 或修订版均不适用于本标准， 然而， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日 期的引用文件， 其最新版本适用于本标准。 G B / T 6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法 3 试样制备和保存 3 . 1 试样制备 肉、 鱼和虾: 从原始样品中取出部分有代表性样品， 将可食部分放人高速组织捣碎机均质， 充分混 匀， 用四分法缩分不少于5 0 0 g 试样。装人清洁容器内， 并标明标记。 蛋: 从原始样品中， 随机分出一半( 不少于 5 0 0 g ) ， 鲜蛋需去壳。将蛋黄和蛋白于混合器中充分混 匀， 装人清洁容器内， 作为试样 ， 并标 明标记。 制样操作过程 中必须防止样品受到污染或发生残留物含量的变化 。 3 . 2 试样保存 肉、 鱼、 虾和蛋: 试样于一1 8 以下保存。 4 测定方 法 4 . 1 方法提要 试样经缓冲液提取、 温育和离心后， 取上清液进行测定。利用抗生素对敏感菌的抑制作用来判别试 样中是否含有抗生素。 4 . 2 设备和材料 4 . 2 . 1 恒温箱: 3 0 士1 r -， 水平隔层。 4 . 2 . 2 离心机。 4 . 2 . 3 高速组织捣碎机。 4 . 2 . 4 恒温水浴锅。 4 . 2 . 5 涡旋振荡器。 4 . 2 . 6 显微镜 : l o x一l o o x。 4 . 2 . 7 游标卡尺: 测量范围0 m m-2 0 0 mm, 精度0 . 0 2 m m或抑制圈测量仪。 4 . 2 . 8 灭菌平皿: 直径 9 0 mm， 底部平整的玻璃或一次性塑料灭菌平皿。 4 . 2 . 9 圆形滤纸片 : 直径 1 0 m m， 厚 1 . 1 m m。日 本 T o y o R o s h i K a i s h a , L t d . 产品， 或相当者 。 4 . 2 . 1 0 克氏瓶 。 S N / T 1 7 5 0 -2 0 0 6 4 . 2 . 1 1 可调移液器: 1 0 p .L -1 0 0 ju L , 1 0 0 p L -1 0 0 0 p .L . 4 . 3 菌种和培养基 4 . 3 . 1 菌种 4 . 3 . 1 . 1 藤黄微球菌 Mi c r o c o c c u s l u t e u s A T C C 9 3 4 1 , 4 . 3 . 1 . 2 枯草芽胞杆菌B a c i l l u s s u b t i l i s A T C C 6 6 3 3 . 4 . 3 . 1 . 3 蜡样芽胞杆菌覃状变种B a c i l l u s c e r e u s v a r . m y c o i d e s A T C C 1 1 7 7 8 . 4 . 3 . 2 培养基 4 . 3 . 2 . 1 保存及传代用细菌培养基: 见第A . 1 章。 4 . 3 . 2 . 2 增菌用液体培养基: 见第 A . 2 章。 4 . 3 . 2 . 3 增菌用固体培养基: 见第 A . 3 章。 4 . 3 . 2 . 4 检定用培养基: 抗生素培养基 5号( A M5 ) 见第 A. 4章， 抗生素培养基 8号( A M8 ) 见 第 A . 5 章。 4 . 4 试荆 本方法所用化学试剂为分析纯， 试验用水为蒸馏水或去离子水， 试验用水应符合 G B / T 6 6 8 2的 规定。 4 . 4 . 1 缓冲液 4 . 4 . 1 . 1 柠檬酸一 丙酮缓冲液 a ) 0 . 2 m o l / L柠檬酸溶液: 称取柠檬酸( qH 8 0 , ) 4 . 2 g ， 用无菌蒸馏水溶解并定容至1 0 0 m L . b ) 0 . 5 m o l / L氢氧化钾溶液: 称取氮载化钾( K O H) 2 . 8 g ， 用无菌蒸馏水溶解并定容至 1 0 0 mL . 。 ) 混合液: 。 . 2 mo l / L柠檬酸溶液和。 . 5 m o l / L红氧化钾溶液等量混合。 d ) 柠檬酸一 丙酮缓冲液: 按混合液+丙酮+蒸馏水=3 5 +3 5 +3 0比例制备。 4 . 4 . 1 . 2 p H 4 . 5 磷酸盐缓冲液: 称取1 3 . 6 g 磷酸二级钾( KH , P O , ) 用蒸馏水溶解并定容至1 0 0 0 mL , 1 2 1 高压灭菌1 5 m i n . 4 . 4 . 1 . 3 p H6 . 0 磷酸盐缓冲液: 称取8 . 0 g 磷酸二氮钾( KH , P 0 , ) 及2 . 0 g磷酸氢二钾( K , H P q) ， 用 蒸馏水溶解并定容至 1 0 0 0 mL , 1 2 1 高压灭菌1 5 mi n , 4 . 4 . 1 . 4 p H8 . 0磷酸盐缓冲液: 称取 0 . 5 2 3 g碑酸二氮钾( KH , P O , ) 及 1 6 . 7 3 g磷酸氢二钾 ( K , H P O , ) ， 用蒸馏水溶解并定容至1 0 0 0 m L , 1 2 1 0C高压灭菌1 5 mi n , 4 . 4 . 2 抗生素标准溶液 4 . 4 . 2 . 1 氨节西林标准储备液: 称取一定量的氛节西林标准品， 用灭菌去离子水溶解并定容至 1 0 0 0 j L g / m L ， 置2 一8 冰箱保存， 贮存期2 d , 4 . 4 . 2 . 2 氨节西林标准工作液: 吸取一定量的氨节西林标准储备液， 用 p H6 . 0磷酸盐缓冲液 ( 4 . 4 . 1 . 3 ) 稀释成0 . 0 2 5 K g / m L的标准工作液， 须当日 配制使用。 4 . 4 . 2 . 3 卡那霉素标准储备液: 称取一定量的卡那霉素标准品， 用灭菌去离子水溶解并定容至 1 0 0 0 jA g / m L ， 置2 一8 冰箱保存， 贮存期1 个月. 4 . 4 . 2 . 4 卡那霉素标准工作液: 吸取一定量的卡那霉素标准储备液， 用 p H 8 . 。磷酸盐缓冲液 ( 4 . 4 . 1 . 4 ) 稀释成。 . 5 b eg / m L的标准工作液， 须当日 配制使用。 4 . 4 . 2 . 5土霉 素 标 准储 备 液 : 称 取 一定 量 的土 霉 素标 准 品， 用 0 . 1 mo l / L盐 酸 溶 解 并定 容 至 1 0 0 0 j e g / mL ， 置2 0C - 8 冰箱保存， 贮存期7 d . 4 . 4 . 2 . 6 土霉素标准工作液: 吸取一定量的土霉素标准储备液， 用p H4 . 5 磷酸盐缓冲液( 4 . 4 . 1 . 2 ) 稀 释成0 . 1 p g / mL的标准工作液， 须当日配制使用。 4 . 4 . 2 . 7 红霉素标准储备液: 称取一定量的红霉素标准品， 用少量 3 0 %甲醇溶解， 再用 p H8 . 0 ( 4 . 4 . 1 . 4 ) 磷酸盐缓冲液定容至1 0 0 0 p .g / m L ， 置2 0C -8 冰箱保存， 贮存期 7 d , 4 . 4 . 2 . 8 红霉素标准工作液: 吸取一定量的红霉素标准储备液， 用p H8 . 0 磷酸盐缓冲液( 4 . 4 . 1 . 4 ) 稀 2 S N / T 1 7 5 0 -2 0 0 6 释成0 . 0 5 j i g / m L的标准工作液， 须当日 配制使用。 4 . 5 测定步骤 4 . 5 . 1 样液提取 称取1 0 g 均质好的试样于5 0 m L离心管中， 加人柠檬酸一 丙酮缓冲液2 0 m L ， 用涡旋振荡器充分振 荡3 min ， 于7 0 C-7 5 水浴保温2 0 m i n 后， 2 0 0 0 g 离心 1 5 min取上清液作为样液。 4 . 5 . 2 菌悬液的制备 4 . 5 . 2 . 1 藤黄微球菌A T C C 9 3 4 1 菌悬液: 将复活的菌种( 参见附录B ) 接种于盛有增菌用固体培养基 的克氏瓶中， 3 0 培养1 8 h - v 2 4h 后， 用灭菌生理盐水洗下菌苔， 制成菌悬液。置2 C - r 8 冰箱保存， 贮存期1 5 d , 4 . 5 . 2 . 2 枯草芽胞杆菌A T C C 6 6 3 3 和蜡样芽胞杆菌A T C C 1 1 7 7 8 菌悬液: 将复活的菌种分别接种于盛 有增菌用固体培养基的克氏瓶中， 3 0 培养7d ， 镜检芽胞数达8 0 %以上( 如果达不到， 可再培养数日， 如培养1 0 d 以上， 芽胞数仍达不到要求， 菌种可能变异， 不可使用) ， 用灭菌生理盐水洗下菌苔， 使其悬 浮于生理盐水中， “水浴加热3 0 mi n ， 经2 0 0 0 g 离心2 0 mi n ， 弃去上清液， 如此重复洗涤芽胞两次。 然后用适量灭菌生理盐水制成菌悬液。置2 C -8 冰箱保存， 贮存期3 0 d , 4 . 5 . 3 检定用平板的制备 4 . 5 . 3 . 1 藤黄微球菌 A T C C 9 3 4 1 平板 每批菌悬液按下法测定其最适宜用量: 把不同浓度藤黄微球菌A T C C 9 3 4 1 菌悬液加人A M5 培养 基中， 3 0 培养1 8 h后， 使0 . 0 2 5 j .g / m L氨节西林标准工作液可产生 1 4 m m士1 m m清晰、 完整的抑 菌圈。 无菌吸取 1 m L适宜浓度的菌悬液加到 1 0 0 mL溶化后冷却至 5 0 左右 的灭菌 AM5中充分混匀 后， 取8 mL注人灭菌平皿内， 保持水平使其凝固。制备好的平板置 2 C -8 冰箱保存， 贮存期2 d - 3 d , 4 . 5 . 3 . 2 枯草芽胞杆菌 A T C C 6 6 3 3 平板 每批菌悬液按下法测定其最适宜用量: 把不同浓度枯草芽胞杆菌A T C C 6 6 3 3 菌悬液加人A M5 培 养基中， 3 0 培养1 8 h 后， 使0 . 5 p g / m L卡那霉素标准工作液可产生 1 4 m m士1 m m清晰、 完整的抑 菌圈。 无菌吸取 1 m L适宜浓度的菌悬液加到 1 0 0 mL溶化后冷却至 5 0 左右的灭菌 A M5中充分混匀 后， 取8 mL注人灭菌平皿内， 保持水平使其凝固。制备好的平板置 2 C-8 冰箱保存， 贮存期 2 d - 3 d , 4 . 5 . 3 . 3 蜡样芽胞杆菌 A T M 1 7 7 8 平板 每批菌悬液按下法测定其最适宜用量: 把不同浓度蜡样芽胞杆菌A T C C 1 1 7 7 8 菌悬液加人A M8 培 养基中， 3 0 培养 1 8 h后， 使。 . 1 p g / m L土霉素标准工作液可产生 1 4 mm士1 mm清晰、 完整的抑 菌圈。 无菌吸取 1 m L适宜浓度的菌悬液加到 1 0 0 m L溶化后冷却至 5 0 左右的灭菌 A M8中充分混匀 后， 取8 mL注人灭菌平皿内， 保持水平使其凝固。所用平板须当天制备。 4 . 5 . 4 测 定 取制备好的三种检定用平板各两个， 在平板底部做好标记， 把滤纸片适当间隔置于平板上， 每个平 板最多不超过6 个， 用镊子轻压使其固定， 在每片滤纸上滴加 1 0 0 Ii L样液或标准工作液， 冷藏放置 3 0 mi n 后， 3 0 培养 1 8 h后观察， 用游标卡尺测量抑菌圈直径大小。每份样品做两个平板上的平行 试验 。 4 . 6 检测结果的判定和报告 如样液在三种平板上均无抑菌圈， 标准工作液的抑菌圈达到 1 4 mm士1 m m， 即报告“ 阴性” 。 如样液在三种任一平板上呈现抑菌圈 ， 抑菌圈直径在 1 2 m m 以上， 即报告“ 初筛阳性” 。 S N / T 1 7 5 0 -2 0 0 6 如样液在三种任一平板上呈现抑菌圈， 抑菌圈直径小于1 2 m m， 大于1 0 m m视为可疑， 必要时重新 测试后判定， 也可以根据表 1 中试验菌的敏感性初步判定抗生素种类后， 采用其他方法进行确认。 表 1 试验菌 的敏感性 试验平板 可检出抗生索种类 ATC C6 6 3 3ATCC9 3 4 1 ATC C1 1 7 7 8 + 或 一 + 十 + 大环内醋类 或 p 一 内酞胺类 + 或 一 + + 四环素类 十 十 或 + 十 氨基搪昔类 注 i : “ +” 为阳性， 抑菌圈直径 1 2 m m -1 4 m m; “ +” 为强阳性 . 抑蔺圈直径)1 4 m m产一” 为阴性， 无抑菌圈. 注 2 : 除表 1 所列的情况外， 如果一个试样同时在多个平板上呈阳性( +) 或者强阳性( +) ， 则表示可能同时含 有多类抗生家残留。例如 : 在 A T C C 1 1 7 7 8 平板上为+， 同时在 A T C C 9 3 4 1 平板上为+或十， 则可能同 时含有四 环素和大环内 醋类或户内酸 决类残宙。 细果在A T C C 6 6 3 3 上同时为+， 则可能同时含有上述 3 - 4 类抗生素残留。 5 检测限 本方法的检鸿限为: 月 一 内酞胺类: 0 . 0 5 mg / k g ; 四环素类: 0 . 1 mg / k g ; 大环内酷类; 0 . 0 5 mg / k g ; 氨基糖昔类: 。 . 5 mg / k g . S N / T 1 7 5 0 -2 0 0 6 附录A ( 规范性附录) 培养基 A . 1 保存及传代用细菌培养基 . 1 成分 蛋白陈1 0 . 0 g 牛肉膏3 . 0 g 氯化钠5 . 0 g 琼脂1 5 . 0 g 蒸馏水1 0 0 0 m L p H7 . 3 士0 . 1 . 2 制 法 将各成分加热溶解， 分装试管， 1 2 1 高压灭菌1 5 m i n ， 制成斜面。 注: 制成半固体时， 琼脂量为 。 . 5 %. A . 2 增菌用液体培养基 A . 2 . 1 成分 蛋白陈1 0 . 0 g 牛肉膏3 . 0 g 氯化钠5 . 0 g 蒸馏水1 0 0 0 m L p H7 . 3 士0 . 1 A . 2 . 2 制法 将各成分加热溶解， 分装每管5 mL , 1 2 1 高压灭菌1 5 min , A . 3 增菌用固体培养基 . 1 成 分 牛肉膏L5g 酵母膏3 . 0 g 胰酪蛋白4 . 0 g 蛋白陈6 . 0 g 葡萄 糖1 . 0 g 琼脂1 5 . 0 g 蒸馏水1 0 0 0 m L p H6 . 5 5 士0 . 0 5 . 2 制法 将各成分加热溶解， 分装3 0 0 m L于克氏瓶内， 1 2 1 高压灭菌1 5 m i n . S N / T 1 7 5 0 -2 0 0 6 A . 4 检定用培养基 : 抗生素培养基 5号( A M5 ) A . 4 . 1 成分 牛肉膏1 . 5 g 酵母膏3 . 0 g 蛋白 陈6 . 0 g 琼脂1 5 . 0 g 蒸馏水1 0 0 0 mL p H 7 . 9 士0 . 1 A . 4 . 2 制法 将各成分加热溶解， 分装每瓶1 0 0 mL , 1 2 1 高压灭菌1 5 m i n , A . 5 检定用培养基 : 抗生素培养基 8 号( A M8 ) A . 5 . 1 成分 牛肉 膏1 . 5 g 酵母膏39 蛋白脉6g 琼脂1 5 g 蒸馏水1 0 0 0 mL p H6 . 8 5 士0 . 0 5 A . 5 . 2 制法 将各成分加热溶解， 分装每瓶 1 0 0 m L , 1 2 1 高压灭菌1 5 m i n . S N / T 1 7 5 0 - 2 0 0 6 附录B ( 资料性附录) 菌种的保存 B . 1 冷藏保存法 将藤黄微球菌A T C C 9 3 4 1 、 枯草芽胞杆菌A T C C 6 6 3 3 、 蜡样芽胞杆菌A T C C 1 1 7 7 8 分别接种于传代 用细菌培养基斜面经 3 0 培养 1 8 h后 ， 用灭菌橡皮 塞密封冷藏保存。每 隔 1 个月至 1 . 5 个月传代 一次。 B . 2 冷冻保存法 将藤黄微球菌A T C C 9 3 4 1 、 枯草芽胞杆菌A T C C 6 6 3 3 、 蜡样芽胞杆菌A T C C 1 1 7 7 8 分别接种于传代 用细菌培养基斜面经3 0 培养 1 8h 后， 分别接种在含1 0 0 o -2 0 肠脱脂乳的普通营养肉汤中， 用灭菌橡 皮塞密封后冷冻保存。也可以使用含有甘油的营养肉汤进行冷冻保存， -7 0 保存时， 接种于含有 1 0 0 0 -1 6 %甘油的普通营养肉汤; -2 0 保存时， 接种于含有4 0 %甘油的普通营养肉汤。每隔 6 个月 传代一次。 B . 3 菌种的复活 在制备菌悬液前， 先将保存的菌种接种于增菌用液体培养基中， 3 0 培养1 8h 后使用。 B . 4 菌种的理化性状测定 定期对菌种进行理化性状测试 ， 以确定菌种没有受到污染或变异 。对性状改变的菌种 ， 需购置新的 A T C C菌种。测试的基本方法如下: 将藤黄微球菌A T C C 9 3 4 1 接种到传代培养基上， 3 5 过夜培养后 菌落为黄色。枯草芽胞杆菌A T C C 6 6 3 3 、 蜡样芽胞杆菌A T C C 1 1 7 7 8 接种到血平板上， 3 5 过夜培养后 菌落呈浅灰色， 并有a 溶血。将平板培养物革兰氏染色镜及分别接种生化反应管， 鉴定结果见表B . 1 , 表 B . 1 菌种生化反应 菌种 革兰氏染色镜检 葡萄搪乳糖 甘露醇过氧化氢酶 ATCC9 3 4 1 G + ， 球菌+ ATCC6 6 3 3 G + ， 杆菌， 有芽胞 +十+ ATCC1 1 7 7 8 G + ， 杆菌， 有芽胞 十 + 注: “ +” 表示阳性; “ 一” 表示阴性。 S N / T 1 7 5 0 - 2 0 0 6 F o r e wo r d T h i s s t a n d a r d is s e t b y r e f e r e n c e t o , s t u d y in g o n , imp r o v in g a n d v a li d a t in g t h e m e t h o d s p e c if ie d in “ V e t e r in a ry M e d ic i n e s a n d F e e d s t u f f A d d it iv e “， C h a p t e r 6 , “ G u id e l in e f o r F o o d H y g ie n e I n s p e c t io n 1 9 9 6 “ i s s u e d b y L i f e H e a l t h B u r e a u ， Mi n i s t ry o f H e a l t h , L a b o r a n d We lf a r e , J a p a n . An n e x A o f t h i s s t a n d a r d i s n or ma t i v e . An n e x B o f t h i s s t a n d a r d i s i n f or ma t i v e . T h is s t a n d a r d i s p r o p o s e d b y a n d is u n d e r t h e j u r is d ic t io n o f t h e C e r t if ic a t io n a n d A c c r e d it a t i o n A d - min is t r a t io n o f t h e P e o p le s R e p u b l ic o f C h i n a . T h is s t a n d a r d is d r a f t e d b y F u j ia n E x i t - E n t ry In s p e c t io n a n d Q u a r a n t in e B u r e a u a n d T ia n j i n E x i t - E n t r y I n s p e c t io n a n d Q u a r a n t i n e B u r e a u o f t h e P e o p le s R e p u b li c o f C h i n a . M a i n D r a f t e r o f t h i s s t a n d a r d a r e H u a n g X ia o r o n g , L i S h o u s o n g , Z h e n g J in g , Y a n g F a n g , C h e n B in a n d L u o M a o h u a n g . S N / T 1 7 5 0 -2 0 0 6 Me t h o d o f t h e d e t e r mi n a t i o n o f An t i b i o t i c s r e s i d u e s i n a n i ma l d e r i v e d f o o d一 MI A me t h o d 1 S c o p e T h e s t a n d a r d s p e c i f ie s t h e s a mp le p r e p a r a t io n , p r e s e r v a t io n a n d mic r o b i a l in h i b it io n a s s a y me t h o d f o r d e t e c t i o n o f a n t i b i o t i c r e s i d u e s i n a n i ma l d e r i v e d f o o d s . T h is me t h o d i s a p p l ic a b le t o t h e s c r e e n i n g i n s p e c t io n o f a n t ib io t i c r e s id u e s i n me a t , e g g ， f is h a n d s h r imp . A n y p o s it iv e r e s u lt s h o u ld b e c o n f i r m e d b y o t h e r me t h o d . 2 N o r ma t i v e R e f e r e n c e T h e f o llo wi n g n o r ma t iv e d o c u m e n t s c o n t a in p r o v is io n s wh ic h , t h r o u g h r e f e r e n c e in t h is t e x t , c o n - s t i t u t e p r o v is io n s o f t h is s t a n d a r d . F o r d a t e d r e f e r e n c e , s u b s e q u e n t a m e n d me n t s t o ( e x c lu d in g e d i- t in g c o r r e c t io n s ) ， o r r e v is io n s o f , a n y o f t h e s e p u b li c a t io n s d o n o t a p p ly . H o we v e r , p a r t ie s t o a g r e e - m e n t s b a s e d o n t h is s t a n d a r d a r e e n c o u r a g e d t o i n v e s t ig a t e t h e p o s s i b il it y o f a p p ly i n g t h e m o s t r e - c e n t e d i t i o n s o f t h e s t a n d a r d s i n d i c a t e d b e l o w. F o r u n d a t e d r e f e r e n c e s , t h e l a t e s t e d i t i o n o f t h e n o r ma t i v e d o c u m e n t r e f e r r e d t o a p p l ie s . G B / T 6 6 8 2 S p e c if i c a t io n s a n d T e s t M e t h o d o f Wa t e r U s e d in A s s a y L a b o r a t o r y 3 S a m p le P r e p a r a t io n a n d S t o r a g e 3 . 1 S a mp l e P r e p a r a t i o n M e a t , f i s h a n d s h r imp : T a k e a r e p r e s e n t a t iv e p a r t f r o m t h e o r ig i n a l s a mp le , P la c e t h e e d ib le p o rt io n in h ig h - s p e e d t i s s u e b le n d e r t o h o m o g e n iz e a n d b l e n d t h e s a mp l e t h o r o u g h ly . R e d u c e s iz e o f t h e s a m- p ie t o n o t le s s t h a n 5 0 0 g wit h q u a r t e r d iv id in g m e t h o d . P la c e t h e r e d u c e d s a mp le in t o a c l e a n c o n - t a i n e r a n d ma r k t h e c o n t a i n e r . E g g : R a n d o mly t a k e o n e h a lf ( a t le a s t 5 0 0 g)f r o m t h e o r ig i n a l s a m p le . R e m o v in g e g g s h e ll f o r f r e s h e g g s . B le n d e g g y o lk a n d w h it e t h o r o u g h ly in a b le n d e r a n d p la c e t h e mix t u r e i n a c l e a n . c o n t a i n e r a s t e s t s a mp l e . M a r k t h e c o n t a i n e r . Wh e n p r e p a r i n g s a mp le s , m e a s u r e s s h o u ld b e t a k e n t o p r e v e n t s a m p le f r o m b e i n g c o n t a mi n a t e d o r c o n t e n t o f r e s i d u e b e i n g c h a n g e d . 9 S N / T 1 7 5 0 -2 0 0 6 3 . 2 S a mp le P r e s e rva t io n M e a t , f is h ， s h r imp o r e g g : s t o r e d a t一1 8o r b e lo w . 4Me t h o d 4 . 1 B r i e f I n t r o d u c t i o n T e s t s a m p le i s d i s t i lle d wit h b u f f e r s o lu t io n ，in c u b a t e d a n d c e n t r if u g e d . T a k e s u p e r n a t a n t f o r t e s t . U t i l iz e t h e in h i b i t in g e f f e c t o f a n t ib i o t ic s o n s e n s i t iv e b a c t e r i a t o d e t e r mi n e if t h e r e a r e a n t ib io t i c s i n t h e t e s t s a mp l e . 4 . 2 E q u i p me n t s a n d M a t e r ia ls 4 . 2 . 1 I n c u b a t o r s e t a t 3 0 土1， t h e i n t e r la y e r s s h o u ld b e h o r iz o n t a l. 4 . 2 . 2 C e n t r if u g e . 4 . 2 . 3 H ig h - s p e e d t is s u e b le n d e r . 4 . 2 . 4 W a t e r b a t h . 4 . 2 . 5 V o r t e x mi x e r . 4 . 2 . 6 M i c r o s c o p e , 1 0 x 1 0 0 x r a n g e . 4 . 2 . 7 V e r n i e r c a li p e r , 0 m m-2 0 0 m m r a n g e , wit h a p r e c is i o n o f 0 . 0 2 mm; o r in h i b it i n g c i r c le me - t e r . 4 . 2 . 8 S t e r i l iz e d P e t r i d is h e s : 9 0 mm d ia m e t e r , g la s s o r p l a s t ic wi t h f la t a n d s mo o t h b o t t o m . 4 . 2 . 9 F i lt e r p a p e r d is k , 1 0 m m d ia m e t e r , 1 mm t h ic k n e s s . P r o d u c t o f T o y o R o s h i K a is h a L t d , J a p a n o r e q u iv a le n t . 4 . 2 . 1 0 K o l l e f l a s k . 4 . 2 . 1 1 F in n p e p e t t e : 1 0 I L L - 1 0 0 p l- , 1 0 0 p L L - 1 0 0 0 K L . 1 0 S N / T 1 7 5 0 -2 0 0 6 4 . 3 R e a g e n t s a n d S u p p li e s 4 . 3 . 1 B a c t e r i a 4 . 3 . 1 . 1 Mi c r o c o c c u s l u t e u s AT C C 9 3 4 1 . 4 . 3 . 1 . 2 B a c i l l u s s u b t i l i s AT C C 6 6 3 3 . 4 . 3 . 1 . 3 B a c il lu s c e r e u s V a r . my c o id e s A T C C 1 1 7 7 8 . 4 . 3 . 2 Me di a 4 . 3 . 2 . 1 Me d ia f o r p r e s e r v a t i o n a n d t r a n s p o r t a t io n o f b a c t e r ia : R e f e r t o A n n e x A . 1 . 4 . 3 . 2 . 2 L iq u id M e d ia f o r r e p r o d u c t io n o f b a c t e r ia : R e f e r t o A n n e x A . 2 . 4 . 3 . 2 . 3 S o li d M e d ia f o r r e p r o d u c t io n o f b a c t e r ia : R e f e r t o A n n e x A . 3 . 4 . 3 . 2 . 4 M e d ia f o r b io a s s a y : R e f e r t o A n n e x A . 4 a n d A n n e x A . 5 . R e 叩a n t s c h e mic a l r e a g e n t s u s e d i n t h i s m e t h o d a r e o f a n a ly t ic a l ly p u r e . T e s t Wa t e r s h o u ld b e d is t il le d w a - 4l 4.A t e r o r d e io n i z e d w a t e r i n c o n f o r mi t y wi t h G B / T 6 6 8 2 . 4 . 4 . 1 B u ffe r S o l u t i o n s 4 . 4 . 1 . 1 C i t r i c a c i d - Ac e t o n e b u ff e r s o l u t i o n a ) b ) c ) d ) 0 . 2 m o l / L c i t r ic a c id s o lu t io n : we ig h o u t 4 . 2 g c it r ic a c id(qH B 认) , d is s o lv e i n a n d b r in g t h e v o l u me o f t h e s o l u t i o n t o 1 0 0 mL wi t h d i s t i l l e d wa t e r . 0 . 5 m o l/ L p o t a s s iu m h y d r o x id e s o lu t io n : w e ig h o u t 2 . 8 g p o t a s s i u m h y d r o x id e( K O H ) ， d is - s o lv e i n a n d b r i n g t h e v o lu me o f t h e s o lu t io n t o 1 0 0 mL wi t h d i s t i lle d wa t e r . Mix e d l iq u o r : mi x 0 . 2 mo l/ L c i t r ic a c i d s o lu t io n wi t h 0 . 5 m o l/ L p o t a s s i u m h y d r o x id e s o l u t i o n in e q u a l a mo u n t s . C it r ic a c id - A c e t o n e b u f f e r s o lu t io n : Mix e d l iq u o r +a c e t o n e +d is t i l le d w a t e r in a r a t io o f 3 5 + 3 5 +3 0. 4 . 4 . 1 . 2 p H 4 . 5 p h o s p h a t e b u f f e r : w e ig h o u t 1 3 . 6 g p o t a s s i u m d i h y d r o g e n p h o s p h a t e ( K H , P 0 4 ) ， d is s o lv e i n a n d b r i n g t h e v o lu m e o f t h e s o lu t io n t o 1 0 0 0 mL wi t h d is t i l le d w a t e r . A u t o c la v e a t 1 2 1 f o r 1 5 mi n . 4 . 4 . 1 . 3 p H 6 . 0 p h o s p h a t e b u f f e r : we ig h o u t 8 . 0 g p o t a s s iu m d i h y d r o g e n p h o s p h a t e ( K H 2 P O O a n d 11 S N / T 1 7 5 0 -2 0 0 6 2 . 0 g d i p o t a s s iu m h y d r o g e n p h o s p h a t e ( K Z H P 0 4 )， d is s o lv e i n a n d b r i n g t h e v o lu m e o f t h e s o lu t io n t o 1 0 0 mL wi t h d i s t i l l e d wa t e r . Au t o c l a v e a t 1 2 1 f o r 1 5 mi n . 4 . 4 . 1 . 4 p H 8 . 0 p h o s p h a t e b u f f e r : we ig h o u t 0 . 5 2 3 g p o t a s s iu m d ih y d r o g e n p h o s p h a t e( K H Z P 0 4 ) a n d 1 6 . 7 3 g d i p o t a s s iu m h y d r o g e n p h o s p h a t e ( K Z H P 0 , ) ， d i s s o lv e in a n d b r i n g t h e v o lu me o f t h e s o - l u t i o n t o 1 0 0 mL wi t h d i s t i l l e d wa t e r . Au t o c l a v e a t 1 2 1 f o r 1 5 mi n . 4 . 4 . 2 An t i b i o t i c r e f e r e n c e s o l u t i o n s 4 . 4 . 2 . 1 A mp ic i ll in r e f e r e n c e s t o c k s o lu t io n : we ig h o u t a c e r t a in q u a n t it y o f a m p i c i ll in , d is s o lv e i n a n d b r in g t h e c o n c e n t r a t io n t o 1 O O O t g / mL wi t h a s e p t ic d e io n iz e d wa t e r . T h e s t o c k s o lu t io n s h o u ld b e s t o r e d i n r e f r ig e r a t o r a t 2 C - 8 0C a n d c a n b e u s e d f o r 2 d a y s . 4 . 4 . 2 . 2 A mp i c i ll in r e f e r e n c e w o r k i n g s o lu t io n ; p i p e t t e a c e r t a in v o lu me o f a mp i c i ll i n r e f e r e n c e s t o c k s o l u t i o n , a n d d il u t e it t o 0 . 0 2 5 K g / mL r e f e r e n c e w o r k in g s o lu t io n wi t h p H 6 . 0 p h o s p h a t e b u f f e r ( 4 . 4 . 1 . 3