蛋白质结构与功能3.ppt

蛋白质的结构与功能 Structure and Function of Protein,(四),第四节 蛋白质的理化性质,一 、蛋白质的理化性质 二、 蛋白质分离和纯化 三、 多肽链中氨基酸顺序分析 蛋白质一级结构的测定,（一）两性解离和等电点,及其分离纯化,Pr是两性电解质。在溶液中的带电状况主要取决于溶液的pH值。,OH-,H+,OH-,H+,pH=pI,pHpI,pHpI,pI定义： 在某一pH值溶液中，Pr酸性基团和碱性基团的解离程度相当Pr分子所带正负电荷相等，净电荷为零此时溶液的pH值称为Pr的pI。,Pr分子颗粒大小1-100nm之间,属胶体颗粒范围，在溶液中能形成稳定的胶体。,原因：,（二）蛋白质的胶体性质,表面形成水化层,表面同种电荷的斥力,除去这两个因素,Pr就会发生沉淀。由于胶体溶液中的Pr不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。,（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固,吴宪教授1931年：“天然Pr分子借助次级键连接而成一种紧密，有规则的空间结构，变性作用使次级键破坏从而使结构松散”。,1. 蛋白质的变性(denaturation),定义：在某些理化因素的作用下，Pr严格的空间结构被破坏 （不包括肽键的断裂），从而引起若干理化性质和生 物学性质改变的现象。,变性后的蛋白质称变性蛋白,能使Pr变性的物质叫Pr变性剂。,变性因素,变性实质：,破坏了空间结构，一级结构不受影响（分子组成、 MW不变）。,变性蛋白质的特点,旋光性、光吸收改变等；,变性与复性,变性,可逆变性：Pr变性后如将变性剂除去，该Pr分子的天然构象和生物学 活性还能恢复。,不可逆变性：若变性条件强烈，作用时间长，构像变化大，理化性 质难以恢复。,举例：医疗；生物制品保存；生活等。,RNase的变性与复性,变性后的蛋白质由于疏水基团的暴露而易于沉淀，但沉淀的蛋白质不一定都是变性后的蛋白质。加热使蛋白质变性并凝聚成块状称为凝固。因此，凡凝固的蛋白质一定发生变性。,总结：Pr变性、沉淀与凝固之间的关系 变性Pr不一定沉淀 沉淀Pr不一定变性 变性Pr不一定凝固 凝固的Pr一定变性,2. 沉淀与凝固,定义：,蛋白质分子相互聚集而从溶液中析出 的现象称为沉淀。,蛋白质胶体颗粒的沉淀,带正电荷的蛋白质,带负电荷的蛋白质,在等电点的蛋白质,酸,酸,碱,碱,脱水,脱水,脱水,不稳定的蛋白质颗粒 （沉淀）,带正电荷的蛋白质 （疏水胶体）,带负电荷的蛋白质 （疏水胶体）,碱,酸,（亲水胶体）,（亲水胶体）,（亲水胶体）,大部分蛋白质均含有带共轭双键的Tyr和Trp。这两种AA在280nm 附近有特征性吸收峰。在此波长范围，Pr的OD280与其浓度成正比。利用这个性质，可以对蛋白质进行定量测定。,（四）蛋白质的紫外吸收,蛋白质浓度mg/ml1.45A280-0.74A260,反应 试剂 颜色 反应基团 有此反应的Pr及AA 双缩脲反应 NaOH,稀CuSO4 紫或粉 2个以上肽键 所有蛋白质 Millon反应 Millon,硝酸，亚硝酸 红色 酚基 Tyr 黄色反应 HNO3及NH3 黄、橘黄 苯基 Phe,Tyr 乙醛酸反应 乙醛酸H2SO4 紫红 吲哚 Trp 坂口反应 次氯酸钠,萘酚 红色 胍基 Arg Folin酚试剂反应 CuSO4磷钨酸-钼酸 兰色 酚基 Tyr 茚三酮反应 茚三酮 紫兰色 游离氨、羧基 Pro和羟Pro呈黄色,（五）、蛋白质的呈色反应,二、蛋白质分离和纯化,研究Pr的结构、性质和功能，首先需要得到纯的蛋白质样品。 1. Pr来源：微生物、动物或植物细胞； 2.随时测定Pr活性并检测Pr含量; 3.分离和纯化过程须在温和的条件下进行。,分离方法,沉淀法,层析法,电学法,纯度、Mw和pI测定,层析法：凝胶过滤;高效液相色谱法,电泳法：PAGE、梯度凝胶电泳、等电聚焦电泳等,免疫化学法：专一的沉淀线,SDS PAGE电泳法：测定亚基数,超速离心：成分均一,其它：如, 结晶法,定义：加入大量中性盐以破坏Pr的稳定因素并 使从溶液中沉淀析出的现象。 原理:破坏Pr两个稳定因素：水化膜和电荷层 中性盐：(NH4)2SO4；Na2SO4；NaCl等。 半饱和硫酸铵沉淀球Pr 饱和硫酸铵沉淀清Pr 优点：Pr不变性，常用。,（一）盐析法（Salting out),叫分段盐析法,（二）电泳（electrophoresis),定义：带电粒子在电场中移动的现象称为电泳。 Pr分子在溶液中可带净的负电荷或带净的正电荷，故可在电场中发生移动。不同的Pr分子所带电荷量不同，且分子大小也不同，故在电场中的泳动速度也不同，由此可彼此分离。 （见实验理论 ）,电泳,带电粒子在电场力作用下向着所带电荷相反的方向泳动的现象叫电泳。利用这一原理，可以将蛋白质进行分离纯化。,板状电泳,等电聚胶电泳 (isoelectric focusing gel IEF),SDS-PAGE separates proteins by MW,试剂：丙酮、乙醇、甲醇等亲水溶剂 能与水以任意比例混合，有脱水作用。 原理： 脱水作用； 水的介电常数和蛋 白质溶解度。 优点：分辨率优于盐析法，能使某一Pr在狭小 有机溶剂浓度范围内沉淀。 缺点：易使Pr变性 应用：pI沉淀Pr。调节溶液pH到某Pr的pI，加上丙酮破 坏水化膜，Pr沉淀。 注意：防止Pr在分离过程中发生变性：04 下进行； 有机溶剂浓度不能太高，Pr沉淀后立即分离,2. 有机溶剂沉淀法：,（三）层析（chromatography),定义：利用混合物中各组分理化性质的差异，在相互接触的两相（固定相与流动相）之间的分布不同而进行分离分析的技术方法。 方法：离子交换层析；凝胶层析；吸附层析及亲和层析等。,离子交换层析法,定义: 利用离子交换树脂作为支持物，将带有不同 电荷的Pr进行分离的方法。 分类:阳离子交换树脂,如羧甲基纤维素等， 阴离子交换树脂,如二乙基氨基乙基纤维素等 原理:带正电荷多的Pr与树脂结合较强，而带正电荷 少的Pr与树脂结合则较弱。用不同浓度的阳离子洗脱液，如NaCl溶液进行梯度洗脱，通过Na+的离子交换作用，可以将带有不同正电荷的Pr进行分离。,带正电荷多蛋白紧密结合,带负电荷多蛋白流过层析柱,阳离子交换树脂工作示意图,Cation- exchange column,Column Chromatography,凝胶过滤法,亲和层析法,琼脂 糖 凝胶,连接臂,Affinity chromatography,（四）透析法（Dialysis）,定义：利用半透膜把大小分子分开 的方法。,Pr溶液置半透膜袋中，置流动溶剂（如蒸馏水）中，使小分子杂质（如无机盐、单糖、双糖、AA、小肽等透出）蛋白质留于袋中而得到分离。,材料：特制的半透膜，截止分子量一般为一万。,应用：1.腹膜透析和人工肾 ； 2.反透析 ； 3. 超滤利用压力或离心力强行使水和小分子杂 质通过超滤膜除去，Pr留在膜上而称之。,操作:,透析工作图,半透膜原理,（五）超速离心,利用物质密度的不同，Pr经超速离心后，分布于不同的液层而分离。 超速离心也可用来测定Pr的分子量，Pr的分子量与其沉降系数S成正比。,超速离心,密度梯度离心,步骤： A.形成密度梯度 B. 加样 C.离心 D.收集样品,（六）Pr含量测定法,微量凯氏定氮法： 双缩脲法：样品量0.2-1.7mg/L 改良Lowry法： 在碱性条件下磷钼酸、磷钨酸混合试剂与酪氨酸上的酚发生反应，生成蓝色化合物，将其与双缩脲法结合起来，形成两种颜色的混合物，在650nm具有特定的吸收。灵敏度较高25g-250g/ml.,考马斯亮蓝G250是一种带有负电荷的染料，在酸性条件下可与Pr上的正电荷结合，形成蓝色化物，在595nm具有特定吸收。,紫外吸收法 由于核酸在260nm具有光吸收，对测定干扰较大，可采用280nm、260nm同测法。 蛋白质浓度mg/ml1.45A280-0.74A260,考马斯亮蓝法（Bradford法）,三、多肽链中氨基酸顺序分析 蛋白质一级结构的测定,基本要求: 1.样品要纯（97%以上）； 2.测定Pr的分子量 3.知道Pr亚基数目； 4.测定Pr分子的AA组成；计算每种AA 的 个数。 5.测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。,方法,倒推法 顺序测定法,倒推法：,蛋白质（纯）,测定分子量，估计AA残基数（除120）,氨基酸自动分析仪 测定AA数量、种类和比例,肽链拆开,肽链末端分析,肽链选择性裂解,肽段分离,凝胶过滤 离子交换层析,氨基酸顺序分析：Edman法（异硫氰酸苯降解法）；酶解法,多肽链中氨基酸序列分析 的 主要步骤,纯度、Mw和pI测定,层析法：凝胶过滤;高效液相色谱法,电泳法：PAGE、梯度凝胶电泳、等电聚焦电泳等,免疫化学法：专一的沉淀线,SDS PAGE电泳法：测定亚基数,超速离心：成分均一,其它：如, 结晶法,一、名词解释,氨基酸残基 亚基 变构效应 协同效应 Pr的两性电离 Pr的pI 盐析 蛋白质变性 超二级结构 结构域 分子伴侣,复习思考题,1.为什么说：“蛋白质是生命的物质基础”？ 2.简述蛋白质螺旋和折叠的结构特点。 3.什么是Pr的一、二、三和四级结构，分别指出 维持它们结构的化学键。 4.举例说明Pr结构与功能的关系。 5.简述Pr变性、沉淀和凝固的定义及彼此之间的关系。 6.Pr定量测定的方法主要有哪些？,二、问答题,1 天然蛋白质中不存在的氨基酸是 A蛋氨酸 B胱氨酸 C羟脯氨酸 D同型半胱氨酸 E精氨酸,2下列哪种氨基酸在肽链中形成拐角 A缬氨酸 B酪氨酸 C脯氨酸 D苏氨酸 E色氨酸,三、选择题,4. 有关血红蛋白(Hb)和肌红蛋白(Mb)的叙述不正确的是 A.都可以和氧结合 B.Hb和Mb都含铁 C.都是含辅基的结合蛋白 D.都具有四级结构形式 E.都属于色蛋白类 5 有一血清清蛋白(pI685)的混合物，在哪种条件下电泳分 离效果最好? A.pH4.9 B.pH5.9 C.pH6.5 D.pH8.6 E.pH3.5,3 下列有关蛋白质片层结构的叙述正确的是 A.主链骨架呈锯齿状 B.两个相邻的肽平面呈折纸状 C.片层结构是一种较伸展的肽链结构 D.若干矩齿状肽链骨架平行或反平行排列，链间靠氢键维系 E.以上都正确,7.蛋白质分子引起280nm光吸收的最主要成分是 A.肽键 B.半胱氨酸的-SH基 C.苯丙氨酸的苯环 D.色氨酸的吲哚环 E.组氨酸的咪唑环,6. 经