3_HSD单克隆抗体的制备及其鉴定.pdfVIP

睾丸酮丛毛单胞菌在含有类固醇的培养基上 或环境中存在类固醇底物诱导时，可产生多种类 固醇脱氢酶和 11 种降解酶，其中 3-hsd (3- hydroxysteroid dehydrogenase, 3-hsd)是一种能够 利用分解甾体类和多环芳烃类化合物来获取菌体 生长所需要的碳源和能源的关键酶。3-hsd 的 中文全称是 3 羟基类固醇脱氢酶，目前认为， 3-hsd 不仅是睾丸酮丛毛单胞菌在以类固醇为 唯一碳源时产生的一种醇脱氢酶，也是降解类固 醇的关键酶， 广泛地存在于原核和真核生物体内， 是人体调节性激素代谢水平的重要物质1-4。 在睾丸酮丛毛单胞菌降解甾醇类化合物类固 醇的过程中，随着甾体类激素等诱导剂浓度的提 高， 3-hsd 的翻译表达量相应提高， 在一定范围 内与甾体类激素含量形成了线性关系5。基于这 种间接的线性关系， 可利用 3-hsd 单克隆抗体， 实现对环境或食品饲料样品中睾丸酮或类固醇类 激素的准确定性以及定量检测。研制 3-hsd 单 克隆抗体，可推动这种新型甾体激素检测方法更 为广泛地用于监测环境中甾体激素污染的整体情 况， 以及食物、 饲料中类固醇类有害成分的快速初 筛。 目前， 国内外尚无针对睾丸酮丛毛单胞菌 3- hsd 酶蛋白单克隆抗体制备的报道， 本研究利用 已表达纯化的高纯度 3-hsd 蛋白，通过免疫技 术和细胞融合技术， 制备其单克隆抗体， 为建立甾 体类激素的快速检测方法及睾丸酮丛毛单胞菌降 解类固醇类物质的机理研究奠定基础。 1材料和方法 1.1试验材料与试剂 imdm 培养基、 imdm 完全培养基（含 15%血 收稿日期: 2013-12-23；修订日期: 2014-03-10 基金项目： 质检公益性行业科研专项 （201110018-04） ;质检总局专项 （2013ik173、 2013ik293） 作者简介：杨伟克 （1981） ， 男， 山东青岛人， 兽医师， 硕士， 主要从事进出品食品验检工作。通讯作者为吴兴海。 植物生理与生物技术 3 - h s d 单克隆抗体的制备及其鉴定 杨伟克， 吴兴海， 王建华 （山东出入境检验检疫局 检验检疫技术中心， 山东 青岛 266002） 摘要： 为制备抗 3 - h s d蛋白单克隆抗体( m a b ) ， 以已表达纯化的高纯度 3 - h s d蛋白作为免疫原免疫 b a l b / c 小鼠， 利用杂交瘤技术， 经过免疫和细胞融合后筛选出特异性的抗 3 - h s d蛋白单克隆抗体, 成功冻存 3 5株 i g g类型阳性杂 交瘤细胞株。对 1 4号和 2 0号 a n t i -3 - h s d进行亲和性测试， 发现其与可溶性抗原蛋白的亲和常数分别为 3 . 7 e + 0 9和 4 . 2 e + 0 9 ， 二者可与抗原牢固结合， 具有良好的亲和性。 关键词：3 - h s d ； 单克隆抗体； 制备； 鉴定 中图分类号：r392.11文献标识码：adoi编码：10.3969/j.issn.10066500.2014.05.0074 development and identification of monoclonal antibody against 3-hsd yang wei-ke, wu xing-hai, wang jian-hua (inspection and quarantine center,shandong exit and entry inspection and quarantine bureau, qingdao, shandong 266002,china) abstract: for development of monoclonal antibody(mabs) against 3-hsd, balb/c mice were immunized with a synthesized 3- hsd. the splenocytes of the immunized mice were fused with sp2/0 cells，and the positive hybridoma cells were screened. 35 of mabs were identified as igg and successfully cryopresevated, the affinity constant of 14# and 20# mabs against 3-hsd were 3.7e+09 and 4.2e+09.the affinity of mabs was good. key words: 3-hsd; monoclonal antibody (mabs); development; identification 天津农业科学 tianjin agricultural sciences2014，20（5）：31-35 天津农业科学第 20 卷 清） 、 新生牛血清为实验室保存； 2.2%甲基纤维素 （货号： m0262-100g） 、 hat （货号： h0262-10v） 、 ht （货 号 ： h0137 -10vl） 购 自 sigma 公 司 ； peg1500 购自 roche 公司 （货号： 78364） ； 标记山 羊抗小鼠 igg/hrp 购自中杉金桥公司 （货号： 72324） ；二筛和三筛所用包被抗体和各型亚类二 抗抗体试剂购自 southern biotech 公司。标准分子 质量蛋白质购自上海丽珠东风生物技术有限公 司。 68 周龄雌性 bspf 级 balb/c 雌性小鼠购自北 京华大基因公司。 1.2方 法 1.2.1抗原检测对课题组已原核表达和纯化 的睾丸酮丛毛单胞菌 3-hsd 融合蛋白进行 sds-page 质控检测， 电泳条件为丙烯酰胺 12%； 浓缩胶恒压 80 v； 分离胶恒压 100 v； 考马斯亮兰 染色 60 min； 脱色 30 min 后观察检测结果。 1.2.2免疫选用 4 只 balb/c 雌性小鼠, 8 周 龄,20 g 左右。用通过质控的 3-hsd 融合蛋白， 每只小鼠按 60 g 蛋白的量，皮下初次免疫 4 只 spf balb/c 雌性小鼠， 编号为： 1， 2，3， 4。14 d 后， 皮下第 1 次加强免疫， 免疫量为 30 g 只-1。28 d 后， 皮下第 2 次加强免疫， 免疫量为 30 g只-1。 42d 后， 皮下第 3 次加强免疫， 免疫量为 30g只-1。 50 d 后， 眼眶取血， 测多抗血清效价。 1.2.3效价检测将抗原蛋白溶于 2 g ml-1醋 酸盐包被缓冲液， 4 包被过夜； 1%bsa，37 封 闭 2 h；多抗血清从 200 倍开始 2 倍梯度稀释， 空 白对照 （blank） 为 pbs， 阴性对照 （negative） 为阴性 血清 200 倍稀释。用分光光度计读取 od 值， 选取 效价最高的小鼠进行融合试验 60 d。 1.2.4细胞融合将状态良好的 sp2/0 细胞与末 次免疫后 3 d 所取的小鼠脾细胞进行融合, 融合 方法采用 peg 法。将状态良好的 sp2/0 细胞轻柔 地从培养瓶壁上吹打下来，吸入到 50 ml 离心管 中。小鼠摘眼球取血， 然后拉颈处死， 放入 75%的 酒精中浸泡 5 min。在平皿中倒入少量无血清的 imdm， 将细胞筛及注射器内芯放入平皿中。用剪 刀和镊子取下小鼠的脾脏， 放到细胞筛上。 用注射 器的内芯轻轻地将脾充分碾碎，将碾好的细胞吸 入到装 sp2/0 的离心管中， 1 500 r min -1 离心 5 min。 用剪刀和镊子取下小鼠的胸腺， 碾碎。 将碾好 的胸腺细胞到 15 ml 离心管中，再加入 1 ml 的 hat， 放在孵箱中备用。将离心好的细胞， 倒掉上 清， 用无血清的 imdm 将细胞小心轻柔地吹匀， 离 心 （1 500 r min-1， 5 min） 。 将离心好的细胞上清尽 量倒掉。 拍打离心管底以充分悬浮细胞， 将离心管 放入 37 温水中，在 1 min 内缓慢加入 1 ml 的 peg， 加完后， 在温水中静置 1 min。 然后 2 min 内缓 慢加入 2 ml 的无血清的 imdm， 接着 2 min 内缓慢 加入8ml无血清的imdm。1000 r min-1离心 5min。 倒掉上清，加入 10 ml 的血清，小心地将细胞吹 匀， 倒入前面准备好的胸腺细胞。 再加入 25 ml 灭 过菌的半固体培养基，充分混匀。然后均匀倒入 30 个细胞培养皿中。将细胞培养皿放入湿盒中， 然后放入孵箱中培养。 挑单克隆： 挑1093 个细胞 单克隆， 培养于 96 孔细胞培养板 （事先用胸腺细 胞铺板， 100 l 孔-1） 。 1.2.5细胞筛选单克隆细胞第 1 次筛选： 筛选 用试剂主要包括： 包被液， 碳酸钠-碳酸氢钠缓冲 液， ph 值 9.6； pbs 缓冲液， ph 值 7.4； 封闭液， 1% bsa in pbs； 洗液， pbs-t （0.05%吐温， pbs） ； 显色 液， 1%a 液+10%b 液 （a 液， 1%tmb in dmso；b 液， 0.1% h2o2in 柠檬酸 缓 冲 液） ； 终 止 液 ， 2 mol l-1硫酸； 二抗， 山羊抗小鼠 igg/hrp。 具体筛选流程包括以下步骤：用包被液稀释 3-hsd，终浓度为 10 g ml-1， 100 l 孔-1， 4 ， 过夜，后用洗液洗涤 2 次。1%bsa 封闭液封闭， 200 l孔-1， 37 孵箱， 2 h； 后用洗液洗涤 1 次。 加入一抗 （细胞培养上清） 、 阴性对照 （sp2/0 培养 上清） 、 空白对照 （pbs） 、 阳性对照 （阳性血清 pbs 200 倍稀释） ，均为 100 l孔-1， 37 孵箱， 1 h； 后用洗液洗涤 3 次。 加入 pbs 稀释 20 000 倍的二 抗， 100 l孔-1， 37 孵箱， 1 h； 取出后用洗液洗 涤 3 次。 显色， 显色液 100 l 孔-1， 显色时间为 5 min 左右。每孔加入 50 l 终止液终止。双波长 （450， 603） 测吸光值， 记录保存数据。 单克隆细胞第 2 次筛选：单克隆细胞标签筛 选， 将一筛得到的阳性细胞株， 载体蛋白包板， 同 时筛 igg， 采用 elisa 方法， 得到二筛阳性杂交瘤 细胞株。 单克隆细胞第 3 次筛选： 主要试剂包括,包被 抗体 （southern biotech） ； 封闭液,2%bsa+3%蔗糖 in pbs；显色液, 0.2 ml a 液+ 10 l30% h2o2in 10 ml b 液 （a 液,15 mg ml -1 abts in h2o；b 液, 柠檬酸缓冲液,ph 值 4.0） ; 各型亚类二抗 （southern biotech） 。 将筛选出来的二筛阳性细胞株 32 第 5 期 进行 3 筛鉴定， 最后得到三筛阳性杂交瘤细胞株。 1.2.6单克隆细胞亚类鉴定将经 3 次筛选出 来的阳性细胞株进行亚类鉴定， 主要试剂包括： 包被 抗体 （southern biotech） ； 封闭液， 2%bsa+3%蔗糖 in pbs； 显色液， 0.2 ml a 液+ 10 l 30% h2o2in 10 ml b 液 （a 液,15 mg ml-1abts in h2o； b 液， 柠檬酸缓 冲液， ph 值 4.0 ） ； 各型亚类二抗 （southern biotech ） 。 具体鉴定步骤如下： 用100 mmol l-1pbs （ph 值 7.4 ） 稀释包被抗体至 0.5 g ml-1,每孔加 0.1 ml, 4 ， 过 夜。pbs-t 洗 2 次,每孔加入 200 l 封闭液， 37 孵 育 2 h。pbs-t 洗 3 次；每孔加入 100 l 杂交瘤上 清， 37 孵育 1 h。pbs-t 洗 3 次； 用封闭液 11 000 (,)或 12 000(其它的)稀释的 hrp 标记的抗体 0.1 ml 每孔， 分别加入适当的孔中， 37 孵育 1 h。 pbs-t 洗 3 次；每孔加 50 l 底物溶液， 1020 min 内于双 波长 （450， 603 ） 测吸光值， 记录保存数据。 1.2.7抗体的纯化及检测采用 protein a/g 亲 和纯化,先用 pbs 平衡柱子,上样(按 110 的比例 用 pbs 稀释的腹水), 用 pbs 洗杂, 再用甘氨酸缓 冲液(ph 值 2.9)洗脱,收集洗脱峰,用 sds-page 分析。紫外分光光度计检测抗体浓度， sds-page 检测抗体纯度。 1.2.8elisa检测抗体亲和力将原核表达的 3-hsd 蛋白样品，以 mab(12 000) 为一抗， hrp-igg 为二抗(12 000)进行 elisa 检测。 2结果与分析 2.1抗原检测 对课题组已研制的高纯度 3-hsd 蛋白样品 进行质控检测， 电泳图谱显示其分子量为 26 kd 与 课题组已发表文章中的数据一致 （图 1 ） ， 其纯度大 于 90%， 浓度为 0.5 mg ml-1（表 1 ） ， 说明蛋白在运 输及传递和保存过程中并未出现明显降解情况， 其 纯度和浓度条件均符合单克隆抗体制备要求。 2.2免疫及效价检测 利用分光光度计检测各个稀释倍数的 od 值， 具体数值见表 2， 经计算后可得到 1、 2、 3、 4 号 小鼠的效价分别为 25 600， 128 000， 25 600， 12 800。 其所对应的 od 值分别为 0.934， 0.932， 0.853， 0.760， 比较后可以发现， 1 号和 3 号小鼠效价相同均为 25 600，高于 2 号和 4 号小鼠的效价，而 1 号的 od 值最高。 另外， 根据图 2 可以看出， 1 号小鼠的 多抗血清在大部分稀释倍数时其 od 值普遍高于 其他 3 者， 是较为理想的基础材料， 所以经综合比 较， 选择 1 号作为融合实验的细胞。 1: marker蛋白分子量标记；2:3-hsd融合蛋白样品。 图13-hsd蛋白电泳检测图谱 表1 3-hsd蛋白样品质控 泳道样品上样体积/l预计分子量/kda280实际分子量/kd检测后纯度检测后浓度/(mg ml-1) 1marker1094/66/45/33/25/19/14 23-hsd102626900.5 表2 4只小鼠的多抗血清效价检测 2004008001 6003 2006 40012 80025 60051 200102 400blanknegative 1#1.7331.5871.5711.5691.5161.3981.182（0.934 ）0.6340.3890.0230.086 2#1.7161.5641.5211.4431.3321.175（0.932 ）0.5780.4450.2220.0110.076 3#1.7411.6911.5971.4791.3251.3061.096（0.853 ）0.5960.3570.0130.07 4#1.6251.6131.5941.3721.2911.049（0.760 ）0.6290.3630.2270.0190.08 注： 1. 效价为大于最大 od/2 的最小 od 读数所对应的稀释度； 2. （ ） 中标注的数值为效价所对应的 od 值。 杨伟克等： 3-hsd 单克隆抗体的制备及其鉴定 33 天津农业科学第 20 卷 2.3细胞融合及筛选结果 融合前， 用 3-hsd50 g， 腹腔冲击免疫 1# 鼠。 将融合后的细胞转到半固体培养基中培养。 将 半固体培养基上生长的单克隆挑到 96 孔培养板 中进行培养和后续筛选。 2.3.1第1次单克隆细胞标签筛选用 3-hsd 包板，对挑选的克隆采用 elisa 方法，做第 1 次 筛选， 得到 95 株阳性杂交瘤细胞株。 2.3.2第2次单克隆细胞标签筛选将 95 株阳 性的细胞株，载体蛋白包板，同时筛 igg，采用 elisa 方法， 做第 2 次筛选， 得到 39 株阳性杂交瘤 细胞株。 2.3.3第3次单克隆细胞标签筛选将筛选出 来的 50 株阳性细胞株进行 3 筛鉴定，最后得到 39 株 igg 类型的阳性杂交瘤细胞株 （表 3） 。 2.4单克隆细胞亚类鉴定 将筛选出来的 39 株阳性细胞株进行亚类鉴 定，最后得到 38 株 igg 类型的阳性杂交瘤细胞 株。编号数值前带 “+” 的为 igg 亚类细胞株， 均转 到 6 孔板扩大培养， 收集上清并冻存。最后， 经检 测， 共成功冻存 35 株阳性杂交瘤细胞株。 2.5抗体纯化及检测结果 单克隆抗体经 protein a/g 亲和纯化后， 收集 洗脱样品。 利用紫外分光光度计检测抗体浓度， 利 用 sds-page 检测抗体纯度。结果显示 （表 4， 图 3） ， 14 号 anti- 3-hsd 和 20 号 anti- 3-hsd 的 纯 度 全 部 大 于 90% ， 浓 度 分 别 达 到 4.37 mg ml-1和 2.88 mg ml-1。 2.6抗体亲和力 （亲和常数） 检测 将原核表达的 3-hsd 蛋白样品， 以 mab (1 2 000) 为一抗， hrp-igg 为二抗 (12 000) 进行 elisa 检测， 结果如图 4。14 号 anti- 3-hsd 和 20 号 anti- 3-hsd 与可溶性抗原蛋白的亲和常 数分别为 3.7e+09 和 4.2e+09，二者可与抗原牢 表3第3次单克隆细胞标签筛选（elisa）数据 编号3-hsd编号3-hsd +21.827570.049 +41.516+590.727 +51.418610.065 +61.560+631.722 70.015+641.699 +91.331+650.278 +141.658+660.922 +151.300680.066 190.019+691.028 +201.579+700.817 210.031+731.330 250.073+741.294 +301.982+751.227 +321.444760.037 +331.739+771.406 +351.936+781.801 +371.920790.075 +380.532830.059 +411.904+881.543 +420.441+891.306 +431.784+901.321 +442.353+911.382 450.119+921.343 +481.487+951.076 阳1.860 +511.668阴0.041 +521.366空0.049 表4抗体浓度检测结果 名称纯化方法 缓冲体系/ （mol l-1） 浓度/ （ mg ml-1） 管数 * 体积/ml总量/mg纯度/% 亲和 常数 保存温度/ anti- 3-hsd： 14 proteina 亲和纯化 0.1(柠檬酸) 0.1(tris-hcl) 4.374*1.220.976 903.7e+09-20 anti- 3-hsd： 20 proteina 亲和纯化 0.1(柠檬酸) 0.1(tris-hcl) 2.882*1.16.336 904.2e+09-20 图2多抗血清elisa检测曲线 34 第 5 期 图4-hsd单克隆抗体亲和力elisa检测结果 a: 14#anti- 3-hsd; b:20#anti- 3-hsd。 固结合， 具有良好的亲和性和均一性， 可用于 3- hsd 蛋白及携有抗原 3-hsd 蛋白成分的样品免 疫检测。 3结论与讨论 在睾丸酮丛毛单胞菌降解甾醇类化合物类固 醇的过程中，甾体类诱导剂的加入可全面抑制阻 遏蛋白 rep b 和 3-hsd 基因 mrna 的结合及 rep a 与顺式操纵子双位点的结合，从而促进 3-hsd 基因的表达和翻译过程的顺利进行。随 着甾体类激素等诱导剂浓度的提高，阻遏蛋白的 被抑制程度也随之增加，而 3-hsd 的翻译表达 量相应提高，在一定范围内与甾体类激素含量形 成了线性关系。研究人员利用 3-hsd 单克隆抗 体， 以 c. testosterone 作为检测环境中载体类化合 物的指示菌种， 以 3-hsd 为目标蛋白建立了环境 或食品中总甾体激素含量的双抗夹心酶联免疫反 应( elisa)6-7。双抗夹心 elisa 法具有操作简便、 灵敏度高和通亮高等特点，可以同时检测睾丸酮 及与其结构类似的一类物质的量，可用于监测环 境中甾体激素污染的整体情况和食物、饲料中类 固醇类有害成分的快速初筛。此次 3-hsd 单克 隆抗体的研制成功将为这种新型甾体激素检测方 法的进一步研究和推广应用奠定基础。 参考文献： 1 boyer j, baron d n, talaly p. purification and properties of 3-hydroxysteroid dehydrogenase j.biochemistry, 1965, 4 (19) : 1 825-1 833. 2 mobus e, maser e. molecular cloning, overexpression and characterization of steroid-inducible 3-hsdroxysteroid dehy drogenase/carbonyl reductase from comamonas testosterone,a novel member of the short-chain dehydrogenase/reductase su perf