虫草多糖对日本沼虾免疫机能的影响.pdf

第 2 0 卷 第 3 期 2 0 0 1 年6月 华中农业大学学报 J o u m a l o f H u a z h o a gr i c u l t u r a l U n i v e r s i ty v 0 J 2 0 No 3 J u n e 2 0 0 1 。 2 7 52 7 8 虫草多糖对 日本沼虾免疫机能的影响 昌鸣先 陈孝煊 吴志新 胡先勤 ( 华中农业太学水产学院，武汉 4 3 o 0 7 0 ) 摘要在饲料中添加 1 的虫草多糖。 以1： 3 服形式对 日本沼虾进行免疫。通过连续测定 日本沼虾血淋巴吞 噬活性， 血清中抗菌活力、 溶菌活力以及酚氧化酶活力。 研究虫草多糖对 日本沼虾免疫机能的作用。结果表明： 除个别情况外， 虫草组的吞噬百分比和吞噬指数、 抗菌活力 溶菌活力咀及酚氧化酶活力。 均高于对照组。因此， 投喂虫草多糖能够明显地增强 日本沼虾 的免疫防御能力。 关键词免疫机能 ； 虫 草多糖 ；日本 沼虾 中图法分 类号S 9 6 3 7 3 6 ； S 9 4 5 4 9 ；S 9 4 2 5 随着甲壳动物 养殖规模的扩大 ， 对其病害和防 治的研究也 日益引起人们 的重视， 其中有关 甲壳 动 物免疫机能的研究越来越受到关注 。与脊椎动 物一样， 甲壳动物的免疫 防御存在细胞防御 和体液 防御。细胞防御 表现 为吞噬作用 ( p h a g o c y t o s l s ) 、 团 囊作用( e n c a p s u l a t i o n ) 及结节 ( n o d u e 1 ) 形成。体液因 子主要包括凝集素 、 抗微生物因子以及酚氧化酶原 激活系统等 。近年来 的研究表明， 甲壳动物 的免 疫机制以非特异性免疫反应为主 ， 在其开放式的 循环系统 中， 酚氧化酶原激活系统 ( p r o p h e n o l o x i d a s e a c ti v a ti n g s y s t e m， p z o ) 在识别异物与免疫防御 中发挥 着重要作用 。此外 ， 甲壳动物的抗微生物因子主 要是血淋巴中的各种酶 它包括溶菌酶 、 酸性 磷酸 酶、 碱 性 磷 酸 酶、 过 氧 化 物 酶 等 。 日本 沼 虾 ( Ma c r o b r a c h i u m n ip p o n e n s e ) ， 作为一种重要 的淡水养 殖对象， 其免疫功能的研究却未见报道。虫草多糖 ( C o r d y c e p s p o l y s a c c h a r i d e ) 经研究证明具有 增强机体 的细胞免疫功能， 促进造血细胞的增殖、 抗肿瘤以及 抑制某些致病菌生长等药理作用 ， 在临床应用 中 用来提高机体的免疫力 本文就虫草多糖对 日本沼 虾免疫功能的影 响进行研 究， 以期探讨 多糖对其 免 疫水平的影响 1 材料与方法 1 1 试验用虾及饲养 日本沼虾 ， 体重 2 53 g ， 购于武汉市大东门集 收稿 l 期 ： 2 0 0 I 2 _ 1 5 *武涩市重点科技项 目 昌鸣先 ， 女 t 9 7 2年生 ， 华 中农业大学水产学院硕士生 政泓 0 0 7 0 贸市场 ， 选择体态正常， 健康无病的个体饲养于水族 箱中 ， 水温 l 42 9 ( 自然水温 ) 。每天下午投 饵 1 次 ， 投饵量以第 2 d上午略有剩余为准。对照组 投 喂基础饲料 ， 试验组在连续投 喂 2 8 d 后 改投基础饲 料。 1 2 药饲的制作 称取饵料量 1 o 的虫草 多糖 ( 北京金 弼康科技 公司生产 ， 批 号 ： 9 9 0 3 1 0 ) 拌人基 础饵料 中研磨 、 混 匀 ， 然后制成颗粒状 ， 目光下晒干、 备用。 1 3 菌种 大肠杆菌( E s c h e r l c h # t c o f i ) ： 抗链霉素菌种 ， 由华 中农业大学生科 院提供 ， 按要求培养后配成一定浓 度的悬浊液( 0 铀 0 3 0 5 ) ， 现制现用。 金黄色葡萄球菌 ( S t a p f r y h 3 c c u s f t t t t - q g ) ) ， 由本实 验室保存并提供， 按要求培养后配成一 定浓度( 3 l o 8 c e ll s m 1 ) 保存备用。 溶壁微球菌( M c r o c o c c u s o t e i k t i c u s ) ： 购于 S i g m a 公司， 按要求配成一定浓度( 0 0 3 ) 保存备用。 1 4 取血 于投喂多糖前和投喂多糖后的第 1 ， 4 ， 7 ， 1 4 ， 2 1 2 8 d以及停止投喂多糖后的第 7 ， 1 4 d 分别取样 样品分 2份 ： 用注射器吸取虾血抗凝剂 0 2 m 1 插入沼虾围心腔中吸取血淋巴 0 2 m l ， 注入离心管 中， 再加人 0 4 m l 、 0 l 5 m o l l L冷 I N a C 1 溶液 ， 制成抗 凝血 ， 用于吞噬活性 的分析； 用无菌注射器从虾体 围心腔中取血， 将血液置于无菌离心管中， 于4 冰 维普资讯 2 7 6 华 中 农 业 大 学 学 报 第 2 0卷 箱过夜， 第 2 d低速离心， 析出的血清用于抗菌活 力、 溶菌活力、 酚氧化酶活力的测定。每次取样 5 只， 结果取平均值。 1 5 吞噬活性的测定 在抗凝血中加入 2 5 0“ l 金黄色葡萄球菌悬液， 混匀 ， 于 2 8 保温 1 h ， 再加人 0 8 I 1 l l ( O 1 5 m o l L ) 冷 N a C 1 溶液， 2 0 0 0 r ra i n 离心 4 m i n ， 弃上清液。每个 样品涂片 5张。甲醇固定 ， G i e m s a 染色 ， 油镜下观察 计数， 并按下式计算吞噬百分比和吞噬指数。 吞噬百分比( P P ) ： 塑 堕史 壹堕 1 0 0 吞 噬 指 数 ( n ) ： 看 黠 1 6 抗菌活力及溶菌活力测定 参考王雷方法。 计算抗菌活力 u 及溶菌活力 U 。 l 7 酚氧化酶活力的测定 以 L - d o p a 为底物 ， 参考 H 0 r 。 t Z 等的方法“ 进 行， 将 3 9 m l 的 0 1 n l o l L、 p H 6 O的磷酸钾盐缓 冲 液与 l 的 O O 1 m o l L的 I 广 d o p a及 0 1 r a i 血清于 室温下混匀 ， 每间隔 2 m i n 读取 在 4 9 0 m 波长下 的 光密度值( o D ) ， 其酚氧化酶以试验条件下每分钟 O D 4 增加 0 0 0 1 为一个酶 活力单位 J 。 2 结果与讨论 2 1 虫草多糖对 日本沼虾血淋巴吞噬活性的影响 虫草多糖可以明显增强日 本沼虾血细胞对金黄 色葡萄球菌的吞噬。在投喂多糖前， 对照组的 P P为 4 6 ， P 1 为 7 0 2 ； 虫草组的 P P为 4 2 4 + P l 为 6 3 3 ， 两组 的吞噬活性无明显差 异。在投喂多糖后 ， 虫草组无 论是吞噬指数( P I ) 还是吞噬百分 比( P P ) 均极显著地 高于对照组( PO 0 1 ) 。虫草组的吞噬指数在免疫 后的第 2 1 d 达到高峰( 较对照组提高 1 1 5 2 6 ) ， 并 且在停止投喂后的第 1 4 d呈现第 2次峰值( 较对 照 组提高 1 4 2 o 3 ) ； 吞噬百分比的变化趋势与吞噬 指数基本相 同。对 照组吞噬活性 的变化与水温有 关， 随着 水温 从 2 6 5 C降至 l 4 ， 其 吞噬指 数从 7 o 2 降至 3 9 5 ， 吞噬百分 比从 4 6降至 3 4 6 。详见 表 1 。 表 1 虫草多糖对 日本沼虾血 细胞 吞噬活性的 影响 T a b l e1 F J l e c l s o 1“ C o r d e p s p m 山一 d e 0 I fi l e p h 嘴 s 0 f I 瑚q 惦0 fM呻 ， l r础 以上结果表明， 虫草多糖可以明显地增强口本 沼虾血细胞的吞噬活性 。V a l e a l e等在研究 1 ， 3葡 聚糖对 甲壳动物血细胞的激活作用时 ， 发现甲壳动 物中的酚氧化酶原系统在其细胞防御中起着类似凋 理素的作用 可促进血细胞的吞噬作用 、 团囊作用和 结节形成” ； 而一些生物活性 多糖， 如葡聚糖 ， 可以 通过特舁性地激括 酚氧化酶原 系统 ， 从而增强血细 胞的吞噬， 这种作用在昆虫中亦得到证更 孙云 汉在进行冬虫夏草 和虫草菌丝的药理学研究时， 证 明虫草制刑对机体细胞的免疫功能具有明显的增强 作用” ， 虫草多糖是 一种非特异 性的免疫促进 剂。 本研究结果证明了虫草多糖对 日本沼虾的血淋 巴亦 有明显的增强作用 。 2 2 虫草多糖对E t 本沼虾血清抗菌活力、 溶菌活力 的影响 投喂多糖前 ， 虫草组与对照组的溶菌活力、 抗菌 活力基本相 同， 溶菌活力对照组为 0 0 7 4 ， 虫草组 为 0 0 7 6 ； 抗 菌活 力对照组为 0 2 5 3 ， 虫草组为 0 2 3 4 。 投喂多糖后 ， 两组 的溶菌活力 、 抗菌活力虽变化趋势 大致相同 ， 但虫草组的溶菌活 力、 抗菌 活力均明显 高于对照组 详见圈 I 、 图 2 。 从图 1 和图 2可以看出 ， 对照组的抗菌活力、 溶 菌活力除个别情况外其值变化不大； 而虫草组的抗 菌活力、 溶菌活力由于受多糖免疫作用的影响而有 较大的变化 虫草组溶茼活力在第 1 4 d达到峰值 ， 抗菌活 力在第 7 d 达到峰值 ， 可以初 步推断 ， 抗菌活 维普资讯 第 3 期 昌呜先等： 虫草多糖对日本沼虾免疫机能的影响 ：言 刘 a 组C o n o l 虫蕈组O r d yv e p , 图 1 投喂虫草 多糖后 日本沼虾血清 溶菌活 力的变化 F ig1 V a r i e t y o f b a c t e d o ly t ic a c t i v it i e s i n s e la J m o f M n n s e挑r f e e d i n g 0M a s p o ly s a c c a ( ；d e 毒 j Co n t r o l Cor d yc e p s 图 2 投喂虫草多糖 后 5 1 本沼虾血清抗菌活力的变化 F i g 2 V a r i e t y o f a n t ib a c t e r i a l a c t iv it ie s i n s e r u r r l o f M o o e n s e a ft e r f e e d in g c b m s p o ly s a c c a r i d e 力、 溶菌活力的产生是不 同步 的， 这与王雷等报道的 结果一致 ”。关于多糖对溶菌活力的作用 ， 刘树青 等认为海藻多糖和北虫草多糖 可增强中国对虾血清 溶菌酶的作用 J ， 本研究结果也与他们 的一致 2 3 虫草多糖对酚氧化酶活力的作用 虫草多糖对酚氧化酶也有显著的影响， 在投喂 多糖后 2 8 d内， 虫草组的酚氧化酶活力均明显高 于 对照组 详见表 2 、 图 3 。 表 2 虫草多糖对 13 本 沼虾酚氧化酶的影响 Ta b l e 2 Effe c t s o fCo r d y c e p s p D s a c 曲a d e O i l t h e p h e o x i d a s e o fM n i p p n e n s e 测试项 目 化 酶 力 P h e n o l o x t d e a c t i I u n i t n I 取样 间 I ) a v s 对心组 C i m t ， l虫 组 r 如 1 9 8 2 0 0 2 9 0 l 右 0 2 6 3 3 2 9 5 3 3 9 5 3 0 5 3 0 6 2 5 以 上结果表明在正常 的情况下 ， 日本沼虾血清 n l 6 景01 2 寸 e 。 。 8 0( H n +对 组Co n t r o 图 3 对 照组与虫草组 P O动力学变化 血线圈 F ig 3 Me a s u r e me n t o f a c 【 iV i n Co n t rol a n d i n C o r d y c e p s g r o u p 中存在有酚氧化酶 的活性 ； 虫草多糖对 日本 沼虾酚 氧化酶的活力有明显的增强作用。关于酚氧化酶的 存在部位以及存在 的形式， 不同学者有不 同的看法。 S a u l 等 认 为 酚 氧化 酶 主 要 存 在 于 血 浆 中； 而 S o d e r h a l l 和王雷等人认 为， 酚氧化酶主要 以酶原的 形式存在于甲壳动物的血细胞中 只有在被激活后 才能表现其活力 。在本研究 中， 日本 沼虾血清 中存在酚氧 化酶活 力， 由于 加入 S D S对其 影响 不 大 ， 可见该酶在血清 中不是 以酶原形式存在。这与 S o d e r h a l l 在淡水螯虾 ( A t o z ,t t s m) 中的结果相类 似。另有研究表明， 一些生物活性 多糖 ， 如 口1 ， 3葡 聚糖( p 1 ， 3 u c a n ， B G ) 脂多糖( 1 i p o p o l y s a c c h a r i d e ， P S ) ， 肽聚糖( p e p t i d o g l y c a n ， e G ) 等， 不仅可 以通过旁 路途径激活哺乳 动物的补体系统 还可 以特异性地 激活节肢动物中的酚 氧化酶原系统 本研究 表明， 虫草多糖对 日本沼虾血清的酚氧化酶亦有很 好的增强作用。 由于取血操作可激活 P P O； P P O在一定条件下 可 以“ 自发” 激活； 同一试验组 中虾体质 的差异等因 子可影响酚氧化酶测定 ， 因此对酚氧化酶的规律 性 不能得到很好的阐明。但由于血清中酚氧化酶测定 比较简单 ， 且影响的因子少 ， 它可作为项指标来衡 量虾体的免疫功能状态。 参考文献 1 S c I l K C e i u s I Cm 1 i t y H F i 出 1 s I 9 e 2， f ： 1： 32 3 2 r 埘h i Y I t a mi I Ka 兀 ( k l肌 dd帆 km l lf n l Y i P a th do g 3 ，1 9 9 5， ： t 41t 5 0 3 m F E 附 n l e r B E v a n s I e t A n i n d u c e d h c t e n c i d in i n【 k s p i lw l 时 ，P u l l ms g m I) 】B id M 1 9 6 8，t 2 8： 3 3 9 8 4 李存猛 、 战文啦 ， 督t _ 闻对虾 l 淋巴挠 测定 岛海洋太学学报，t 9 9 9 2 9 ( 4 ) ： 5 9 9 6 0 3 维普资讯 2 7 8 华 中 农 业 大 学 学 报 第 2 0卷 5 孟凡伦， 张玉臻， 孔 德等甲壳动物中的酚氧化酶原激活系统 的研究评价 海洋与湖稆 1 0 9 9 ， 3 0( 1 ) l 1 0 1 t 5 6 d 目叫K V a e s t m nT A 憎I Im 0 f s 唧 p r h e n o l wd d a s ei n a r th r o p o d i r c an mi ，t h e s p e c ifie l t y o f wa l l u 一fi v a t i o n a e d v a t i b y p u ri fi e df u n y c 。 p n t n s o f c r a y fis h p h e n o c e d d a s e C a nMi c r i a 1 1 9 7 9， 2 5 ： 4 0 641 4 7 7 - s h i d M，Sod e r heU K Th e p f ( p h d0 d 衄e fi v a tin g s t e m in e my - fi s h c B i o c h e m P h 1 9 8 4 7 7 B ( 1 ) ： 2 1 2 6 8 刘树青， 汪晓路， 牟海津等免疫多糖对中国对虾血清溶菌酶、 磷酸酶和过氧化物酶的作用海洋与湖沼，0 9 9 3 0 ( 3 ) ： 2 7 8 2 8 3 9 刘恒 ， 李光友免 疫多糖 对养殖有 关白对虾 作用的研究 海 洋 与期稆 ，1 9 9 8 ， 2 9 ( 2 ) ： 1 t 3 一】 】 8 】 O 孙云汉 冬虫夏草和虫草苗丝的药理学研究药理学， 1 9 9 0 1 7 9 】 9 1 l 】 s 0 d e K g - 1 ，3 G 1 u c 蛐 d m n c e m e n t of p mt e a s t a c t i c it yin c r a y fi s h h e rn i ae y s a t e Bi o c h e a n P h y s i d 1 9 8 3，7 4B： 2 2t 2 2 4 l 2 王雷， 李光友， 毛远 中国对虾血淋巴中抗菌、 溶苗活 与 酚氧化酶话力的测 定盐 其特殊 性研究海 洋 与湖 ，1 9 9 5 ，2 6 ( 2 ) ： I 7 9 1 8 5 t 3 Ho tz N H，S h e n S Ne u r o a p o m t y r o m n a e Bo l l Ch e m， 】 9 5 2 1 9 7 5 7 3 5 2 0 t 4 A s h i d a M I? u fifi c a t i l ar d c h a r a e t e r l ml i of I p h 0 ln d f wm 0 fth e日l h B o mb y x m o r t I n s e c t B i o e h e m 1 9 71 ，l l ： 5 76 5 1 5 “ V a l e fi e J ，S m i fi t ， 口 K B I l ， 3 一G l u t e n a e ti v a t i l o f o e 叽 h e m 咖a d m 啪B id B u l1 1 9 8 3，1 6 4( 2 9 931 4 t 6 L e o n a r d C， Nm咖A， R a t c l ifie d a 1 T h e rol e 0 f P mp h e n ofo x i d a a c t i v a t i o n i n T m s e lf 1 lt o n a d d p heg o s i s s b l o o d c e l l s T T P h y s i o 1 9 8 5 3 “t o ) ： 7 8 91 9 9 l 7 王雷， 李光友， 毛远必口服免疫药物后中国对虾某些血淋巴 蚓子的测定及方法研究海洋与湖沼 1 9 9 5 ， 2 6 ( 1 ) ： 3 4 4 l 1 8 S a u l S J I k q o f p n k a e n o l wf d n s e i n t h e h a e mof,a n p h Ma n d u c a S e x ta i s p r e s e n ti nt h e p a s r m a d d n o ti nt h e b e mo c y t e s v l r a t r n e，1 98 5， “ ： 4 7 94 8 5 1 9 Sod e d u d l K，Sn th V J Th e p r o p h d x i d a s e a e fi v a n g c a 9 c a 且 s a r 0 n a n d d e f e n s e s y s c a n in r h a： Hu w r a 1日 T I d c e l l u - 1 一 可 i n I H p 0 d s Yo r k ：J o h n Wil o y S o n s ，1 9 8 6 2 5 1 2 8 5 2 0 So d e r h s l l K，Ha 11 ldp o p o l y s a e c he r l d e i d u c e d a c t i v a ti o n 0 f p m t l e n o l r d z s e a c t i v a t i n s y s t e m i n 【 讳 s h he e m Tt e B h e m B i o p h y s Ac ta，j 9 8 47 9 7： 9 9 1 0 4 2 1 A& ti d a M，Ym z k i H 】 B i o dt e mi l y of t h e n h 栩 0 】册 d a s e s y ae a n i n i n s e e t ： w i t h目 瑚 i t d 唧 o e t o i t s a c t iv a ti o n f n ： s h iz i H e d Mo h i n g H n d me t a mo q h s i s S p r i n g e r V e r l a g B e rt i n ： J a p a n S c i P r 1 9 9 0 3 9 2 6 3 Th e Effe c t o f Co r d y c e ps Po l y s a c c ha r i d e O i l M a c r o b r a c h i u m n i p po n e n s e I mmu n e Fu n c t i o n C h a n g Mi n g x J a n C h e n X i anx u a n Wu Z h i x i n H u Xi a n q i n ( H u a z h o n gA g t w u l t u r a l U n i v e r s i t y ，W u h a n 4 3 ( 3 0 7 0 ，C h i n a ) A b s t r a c t C o r d y c e p s p o l y s a e e h a r i d e ，a p r o d u c t b o #t f r o m m e d i c i n e s h o p s ，w i t h t h e c h a r a c t e r i s t i c s s i m i l a r t o th o s e o f p c a r l ，w a s u s e d a s a f o o d a d d i t i v e t o t e s t i t s l i m 2 n e d t e c t M a c m b r a c h b i u m n i p p o n e n s e, d th a b o d y w e i g h t o f 2 02 5 g w e r e c o l l e c t e d f r o m the D a d o n g me n A q u a c u l t u r e Ma r k e t o il S e p t e mb e r 1 2 ，2 0 0 0， a n d n u r s e d Wa t e r t e mp e r a t u r e v a r i ed f r o m 2 9 t o 1 4 C ( n a t u r a l t e m p e r a t u r e ) ， the w a t e r w a s a e r a t ed and c h a n g ed o n c e a d a y ( 1 22 3 v o l u me o f wa t e r wa s ren e e d e a c h t i me ) T h e e x p e r i m e n t o f p h e n o l o x i d a s e( P O )t e s t w a s d e s i g n e dae the $ tT te a s th o s e o f b a c te ri o l y t i c ( U ) a n d a n t i