大豆低聚糖粉中棉子糖和水苏糖的测定方法研究.pdf

墨亘匿困 - S O Y B E A N5 C f E N C E T E C H N O L O G Y 摘要：本研究建立了一种同时测定大豆低聚糖粉中棉子糖 和水苏糖含量的高效液相色谱分析方法（HPLC） 。采用示 差折光检测器(RID)，色谱柱为Agilent Zorbax carbohydrate 柱(4.6mm150mm,5m)，流动相为乙腈-水(7525,V V)，流速1.0mL/min，柱温30。实验结果表明：棉子糖和 水苏糖分别在 110mg/mL、110mg/mL 范围内线性良 好，相关系数分别为0.992 5、0.997 1；2种糖的相对标准 偏差(RSD)分别为1.57%、1.81% (n=5)，平均回收率分别为 95.8%、96.0%。该分析方法适用于大豆低聚糖粉中棉子糖 和水苏糖含量的检测。 关键词：高效液相色谱；大豆低聚糖粉；棉子糖；水苏糖 Abstract:A method was developed for the determination of raffi nose and stachyose in soybean oligosaccharides by high perfor mance liquid chromatography. The sample was separated on an Agilent Zorbax carbohydrate column (4.6mm 150,5m ) at 30, which was then eluted with 75% acetonitrile aqueous solu tion at a rate of 1mL/min, and the signal was detected by RID. The results showed that the linear range for raffinose and stachy ose, respectively were in the range of 110mg /mL, 110mg /mL with a correlation coefficient of 0.992 5 and 0.997 1, respective ly.The relative standard deviations for raffinose and stachyose were 1.57% and 1.81%, respectively (n=5) and the average re coveries were 95.8% and 96.0% , respectively. Key words:High performance liquid chromatography; Soybean oligosaccharide; Raffinose; Stachyose 大豆低聚糖(Soybean Oligosaccharides，SBOS)是 大豆籽粒中可溶性寡糖的总称，也可泛指其它豆 科作物种子所含有的低聚糖总称，主要成分是蔗 糖 （Sucrose） 、棉子糖（Raffinose） 、水苏糖 （Stachy- ose）。蔗糖是由-D-葡萄糖和-D-果糖以 -1，2糖苷键结合而成。而棉子糖和水苏糖则是 在蔗糖结构中的葡萄糖之C6位以-1，6糖苷键 又分别结合了1分子和6分子的半乳糖，其均属于 非还原性糖。其中棉子糖和水苏糖为功能性低聚 糖，其功能特性主要表现在：促进双歧杆菌的增 值，减少有毒发酵产物及有害细菌酶的产生，防 止腹泻和便秘，改善血清脂质，保护肝功能，降 低血压，增强免疫力，抗肿瘤，合成维生素，防 龋齿，低能量或无能量1。 大豆低聚糖的测定方法有很多种，其中较准 确的方法是气相色谱法(GC)和高效液相色谱法 (HPLC)。这两种方法都具有既可定性又可定量的优 点。其中HPLC法不但分离效果好，重现性及回收 率均比GC法好2。利用HPLC测定SBOS方法也有 许多报道3，如利用carbohydrate色谱柱测定甜菜糖 蜜中的葡萄糖、蔗糖和棉籽糖3，及选用 Hyper- sil-NH2色谱柱测定方法4，5、BondapakC18柱 测定方法6、反相液相色谱法(RP-HPLC)7等方法， 本文对采用carbohydrate色谱柱的HPLC方法同时 测定大豆低聚糖粉中水苏糖和棉子糖的方法进行 了研究，结果表明该方法灵敏、准确、可行。 1 试验部分 1.1 仪器与试剂 试验仪器：Agilent1100型高效液相色谱仪、示 差折光检测器(G13162A RID)、Agilent Zorbax car- bohydrate 柱(4.6150mm, 5m) 、SUPELCLEAN ENVI-18 化学工作站。 收稿日期：2010 - 04 - 30 大豆低聚糖粉中棉子糖和水苏糖的 测定方法研究 王玉军，纪伟东，李永平 （黑龙江粮食职业学院粮油工程系，哈尔滨150080） 中图分类号： Q503文献标志码： B文章编号： 1674-3547(2010)04-0023-03 加工技术加工技术 23 9 5 0 0 0 7 5 0 0 0 5 5 0 0 0 3 5 0 0 0 1 5 0 0 0 5 0 0 0 时间f m i n ) 产oH凹蛊_) 试验试剂：水苏糖、棉子糖标准品为Sigma公 司色谱纯产品；乙腈为色谱纯；大豆低聚糖粉购 自陕西森弗生物技术有限公司。 1.2 色谱条件 色谱柱：Agilent Zorbax carbohydrate 柱(4.6 150mm, i.d.5m)；流动相为乙腈-水(7525,V V)；流速1mL/min；柱温30；RID检测器，检测 池温度35；进样量10L。 1.3 标准溶液配制 分别称取水苏糖、棉子糖标准品 （含量均 98%）各0.02g置于5mL容量瓶中，用去离子水溶 解并稀释至刻度，摇匀。水苏糖、棉子糖溶液浓 度分别为4mg/mL，经0.45m滤膜过滤，滤液供 HPLC分析用。 1.4 样品制备 准确称取2.00g大豆低聚糖粉，用去离子水溶 解并稀释定容至100mL，混匀，经0.45m滤膜过 滤，滤液供HPLC分析用。 1.5 测定方法 1.5.1 标准曲线的制备分别取大豆低聚糖标准溶 液 5.0L、10.0L、15.0L、20.0L、25.0L （相 当 于 水 苏 糖 、 棉 子 糖 质 量 20g、 40g、 60g、80g、100g）注入液相色谱仪，进行高 效液相色谱分析，测定各组分色谱峰面积，以标 准糖质量对相应的峰面积作标准曲线。 1.5.2样品测定在相同的色谱分析条件下，取 10L试样溶液注入高效液相色谱仪分析，测定各 组分色谱峰面积，与标准曲线比较确定进样液中 水苏糖、棉子糖含量。 2 结果与分析 2.1 色谱柱的选择 采用示差折光检测器，采用carbohydrate色谱 柱，同时对大豆低聚糖粉中的水苏糖、棉子糖进 行测定，试验结果表明，选用carbohydrate色谱柱 进行检测效果较好。 2.2 流动相的选择 本实验以乙腈-水为流动相，通过改变乙睛与 水的比例优化色谱条件。以乙腈-水分别为 80 20、7525、7030(VV)测定了混合标准溶液和 大豆低聚糖中棉子糖、水苏糖含量和分离情况。实 验表明，随着乙腈浓度的增加，糖蜜中的糖分离程 度提高，当流动相中乙腈和水的比例为8020时 分离效果最佳，但是分离时间较长。当流动相中乙 腈和水的比例为7030时分离效果不好，葡萄糖 和相邻峰的分离度较差。当流动相中乙腈和水的比 例为 7525 时分离效果很好，且保留时间较理 想。综合考虑各个因素,本实验采用流动相的比例 为7525。 2.3 色谱分离 采用上述分析条件，柱温选定为30，棉子 糖 和 水 苏 糖 分 离 良 好 ， 两 者 的 保 留 时 间 为 12.30min、22.90min，标准品和样品色谱图见图 1、图2。 2.4 标准曲线和检出限 以1.5.1中所述方法对混合标准液进行液相色 谱分析，以峰面积为纵坐标(y)，标准糖质量(g)为 横坐标(x)，作校正曲线并进行线性回归。实验结果 图1 标准物质色谱图 图2 大豆低聚糖粉样品色谱图 加工技术加工技术 24 聚 恒 磐 艇 脚 样品注入量( I J L ) 表明：棉子糖和水苏糖分别在 110mg/mL、1 10mg/mL范围内线性良好，相关系数分别为0.992 5、 0.997 1，以3倍信号比(S/N)为检出限( LOD )，棉子糖 为 0.43mg/mL，水苏糖为 0.39mg/mL，回归方程见 图3、图4。 2.5 精密度测定 取同一大豆低聚糖粉样品，按照 1.4 进行处 理，重复进样5次，进行精密度实验，结果棉子糖 和水苏糖的RSD分别为2.50%和0.16%(见表1)。 2.6 回收率实验 在滤液中加入一系列不同浓度的混合标准液， 按上述方法处理后进行HPLC分析，棉子糖和水苏 糖的平均回收率为95.8%和96.0%，RSD为1.57% 和1.81%，结果见表2。 2.7 样品测定 任意选取三份大豆低聚糖粉样品，按上述方法 处理后进行测定分析，测定结果见表3。 3 结论 本实验建立了采用示差折光检测器(RID)，色 谱 柱 为 Agilent Zorbax carbohydrate 柱 (4.6mm 150mm,5m)，流动相为乙腈-水(7525,VV)， 流速1.0mL/min，柱温30，同时测定大豆低聚糖 粉中棉子糖和水苏糖含量的高效液相色谱分析方法 （HPLC） 。实验结果表明：棉子糖和水苏糖分别在 110mg/mL、110mg/mL范围内线性良好，相关 系数分别为0.992 5、0.997 1；2种糖的相对标准偏 差(RSD)分别为1.57%、1.81% (n=5)，平均回收率分 别为95.8%、96.0%。该方法适用于大豆低聚糖粉 中棉子糖和水苏糖含量的检测。 参考文献： 1李本楠，甘卉大豆低聚糖理化性质及其生理功能J 中国实用医药，2009，(9)：238-239 2 唐春江,邓放明,王乔隆，等大豆低聚糖的研究进展 N. 农产品加工 学刊, 2008， (2):33-37. 3董爱军，张英春，杨鑫，等高效液相色谱法测定甜 菜糖蜜中的葡萄糖、蔗糖和棉子糖J食品工业科 技，2008，(12)：245-247 4GB/T 22491-2008 大豆低聚糖S 5马莺,骆承祥,吴昊.高效液相色谱法测定大豆乳清中大豆 低聚糖J.分析化学,1999,27(3):367. 6张延伸，张东祥，刘国忠，等高效液相色谱法测定 大豆低聚糖J食品工业，2000，(2)：45-46 7朱建华，杨晓泉反相液相色谱法同时测定大豆制品 中的功能性低聚糖水苏糖和棉子糖J粮油加工与 食品机械，2005，(11)：75-76 图3 棉子糖标准品标准曲线、回归方程及相关系数 图4 水苏糖标准品标准曲线、回归方程及相关系数 表1 检测方法精密度实验结果 成分 水苏糖 棉子糖 峰面积 182 504 225 433 207 405 182 338 178 864 231 024 215 402 196 269 197 458 174 677 峰面积 平均值 196 326 201 948 RSD （%） 0.16 2.50 表2添加回收率实验结果（n=5） 成 分 水 苏 糖 棉 子 糖 加入量 （g/ L） 5 10 15 20 25 5 10 15 20 25 测出量 （g/ L） 4.88 9.57