保靖酱油高产蛋白米曲霉选育及产酶条件研究.pdf

农产食品科技 2 0 0 9。 3 ( 4) ： 2 32 6 A g r i c u h u r a l F o o d P r o d u c t s S c i e n c e a n d T e c h n 0 l 保靖酱油高产蛋 白米 曲霉选育及产酶条件研究 黄 伟 ， 麻成金 ， 黄 群 ， 王敬敬 ， 逯 与运 ( 吉 首 大学食 品科 学研 究 所 ， 湖南 吉 首 4 1 6 0 0 0 ) 摘要： 从保靖酱油酱醅 中分离纯化得到 1株米曲霉， 采用紫外线诱变筛选出的突变株 比出发菌株产蛋 白酶活力提高 1 4 7倍。 在单因素试验的基础上， 通过正交试验得出突变株产蛋白酶最佳条件为 ： 麸皮与黄豆粉 比值为 4： 1 ， 培养时间 6 0 h ， 最适培养温度 3 2 C， 培养基加水量 5 6 。 关键 词 ： 蛋 白酶 ； 米 盐霉 ； 紫 外诱 变 ； 产 酶条件 中图分 类号 ： T S 2 0 1 2 + 5 文献 标识 码 ： A St u d i e s o n t h e Sc r e en i n g a n d F e r me n t a t io n Co n d it io n s o f Pr o t e i n a s e P r o d u c i n g A s p e r g i l l u s O r y z a e f r o m B a o j i n g S o y S a u c e HU A N G We i ， MA C h e n g - j i n ， HU A N G Q u a ， WA N G J i n g - j i n g ， L U Y u - y u n ( I n s t i t u t e o f 0 d S c e n c e o fs h o u U n i v e r s i t y ， s h o u Hu n a n 4 1 6 0 0 0 ， C h i n a 1 Ab s t r a c t ： A n A s p e r g i l l u s o r y z a e s t r a i n w a s i s o l a t e d a n d p u r i fi e d f r o m B a o j i n g s o l i d - s u b s t r a t e f e r me n t e d s o y s a u c e A mu t a nt wa s o b t a i n e d b y UV mu t a t i o n，a n d t h e a c t i v i t y o f pr o t e a s e wa s 1 4 7 t i me s h i g h e r t h a n t he wi l d s t r a i nBa s e d o n s i ng l e f a c t o r t e s t s ，t he b e s t c o n d i t i o ns o f e n z y me p r o d u c t i o n by o r t h o g o na l t e s t we r e de t e r mi ne d Fe r me n t a t i o n wa s c a r r i e d o u t a t 3 2 o C f o r 6 0 h wh e n t h e a d di t i o n r a t i o o f wa t e r wa s 56 a n d t h e a dd i t i o n r a t i o o f wh e a t b r a n a nd s o y b e a n p o wd e r wa s 4 ：1 Ke y wo r d s ： P r o t e a s e ； A s p e r g i U u s o r y z a e ； Ul t r a v i o l e t mu t a t i o n ； E n z y me p r o d u c t i o n c o n d i t i o n 保靖 酱 油 为湖 南 省湘 西 自治 州 地 方名 优 特 产 ， 已有 6 0余 年生 产历史 。选 用优质黄豆 、 面粉 、 食盐 为原料 ，采用传 统天然晒露 自然 发酵精酿而 成 的三伏酱油 ，不 加任何色素和添 加剂 ，原汁原 色 ， 酱 香 味浓 ， 余 味 醇 厚 悠 长 ， 风 味独 特 ， 在湘 、 鄂 、 渝 、 黔 四省市边区享有盛名 。 然而 ， 保靖酱油酿 造工艺 为 自然制 曲 、 天然 晒露发酵 。自然制 曲发酵 存在微 生物种类 、安全性难 以保证 ，原料利用率 低 ， 生产周期长 ， 产品质量波动性大等 问题l 1 - 2 l 。 米 曲霉是酱油 酿造 中的常用菌 株。酱油酿造 过程 就是利用 曲培 养米霉 ， 使其大 量繁殖 ， 分泌多 种酶 ， 其 中最主要的是蛋 白酶和淀粉 酶| 3 J 。试验从 保靖酱油酱醅 中分离纯化 1株米 曲霉 ，对 其孢子 进行紫外诱变 ，筛选得到蛋白酶活力提高的米曲 霉菌 株 ， 并优 化各 因素对米 曲霉产 蛋 白酶酶活力 收稿 日期 ：2 0 0 9 0 7 一 O l 基 金项 目：吉首 大学 校级 科研 项 目资 助( 编号 ： 0 8 J D X 0 4 1 ) 。 作者 简 介 ：黄伟 ( 1 9 8 6 1 ， 男 ， 湖南 娄 底 人 ， 研究 方 向 ： 食 物 资 源 开 发与 利用 。 通 讯作 者 的影响 ， 选取最佳产酶条件 。 应用于保靖 酱油制曲 工艺 ， 不仅可 以保持传统保靖酱油 的风 味 ， 而且可 以提高原料的利用率 、 减少酿造工业的污染。 对实 现保靖酱油传统酿造工 艺现代化 、产业化具 有重 要 意 义 。 1 材料与方法 1 1 原料与试剂 干 酪素 、 马铃薯 、 蔗糖 、 琼脂 、 氯化 锌 、 氯化 钙 、 氯化钠 、 硫酸镁 、 磷 酸二 氢钾 、 磷酸氢二 钠 、 硫 酸亚 铁等( 均为分析纯 ) 。 1 。 2设备与仪器 G Z X 一 9 1 4 6 MB E型 电热 恒温鼓 风干燥 箱( 上海 博 迅 实业 有 限公 司) ； S P X 一 2 5 0 B Z恒 温 生化 培养 箱 ( 上海博迅实业有 限公 司) ； V S 一 1 3 0 0 一 U型洁净工 作 台( 苏州净化 设备厂 ) ； L D Z X 一 4型 自动立式高压 蒸汽灭菌锅 ( 上海 申安 医疗 器械厂) ； R S 一 2 3 2精 密 电子天平( 上海恒平科技仪器有 限公 司) 。 1 3培养基 斜 面培养基 ： 马铃薯琼脂培养基 ( P D A) 。 农产食品科技 初筛蛋 白酶活力用培养基 ( 酪蛋 白培养基 ) ： 干 酪 素 4 g 、 K H 2 P O 4 0 3 6 g 、 N a H P 0 4 1 0 7 g 、 Z n C 1 2 0 01 4 g、 Na C1 1 2 g、 Ca C1 2 0 00 2 g、 Mg S 04 7 H2 0 0 5 g 、 F e S O 0 0 0 2 g 、 琼脂 2 0 g 、 蒸馏水 1 0 0 0 m L、 o H 6 57 0。 1 2 1 灭菌 3 0 m i n 。 三角瓶培养基 ：麸皮 ，黄豆粉 ，水 8 01 0 0 mL， 2 5 0 mL三角 瓶装 湿料 2 0 g ， 0 1 MP a灭菌 2 0 1 1 1 1 1 1O 1 4 试验方法 1 4 1 孢子悬浮液 的制备 取经过筛选 的优 良菌种斜面 1支 ，用移液管 吸取无菌水 1 0 m L滴入试管中轻轻震荡使孢子分 散到无菌水 中，将此孢子悬浮液倒人盛有 9 0 mL 无菌水的管 中充分混匀 ， 再从此试 管 中吸取 5 mL 加入另一盛有 4 5 mL无 菌水 的试管 中摇匀 ，依次 制备成 1 0 、 l O 之 、 1 0 、 1 0 4 、 1 0 不 同稀释度 的孢子 悬浮液【 5 6 】 。 1 4 2 紫外线诱 变 将紫外诱变箱开机预热 2 0 mi n以上。分别取 上述制备好 的孢子悬 浮液 1 0 。一l 0 各 1 0 m L， 于 直径 9 e m 的培养皿 内，同时放人无菌搅拌子 ， 将 培养皿 置于磁 力搅拌 器上并 使培养 皿在 1 5 W 紫 外灯垂直距离 3 0 c m左右 。 照射 0 5 m i n后打开培 养皿上盖并开启磁力搅拌 器使转子缓慢转动 。分 别 在 1 m i n 、 3 m i n 、 5 ra i n 、 7 mi n、 9 m i n后 停 止 照 射 ，盖上皿盖。诱变后菌液在黑布 中静置 12 h 后在 1 0 w 红光 下吸取 0 1 m L涂布于酪蛋 白培养 基表面 ， 每个浓度涂布 9个含菌平板 ， 其中一个用 于对照 ， 倒置于 3 0 恒温培养 观察1 7 , 8 j 。 1 4 3 优 良菌种 筛选 在培养 7 2 h后 ， 挑选单菌落透 明圈直径 D和 菌落直径 d的 比值 ( K)最大的菌株进行 产酶试 验。测定蛋 白酶活力 ， 与出发菌株做 比较 ， 选出优 良菌株 ， 放人 4 C的冰箱 内保存 _8 】 。 1 4 4 蛋 白酶 活 力测 定 称取研 细均匀 的成 曲样 品 1 0 g ， 放入 2 0 0 mL 锥形瓶 中， 加 5 5 温水 8 0 mL ， 充分摇 匀 ， 置 5 5 恒温水浴 锅 中保温 3 h ， 取 出后加热煮沸 ， 以破 坏 酶 活力 ， 冷却后定 容 至 1 0 0 m L， 充 分摇匀 后 以脱 脂 棉过滤 ， 吸取 滤液 1 0 m L， 移至 1 5 0 m L锥形 瓶 中 ，加 水 5 0 mL 1 酚 酞指 示剂 0 2 mL ，以 0 1 mo l L氢氧 化钠标 准溶 液滴定 至 刚显微 红 色 ( p H 8 2 ) ， 记下滴定数作 为总酸 。继续加 甲醛 1 0 m L， 用 0 1 mo l L氢氧化钠标准溶液滴定 至深红色( p H 8 5 ) 为终点 ， 记下滴定数【9 1 。另称取成曲 1 0 g 做水 分测定 ， 再折算成千基数。 蛋 白 酶 活 力 ： ( Vl V 2 )C0 0 1 41 0 0 ( 1 一 W) 。 式中： v ， ： 加入甲醛后氢氧化钠标准溶液滴定 数 ( m L) ； v ： 甲醛 空 白滴 定数 ( mL ) ； W： 成 曲水分 ( ) ； C： 氢氧化钠标准溶 液的浓度 ( m o l L) ； 0 0 1 4： 与 1 m o l 的氢氧化钠相 当的氮的量 。 1 5制 曲工 艺 1 5 1 纯种三 角瓶扩大培 养 麸 皮 ， 黄 豆粉 ， 水 8 01 0 0 mL ， 倒 入 2 5 0 m L 的三角瓶装湿料 2 0 g ， 塞好棉 花塞 ， 摇动 三角瓶 ， 使料水充分混合 均匀 ，厚度 以 1 5 c m左右 为准。 0 1 MP a灭菌 3 0 ra i n ， 灭菌后趁热摇松 曲料。每个 三角瓶在无 菌条件下接入 三环试管斜 面菌种 ， 逐 个摇动使之混合均匀。 3 0 C 恒温培养， 1 8 h 左右再 摇瓶使结块散开 ，继续恒温培养 4 h至物料结饼 明显 时进行倒置培养 1 d ，使上下菌丝生长一致 。 当孢子初显褐 白色时停止培养 ，然后 置于阴凉处 备用 ， 测成曲蛋 白酶活力。 1 5 2种 曲的 制 造 麸皮 、 面粉 、 水一混合一蒸料一过筛 摊冷 接种一 装盘一第一次翻曲一第二次翻 曲 种 曲。 扩大培养纯种 2 结果与分析 2 1 诱变条件的选择 诱 变时间 ( m i n ) 图 1 诱变时 间对致死率的影响 采用紫外线 为诱变手段 ， 在灯距 、 功率 一定 条 件下 ，紫外线的处理时间与诱 变效应呈正相关关 系。 致死率高则 突变率也高 ， 在致死率高达 9 5 以 上时引起的突变率很高，但正突变的几率并不一 定大 ， 诱变后再生 的菌株也非常少 ， 致死 率 7 0 左 加 印 0 9 6 斛 豁 黄 伟 等： 保靖 酱 油高产 蛋 白米 曲霉选 育及 产酶 条件 研究 右时得 到的再生菌株和突 变菌株都能够满 足筛选 的需要 ， 所 以通 常选 用此条件进行诱变l 5 l 。在距离 1 5 w 紫 外灯 3 0 c m处对 米 曲霉 的孢 子进行诱 变 ， 以致死率对 照射 时间作 图得 图 1 。由图 1可 以看 出 ， 照射 时间 为 3 mi n时 ， 米 曲霉孢子 的致死率 为 7 7 4 ， 照射 时间延 长 ， 致死 率进 一 步提 高 ， 不 利 于正突变菌株的获得 。 2 2 筛选结果 将不 同时间紫外线处理 的孢子悬液涂 布在酪 蛋 白平板培养基上 ， 3 0 c C培养 7 2 h ， 测定透 明圈直 径和单 菌落直径 的平均 值 ， 计算二者 的比值 K， 结 果 见表 1 。 表 1 紫外线不 同作用 时间的米 曲霉菌株透明 圈试验结果 处 理 时 l_日 J ( m i n ) 项 目 0 1 3 5 7 9 D mm 4 7 77 9 1 8 5 6 3 0 0 d mm 3 6 46 5 1 5 0 4 0 0 0 K 1 2 9 1 68 1 7 7 1 71 1 5 8 一 注： D单菌落透明圈直径均值 ； d菌落直径均值 ； K = D d 。 挑选 出 K值最大 的 2株 突变菌株 与出发株在 麸皮 ： 黄豆粉 = 4： 1 ， 曲料含水量 5 0 ， 3 0 C固态培 养 6 0 h后 ， 测定其 蛋 白酶活力结果见表 2 。 表 2 诱变株蛋 白酶活力测定结果 菌株 出发株 3 mi n处理突变菌株 5 mi n处理突变菌株 蛋 白酶活力( u g ) 7 8 5 9 1 1 6 0 2 1 0 4 0 4 由表 1 、表 2可知在 菌落直 径相差 不大 的情 况下 ， K值越大 ，该 菌酶活越高 。经 紫外线 3 m i n 处 理 突 变 菌 株 蛋 白 酶 活 力 比 出 发 株 提 高 了 4 7 6 。将其接人斜 面培养基 4 c I = 保存 ， 继续进 行 产蛋 白酶条件试验 。 2 3培养时间对产 酶的影响 三 龌 皿 嘲 2 4 3 6 4 8 6O ?2 96 时间 ( h ) 图 2 培养 时间对产酶影 响 当麸皮 ： 黄 豆粉 = 4： 1 ， 加 水量 5 0 ， 3 0 C恒 温培养 ， 考察不 同时 间对产 酶 的影 响 ， 见图 2 。由 图 2可知 ， 蛋 白酶活力随培养时 间延长缓慢上 升 ， 培养 6 0 h时蛋 白酶活力较 高 ， 此后蛋 白酶活力有 所下降 。这可能是 因为菌体死 亡导致细胞 出现 自 溶 现象 ， 同时酶的部分分解也会使 酶活力下降。 2 4培 养基 组分对产 酶的影响 当加水量 5 0 ， 3 0 o C恒温培养 4 8 h ， 考察不 同 培养基组分对产 酶 的影 响 ， 见 图 3 。由图 3可知 ， 培养基 组分中蛋 白质原料麸皮 的 比例越大 ，蛋 白 酶酶活力越高。 当麸皮与黄豆粉 比例 为 4 ： 1 蛋 白 酶活力达高峰 ， 说 明碳 源对米 曲霉产酶影响很 大。 这 可 能是 因为碳 量增 加 有利 于 菌 丝生 长 粗壮 浓 厚 。而 当碳氮 比继续增 加 ， 蛋 白酶活力下 降。这说 明碳 氮 源 比例不 当会 妨 碍 菌体 按 比例 吸 收 营养 物 ， 影 响生长繁殖 ， 从而影响米 曲霉 的代谢 。 烬 避 皿 咖 l： 4 ： ： 4： l b： l 麸 皮：黄豆粉 图 3 培 养基 组分对产酶的影响 2 5温 度对产 酶的影响 当麸皮 ： 黄 豆粉 = 4 ： 1 ， 加水量 5 0 ， 恒 温培养 4 8 h， 考察不 同温度对产 酶的影 响 ， 见 图 4 。由图 4 可知 ， 温度过低 或过高都不利 于米 曲霉产酶 ， 当发 酵温度为 3 2 时蛋 白酶活力达高峰 。这可能是 由 于温度过低 菌株生长不适 ， 使 蛋 白酶产量 降低 。 而 温度 过高 ， 影 响菌株代谢使孢 子数减少 ， 同时影 响 蛋 白酶的稳定性 ， 导致 酶活力 下降。 烬 避 正 嘲 27 3 2 37 42 温 度 图 4 温度对产酶 的影响 2 6培养基含水量对产酶的影响 O O O O O O O 如 帅 O O O O O O O 加 0 0 O O O O O 0 加 加 农产食品科技 当麸 皮 ： 黄豆粉 =4 ： 1 ， 加 水量 5 0 ， 3 0 恒 温培养 4 8 h ， 考察不同含水量对产酶的影响 ， 见 图 5 。由图 5可知 ， 培养基含水量 明显影 响米 曲霉产 酶 ， 随着含水量增加酶活力逐渐增 高 ； 当含水量为 5 0 时 ， 酶活力最高 ； 随着含水量继续增大其酶活 力逐渐下降。 这是因为孢子发芽需吸水膨胀 ， 水分 对菌丝生长也十分重要 ，但水分过高不利于米 曲 霉生长繁殖和酶的分泌 ，同时会增加曲料黏 度使 透气性下降，减小气体的交换和空气中菌丝体的 数量 ， 从 而影响米 曲霉 的代谢。 1 2 0 O 1 0 0 0 80 0 6 0 0 40 0 20 0 O 3 8 4 4 5O 56 66 水分含量 ( ) 图 5 培养基加水量对产酶影响 2 7 产酶条件选优 表 3 L 。 ( 3 ) 因素水平表 试验号 A B c D 蛋 白酶活力( u 信) 采用直观分析法对正交试验结果进行极差分 析 ， 比较四因素的 R值 ， 由表 4可以计算并判断 A B ： c D ， 为最优水平组合 ，即突变株产蛋 白酶的 优化条件为 ： 麸皮与黄豆粉 比值为 4： 1 ， 最适培养 温度 3 2 ， 培养时间 6 0 h ， 培养基加水量 5 6 。比 较各因素 R值可见， R o R R R B ，因素影响的主 次顺序是 D A C B ，即曲料含水量影响最大 ， 其 次是 曲料碳氮 比、 制 曲时间 ， 而制 曲温度 的影响则 最小。 按优化条件用于保靖酱油制曲工艺， 不但提 高了曲料蛋白质利用率 ，而且保持保靖酱油传统 风 味 。 3 结论 从保靖酱油酱醅中分离纯化得到 1 株米 曲 霉 ， 采用功率 l 5 w 紫外灯为诱变手段 ， 在灯距 3 0 cm下 ，对米 曲霉孢 子悬液处理 3 m i n突变株 ， 得 到其蛋 白酶 活力 比出发株提 高了 4 7 6 。在单因 素试验的基础上，通过正交试验得出突变株最佳 产酶条件为： 麸皮与黄豆粉比值为 4 ： l ， 最适培养 温度 3 2 ， 培养时问 6 0 h ， 培养基加水量 5 6 。 可 用于保靖 酱油规模化生产。 参考 文献 ： 1 田 超浅 谈浓 香型 大 曲制