SNT 3767.15-2014 出口食品中转基因成分环介导等温扩增（LAMP）检测方法 第15部分：大豆A2704-12品系.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 sN/T3767.1s-z014 出口食品中转基因成分环介导 +tf,+rrg (LAMP) toil| friE ffi 15 *llr|:tg a2704-12 ffie Loop-mediated isothermal amplification detection method for genetically modified components in food for export- Part 15Soybean A2704-12 2014-0卜13发 布 14-08-01实 施 中华人民共和国 国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局 发布 sN/T3767,15-2014 亠 一一日 亠刚 SN/T3767 出口 食 品中转基 因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法 共分为30部 分 : 第1部分 :通 用要求和定义 ; 第2部分 :筛 选方法 ; 第3部分 :玉 米Bl-11品系 ; 第 4 部分 : 玉米B t 1 7 6 品 系 ; 第 5 部分: 玉米G A 2 1 品系 ; 第 6 部分 : 玉米M I R 1 6 2 品 系 ; 第 7 部分: 玉米M I R 6 0 4 品 系 ; 第 8 部分 : 玉米M O N 8 1 0 品系 ; 第 9 部分 : 玉米M O N 8 6 3 品系 ; 第 1 0 部分: 玉米M O N 8 8 0 1 7 品 系 ; 第 1 1 部分: 玉米M O N 8 9 0 3 4 品 系 ; 第 1 2 部分 : 玉米T 2 5 品系 ; 第13部分 :玉 米3272品系 ; 第 1 4 部分 : 玉米5 9 1 2 2 品 系 ; 第 1 5 部 分: 大 豆 A ? 7 0 4 1 2 品 系; 、 第 1 6 部分: 大豆A 5 5 4 7 1 2 7 品 系 ; 第 1 7 部分: 大豆D P 3 5 6 0 4 3 品 系 ; 第 1 8 部分 : 大豆G T 泓 3 2 品 系 ; 第 1 9 部分 : 大豆M O N 8 9 7 8 8 品 系 ; 第20部分 :水 稻Bt63品系 ; 第21部分 :水 稻KF6品系 ; 第22部分 :水 稻KF8品系 ; 第23部分 :水 稻KMD品系 ; 第 24部分 :水 稻LLRICE62品 系 ; 第2 5 部分 : 水 稻M 1 2 品系 ; 第 2 6 部分 : 水稻T 1 G 1 9 品系 ; 第 2 7 部 分: 水 稻 T 2 A - 1 品 系; 第 2 8 部分 : 小麦B 7 3 6 1 品系 ; 第29部分 :甜 菜H71品系 ; 第30部分 :油 菜RT73品系。 本部分为SN/T3767的第15部分 。 本部分按照GB/T1,109给出的规则起草 。 请注意本文件的某些 内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。 本部分 由国家认证认可监督管理委员会提出并归 口。 本部分起草单位 :中 华人 民共和国福建 出人境检验检疫局 、 中华人 民共 和国广东 出人境检验检疫 局、 广州迪澳生物科技有限公司。 本部分主要起草人 :邵 碧英 、 陈文炳 、 高东微 、 李志勇、 常彦磊 、 凌莉 、 刘津 、 郑晶、 陈彬 、 缪婷玉、 彭娟 。 sN/T3767,15-2014 出口食品中转基因成分环介导 等温扩增(LAMP)检测方法 第15部分 :大 豆 A2704-12品系 1 范围 SN/T3767的 本部分规定了大豆及其制品中转基 因大豆 A270412品 系特异性的环介导等温扩增 (LAMP)初 筛检测方法 。 本部分适用于大豆及其制品 本方法的定性检测低限为0。 2 规范性引用文件 定性检测 。 下列文件对于本文件的应用是日期 的引用文件 ,仅 注 日期 的版本适用于本文 件 。凡是不注 日期的引用文件 , 本文件 。 GB/T6682 分 析实验室用 GB/T19495,2 转 基 因产 品 G B / T 1 9 4 9 5 , 3 转 基 因 产 G B / T 1 9 4 9 5 . 7 转 基 因 产 品 检 测抽样和制样方 SN/T2668 转 基因植物品系特测 方 SN/T3767.2 14 出 口 食因(LAMP)检测方法 第2部分 :筛 选方法 转基因植物及其产品成分 1485号 公告-7- 10) 3 防污染措施 环介导等温扩增检测过程 4 抽样与制样 草生品种定性PCR方法 (农 业部 按照 G B / T 1 9 4 9 5 , 7 的 规定执行。 5 核酸提取纯化 按照 G B / T 1 9 4 9 5 , 3 的 规定执行。 6 LAMP检 测方法 6,1 原理 6.1,1 一 般原 理 根据转基 因大豆 A270412品 系外 源基 因和大 豆边 界序列 设计 特 异性 内引 物 、 外 引物 和环 引物各 sN/T3767.15-2014 一对 ,特 异性 目标序列和引物碱基序列参见附录A。引物特异性识别 目标序列上的六个独立区域 ,利 用 Bs莎DNA聚合酶启动循环链置换反应 ,在 大豆A270412品 系特异 目标序列启动互补链合成 ,在 同一链 上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物 ;从dNTP析出的焦磷酸根离子 与反应溶液 中的Mg2+结合 ,产 生副产物(焦 磷酸镁)形 成乳 白色沉淀 ,加 人显色液 ,即 可通过颜色变化 观察判定结果 。 6,1,2 显色液显色原理 SYBR Green I是 一种高灵敏的DNA荧 光染料 ,可 以嵌人方式结合到双链DNA的 小沟 内。当它 与双链DNA结合时,荧 光信号是游离状态的8001000倍。在不发生扩增反应时,SYBR染料分子 的 荧光信号不发生改变 ,颜 色显现为橙色 ;当 发生扩增反应时 ,随 着双链DNA的增加 ,SYBR染料 的荧光 信号也随之大幅度增强 ,其 信号强度可代表双链DNA分子的数量 ,同 时颜色由橙色变为绿色。 6,2 仪器和设备 6,2,1 超纯水发生器 。 6 . 2 , 2 水 浴锅或加热模 板 : 6 3 , 0 0 , 5 和 8 0 , 0 0 , 5 。 6,2.3离心管:0.1mL、 1.5mL。 6 , 2 , 4 移液器: 量 程 0 , 5 u L 1 0 u L ; 量 程 1 0 u L 1 0 0 u L ; 量 程 1 0 0 u L 1 0 0 0 u L 。 6.2.5 计时器 。 6.3 试剂和材料 除另有规定外 ,所 有试剂均为分析纯或生化试剂 。 6 . 3 . 1 实 验用水 : 应符合 G B / T 6 6 8 2 中 一 级水的规格 。 6 , 3 , 2 d N T P s 溶 液 : 每种核苷酸浓度 1 0 m m 1 / L 。 6,3,3 Bs莎DNA聚合酶(如 :NEB公司或具有同等效果的DNA聚 合酶):酶浓度8U/uL。 6,3.4 10TllermolPol缓冲液:含 0mmol/L Tris H (pH值为 8,8)、100mmol/L硫酸铵、100mmol/L 氯化钾 、 mm。1/L硫酸 镁 、1%Tritol 100。 6.3,5 硫酸镁溶液:150mmo1/L。 6.3.6 甜菜碱:5m。l/L。 6,3,7 显 色液:SYBR Green I荧 光染料 ,1000。 6.3.8 引物 :根 据转基 因大豆A270412品系外源基 因和水稻边界序列设计一套特异性引物 ,包 括外引 物1、外引物2、内引物1、 内引物2、环引物1和环引物2。 外引物扩增片段长度 :266bp 夕 卜 引 物 1(F3,53 ):GACACATCTCATTGCACTGA 夕 卜 引 l/J2(B3,5 -3 ):CGAGTTCTGTTAGGTCCTCTA 内 引 物1(FIP,5 -3 ):TGGCGTAATAGCGAAGAGGCGTGAGTTATTTATCAGCCAAGC 内 弓u吻2(BIP,5,-3 ):GGATGTGCTGCAAGGCGATTTACAACGTCGTGACTGG 环 引 物 1(FLP,53 ):CCGCACCGACATAAGAAGA 环引物2(BLP,5 -3 ):AAGTTGGGTAACGCCAGG 6.4 实验步骤 6.4.1 阴性对 照 、 阳性对 照和 空 白对 照 的设置 6.4.1,1 阴性对 照 : 2 sN/T3767.15-2014 采用不含有 目标基因序列的植物基因组DNA为模板 。 6 . 4 . 1 , 2 阳 性对照 : 采用含有 目标基因序列的植物DNA或质粒DNA为模板 ,浓 度应略高于方法检测低限。 6,4.1.3 设 两个空 白对照 : 提取 DNA时设置的提取空 白对照(以 水代替样品); LAMP反 应的空 白对照(以 DNA溶解液代替DNA模 板)。 6,4,2 内 源基因检测 LAMP检 测前应先进行 内源基因检测 ,结 果 阳性则表明从样 品中提取 的DNA可以进行外源基 因 检测 ;否 则应重新进行DNA提取和纯化 。内源基因的检测参照 SN/T3767.214的 规定进行 6,4.3 LAMP反 应 体 系 LAMP反 应体系见表1。每个样品各做2个平行管 。加样时应使样品DNA溶液完全加人反应液 中,不 要粘附于管壁上。在反应体系配制完成后 ,将 1uL显 色液滴在管盖 内侧 ,盖 管盖时应小心 ,防 止 显色液混合进人反应液 中。 表1 大 豆 A2704丬2品系LAMP反应体系 6.4.4 LAMP反 应 参 数 6 3 , 0 o , 5 恒温扩增 6 0 m i n , 8 0 . 0 0 , 5 5 m i n 使 酶灭活, 反应结束。 6,4,5 显 色反应 反应结束后 ,将 显色液与反应液上下颠倒轻轻混匀 ,立 即在黑色背景下进行颜色观察 。 6.5 质 量控制 6.5.1 基 本原则 :实 验室中设置的各种对照LAMP检测结果应符合 以下情况 。否则 ,任 一种对照如果 组 分 工作液浓度 力 样量/uL反应体系终浓度 T h e r m o P o l 缓冲 液1 夕 卜 引钐 91(F3) 10umol/L 0 . 2 u m o l / L 夕 卜 引肜 92(B3)1 0 u m o l / I 0 . 2 u m o l / L 环 引 物 1(FLP)40umol/L 0 . 8 u m 1 / L 环引+/J2(BLP) 茌 0uml/L0,8um l/L 内引物1(FIP)40uml/L1,6lmol/L 内引物2(BIP)40 pnol/L1,6umol/L dNTPs10mmol/L 1,6mmol/L 甜菜碱 5mol/L1.2mml/L 硫酸镁 150mmol/L 6,0mmol/L Bs砂DNA聚合酶8U/uL o,32U/uL DNA模 板100 ng/pL8.0 ng/pL 水补 足 至 孔。 0 sN/T3767,152014 出现非下述正常结果 ,应 重做实验 。 6.5,2 空白对照 :反 应管 中液体呈橙色。 6,5,3 阴性对照 :反 应管中液体呈橙色 。 6.5.4 阳性对照 :反 应管中液体呈绿色。 7 结 果判断和确证 7,1 待 检样品2个平行样反应管中液体均呈橙色 ,同 时各种实验对照结果正常 ,可 判断该样 品检测结 果为阴性 。 7,2 待检样 品2个平行样反应验对照结果正常 ,可 判断该样 品 (见 附录A): 转基因大豆A27042品系初筛 按照 S N / T 2 6 6 8 进 行 按照农业部 1485号 公 对外引物 PCR扩增产物进行序列测 8 结 果表述 8,1 检测结果为阴性 ,表 述为“ 82 检测结果为转基 因大豆 A 表述 。 确证实验情况进行结果判 断和 sN/T3767,152014 附 录 A (资 料性 附录) 转基 因大 豆 A2704-12品系 目标基 因序 列及LAMP引 物 A,1 转 基 因大 豆 A2704-12品系外源基 因和大 豆边界序 列 1GACACATCTCATTGCACTGATCGGGGGCGTTCGTAGTGACTGAGGGGGTCAAAGACCAAG 61AAGTGAGTTA TT冂D今fCATCGGTGCGG GCCTCTTCGC 121 181 241 FIP: BIP: A,2 LAMP引 物碱基序 列及构 成 F3:GACACATCTCATTGCACTG B3:CGAGTTCTGTTAGGTCCTC FLP:CCGCACCGACATAAGAAG BLP:AAGTTGGGTAACGCCAGG F1c TqT0cGccAGCTGGCGAAA GGTTTTCCCAGTCACGACGT TCAAATAGAGGACCT纹ACAG TGGCGTAATAGCGAAGA B1c GGATGTGCTGCAAGGCG GTTGGGTAACGCCAG 町 GGAGTCAAAG胛 AAGC 寸冖0叩丨曲一卜z “HH“T s 中华人民共和国出人境检验检疫 行 业 标 准 出口食 品中转基 因成分环介导 等温扩增 (LAMP)检测方法 第 1 5 部 分: 大豆 A 2 7 0 4 - 1 2 品 系 sN/T3767,15