(论文)大鼠肝硬化模型制备的改良

当代医学2 0 0 9 年1 2 月第l 5 卷第3 5 期 中国介入放射学专题2 0 0 9 年1 2 月第3 卷第6 期 大鼠肝硬化模型制备的改 良 向贤宏 李家平 陈柳琴谭 国胜 陈伟 杨建勇 李鹤平 摘要 目的对现有肝硬化大鼠造模方法进行改良，构建出稳定的肝硬化大鼠模型并降低制模过程中大鼠的死亡率，为相关的实验提供稳定 可靠的疾病模型。材料与方法1 0 0 W is t a r 雌性大鼠，按0 5 m l 1 O O g 剂量予以皮下多点注射5 0 c c I 的色拉油溶液，每周注射2 次并称量其体重，同 时以1 o 乙醇溶液为其惟一饮用水源；体重降低大于或等于1 O g 以上时，暂停给药，并改用 自来水为饮用水源，直到体重恢复到下降少于1 O g 时继续 上述方案。结果 1 O 0 只W i s t a r 大鼠1 4 周后，死亡1 4 只，成模8 6 只。结论 经过改良的肝硬化大鼠制模方案可增加建模的成功率，并可形成由慢性肝 炎转化而来的小结节性肝硬化模型。 关键词】 大 鼠；C 0 1 4 ；酒精 ；肝硬化 Th e i mp r o v e me n t o f h e p a t i c c i r r h o s i s mo d e l o n r a t XI ANG Xi a n - Ho n g ， L I J i a P i n g ， CHEN L i u Qi n g， T AN Gu o - Sh e n g ， CHEN W e i ，Y ANG J i a n Y o n 9 ， L I He Pi n g De p a r t me n t o f I n t e r v e n t io n a l Ra d io l o g y , t h e F i r s t Affil ia t e d Ho s p i t a l o f Su n Y a t s e n Un i v e r s i t y ， Gu a n g z h o u Gu a n g d o n g 5 1 0 0 8 0 ， P R Ch i n a A b s t r a c t 】 O b j e c t i v e T o i mp r o v e t h e e x i s t i n g m o d e l o f h e p a t i c c i r r h o s i s o n r a t s ， a n d r e d u c e t h e mo r t a l i t y r a t e i n m o d e l i n g p r o c e s s ， p r o v i d e a n i ma l mo d e l s f o r r e l a t e d e x p e ri me n t s Ma t e r i a l a n d Me t h o d s 1 0 0 Wi s t a r f e ma l e r a t s ， CC 1 4( a n a l y t i c a l l y p u r e ， d e n s i t y 9 9 5 ) ， e d i b l e wh i t e l i q u o r a n d e d i b l e s a l a d o i l ， g a v e t h e h y p o d e r mi c mu l t i s p o t s a c c o r d i n g t o t h e O 5 ml 1 0 0 g d o s a g e t o i n j e c t 5 0 CC1 4 s a l a d o i l s o l u t i o n ， e v e r y we e k i n j e c t e d 2 t i me s a nd we i g h e d i t s bo d y we i g ht ，s i mu l t a n e o us l y t a k e 1 0 a l c o h ol s o l ut i on a s i t s o n l y s o u r c e o fd r i n ki n g wa t e r ； The b od y we i g h t r e d u c e d t ol 0 g， s us p e n de d g i v i n g t he me di c i n e ，a nd c h a n ge d t a p wa t e r a s s o ur c e of d rink i n g wa t e r , r e s t o r e d u nt i l t he we i g hi n g i n a f t e r d r o p pi n g b e l ow 1 0 g c o nt i n ue d t o g i v e t h e me d i c i n e a c c o r d i n g t o t h e a b o v e p l a n R e s u l t s O f 1 0 0 Wi s t a r r a t s w i t h t h e i n j e c t i o n 5 0 C C 1 4+ l 0 e t h a n o l s o l u t i o n 1 4 r a t s d i e d 1 4 w e e k s l a t e r a ft e r i n j e c t i o n ， a l l o f t h e r e ma i n e d r a t s b e c a me i n t o m o d e l s ， t h e a c h i e v me n t r a t e i s 8 6 C o n c l u s i o n T h e i mp r o v e d p r o g r a m o f c i rr h o t i c mo d e l i ng me t h o ds c a n i nc r e a s e t he s u c c e s s r a t e o fmod e l s ， a nd c a n for m a s ma l l no d ul a r l i ve r cir r ho s i s mo d e l f r o m c h r o ni c h e p a t i t i s 【 K e y w o r d s 】R a t ； C C L 4 ； A l c o h o l ； C i rr h o s i s 中国是乙型病毒性肝炎的 “ 重灾区”，目前全国乙肝病毒 感染人群 占总人口的1 0 以上，乙肝病毒携带者高达1 2 亿，每 年还有近百万的新发病例，这些病人约2 0 将发展为肝纤维化 肝硬化 。乙型肝炎 的广 泛流行导致我 国肝 硬化 的发病率居 高 不下，有鉴于此，构建一种稳定、可复制、模拟性强的肝炎后 肝硬化模型( C i r r h o t i c mo d e l ， C M) 是进行此类研究的前提。 材料与方法 一 材料 1 1 实验动物 1 O 0 只Wi s t a r 雌性大鼠，年龄3 4 Y j ，体重2 5 0 3 0 0 g， 均购于中山大学实验动物中心 ( 实验动物质量合格证书编号 ： 0 0 3 6 2 2 7 )。所有 的动 物均饲养 在2 1 的环境 中 ( S PF 级 )，普 通大鼠饲料喂养，昼夜照明时间每天1 2 小时，自由饮水。 1 2 实验试剂 C cl ( 分析纯，浓度9 9 5 ) 购自广州市嘉伟达化工有限公 司，市售食用白酒( 乙醇体积分数为5 3 ) 及金龙鱼食用色拉油若 干 。 基金项 目：广东省 自然科学基金项 目，编号0 5 3 0 0 7 6 5 国家 自然科学基金项目编号3 0 6 0 0 1 5 6 3 0 8 7 0 6 9 2 作者单位 ：广东 5 1 0 0 8 0 中山大学附属第医院介入放射科 ( 向贤宏 李家平谭国胜陈伟杨建勇李鹤平) 5 1 O 1 O 0 广东省人 民医院检验 科 ( 陈柳琴 j 通讯作者李鹤平E ma _ I _j x g d h p h o t m a i I c o m 1 3 实验准备 将C Cl ( 分析纯，浓度为浓度9 9 5 ) 与金龙鱼色拉油溶液 混合 配制成5 0 的 比例( 即5 份 C C 1 4 +5 份色 拉油溶液 ，混匀 ，灭 菌后备用) ；大鼠购回后在新环境中适应性饲养3 d ，充足供应食 物和饮水，每笼内饲养大鼠5 只。 二实验方法 2 1 构建肝硬化模型 以0 5 ml l O O g 剂量予以皮下多点注射5 0 C C1 4 的色拉油 溶液 ，每周注射2 次并称量其体重，同时以1 0 乙醇溶液( 由上 述食用白酒加蒸馏水配制，下同) 为其唯一饮用水源；体重降低 大于或等于l O g 以上时，暂停给药，并改用 自来水为饮用水源， 直到称量 ( 每周称量一次)体重恢复到下降少于l O g 后继续上述 方案 ；保证每 只大 鼠累积注射 C C1 4 及酒精 喂养 时间达 1 0 周( 不 包括暂停时间)；成功制备肝硬化大鼠模型周期约为1 4 周，制 模成功后 1 0 天 内开始实验 。 2 2 成模标准 肝脏肉眼观察有弥漫性大小不等的结节和塌陷区；肝脏组 织病理切片有假小 叶的形成 。 结果 一 肝硬化大鼠模型成模基本情况 1 0 0 只Wi s t a r 大鼠在注射5 0 C C1 的色拉油溶液+饮用1 0 乙醇溶液1 4 周后，死亡1 4 只，成模8 6 只，成模率为8 6 。 二成模大 鼠肝脏大体 形态 729 当代医学2 0 0 9 年1 2 , q第 1 5 卷第3 5 期 中国介入放射学专题2 0 0 9 年1 2 fl第3 卷第6 期 肝脏变 形 ，质地 变硬 、重量减轻 、外观呈 棕黄色、右叶和 中叶不同程度的萎缩，尾状叶增大，表面弥漫分布大小均一的 结节样增生，直径约为3 5 mm，最大者直径不超过1 0 mm，纤 维间隔较细， 假小叶大小亦一致 ( 图3 )，与正常肝脏形成鲜明 的对比 ( 图1 )。 三成模大 鼠肝脏镜下观 正常肝小叶结构 消失 或破坏 而被假小叶所取代 ；部分假小 叶 由几个不完整的肝小 叶构成 ，内含二、三个 中央静脉或一个 偏 在边缘部的 中央静脉 ，甚至 没有 中央静脉 ；有的假小 叶则 由 再生肝细胞结节构成，肝细胞的排列和血窦的分布极不规则； 假小 叶 内肝细胞常有不 同程度 的浊肿变性 、脂肪浸润 ，以及坏 死和再生；汇管区因结缔组织增生而显著增宽，胆汁郁积明显 ( 图4 )，与正常肝脏形成鲜明的对比 ( 图2 ) 。 讨论 各种原 因引起 的肝硬化是威胁人类健康 的重 要疾 病之一 ， 目前对此类疾病 的研 究及相关药理学实验主要建立在 肝硬化模 型( C i r r h o t i c mo d e l ， CM) 的基础上 ，因此构建一种稳定 、可 靠、模拟性强的肝硬化大鼠模型是进行此类研究的前提条件。 当前主要有两大类C M建模方案，单因素诱导建模及复合多因 素诱导建模 ，单 因素建模 中，其 中最为主要的是C C1 4 诱导 成模 及酒精诱导成模。 C C1 4 是最常用的诱导CM的化学物质 ，C C1 4 进入 机体 后， 首 先 经肝 细胞 微 粒 体 细胞 色 素P 4 5 0 激 活 生 成活 性 三氯 甲基 ( C Cl 一 ) ，C C1 3 通过攻击肝细胞膜的磷脂引起脂质过氧化从而 破坏膜性结构，CC1 3还可与蛋白质共价结合，损害线粒体导致 还原性辅酶A( NADH) 和三磷酸腺苷( ATP ) 在肝内生成减少，进 而抑制脂肪酸氧化和三羧酸 循环 。此外 ，由于 内质 网受损 可导 致脂蛋 白合 成 障碍 ，使 三酰 甘油 和脂肪 酸在 肝细 胞 内蓄积 ， 形成脂肪变性。因此，低浓度的C C1 4 反复应用，可使大鼠的 肝组织 受到 损害一 修复一 损 害的 循环破 坏作 用 ，最终导 致肝 纤维化及肝硬化 的发生 。 目前 ，C C1 4 诱导 制备 CM多采用3 0 6 0 CC1 4 油剂皮下注射 的方 法 ，剂量为3 5 ml k g，每周 2 次 ，通常 l 2 1 5 N 即可成 模 。该方法 虽操 作简 便 ，但C Cl 经 皮下注 射很快 即被 机体 吸收进 入 循环 系统 ，脑 、肾毒性 较 大 ，注射位置易发生浸润性脓肿 、溃疡或淋巴结肿大，见图 5 。死 亡率可 高达3 0 4 0 。总 之 ，C C1 4 诱 导 CM ，机 制明 确、效果肯定、重复性佳、剂量可控性强 ，常用于模拟暴发 性肝 功能衰 竭 、肝细 胞脂肪 样变 所致 的肝硬 化 ，然而 较高 的 死亡率 和多 器官 毒副反 应 限制 了其在 肝纤维 化和 慢性 肝硬化 病理发展机制研究中的应用。 另一个 重要的 单 因素 诱导模 型是 酒精性肝 硬 化模型 ( Al c o h o l i c c i r r h o s i s mo d e l ， AC M) 。肝脏是酒精在机体 内代谢 的主要场所 ，通常慢性酒精 中毒可引起肝脏的4 种序贯性损伤 ： 脂肪肝 、酒精性肝炎 、酒精 性肝纤维化和酒精性肝硬化 。研 究 发现酒精在肝 内代谢过程 中，肝细胞 内NADH NAD+比率增 高、 自由基大量产生 、活性 氧簇 系统高度活化 、脂质过 氧化 及 脂肪积蓄，这些生化改变可引起肝细胞的脂肪变性、坏死等， 最终导致纤维组织大量增生以及肝硬化的发生 。目前国际上 公认 的酒精性肝损伤模型主要有两种，R Ts u k a mo t o -F r e n c h 模型和L i e b e r -D e Ca r l i 模型。前者通过在大鼠胃内放置导管， 然后持续注入一定浓度的酒精代替饮水，可复制出酒精性肝损伤 各个阶段的病理改变，成功率和重复性都较理想，但该模型对实 验动物和实验技术要求较高，且费用昂贵，很难推广应用；后者 是让实验动物 自主饮用一定浓度的酒精饮料，同样可以复制出酒 精性肝损伤的各阶段病理改变 ，此模型特点是能主动控制能量 摄人，从而可减少营养摄入不均对实验结果的影响 。然而由于 肝硬 化大鼠模 型与肝硬化病人在病 因、病程 和转归上 的差 异 ， 图1 正常大鼠肝脏大体观 1 0 图2 正常大鼠肝脏镜下观 x 1 0 0 图3 肝硬 化大 鼠模 型肝脏 大体观 图4 肝硬化 大鼠模型肝 脏镜 下观 1 0 2 00 图5 C C I 经皮下注射 后注射部位淋 巴结肿大 图6 模型肝脏大体观 ( 膈面 ) l 0 图7 模型肝脏大体观 ( 脏面) 1 0 73O 当代医学2 0 0 9 年 l 2 月第 l 5 卷第3 5 期 中国介入放射学专题2 0 0 9 年 1 2 月第3 卷第6 期 C M的构建尚需根据研究对象的不同进一步完善和改良。 本研究 中我们采用C C1 4 联合酒精喂养制模的方法，根据大 鼠的体重变化调整给药的剂量和时机，取得了良好的效果。首 先，我们充分利用了C C i t 和酒精对肝脏的损伤作用，即首先形 成脂肪肝 ，随后形成 肝炎 、再 形成肝纤 维化及肝硬 化这一病 理 生理过程 。在实验 中 ，每周称 量大 鼠的体重 ，如果给药期 间大 鼠的体重下降达到或超过1 O g ，则停止注射C cl ，待损伤的肝 脏修复、体重增加后继续注射C C 1 ，如果体重在短期内不能恢 复，则说明肝脏损伤严重，继续给药有致死的可能，继续停药 使药物损伤性肝炎有修复的机会。建模过程中，我们充分利用 称量体 重这 简便 而且可行 的方法 ，对大 鼠肝脏 的损伤作 出直 观而可靠的评估。一方面减少了继续用药大鼠的死亡率，使建 模 的成 功率 大大增 加 ( 8 6 VS 6 5 )，不仅 能保证 实验 的顺 利进行 ，也可以降低实验的成本，节约科研资源。更为重要的 是我们 的建 模方法有 利于形成 由慢性肝炎 转化 而来的肝硬化 模 型，与爆发性肝炎后肝硬化不同，慢性肝炎化转化为肝硬化的 过程是一个损伤一修复一再损伤的过程 ，这一模型也符合我国 肝硬化多为慢性肝炎后肝硬化的国情。我们制备的肝硬化大鼠 模型多表现为小结节性肝硬化，见图6 、图7 。能更好的模拟肝 炎后肝硬化 。 经过改 良的肝硬化 大 鼠制模方 案可使建模 的成功率大大增 加 ，实验成本 降低并节 约科 研资源 ，并可模拟 由慢性 肝炎转化 而来 的小结 节性 肝硬化模 型。 参考文献 贾战生 肝病细胞治疗基础与临床【 M】 人民卫生出版社 2 0 0