园艺教育毕业论文（设计）-常春藤盐胁迫下对外源钙的响应 (2).doc

本科生毕业论文（设计）题 目: 常春藤盐胁迫下对外源钙的响应 姓 名: 学 院: 生命科学学院 专 业: 园艺教育 班 级: 08级（2）班 学 号: 指导教师: 职称: 讲 师 2011年 12 月 5 日安徽科技学院教务处制目 录目录1摘 要1关键词1引言11材料与方法11.1供试材料11.2试验主要仪器21.3 试验主要药品21.4试验设计与方法21.4.1 试验准备21.4.2试验设计21.4.3 试验方法31.5 测定方法31.5.1 sod含量的测定31.5.2 pod含量的测定31.5.3 可溶性蛋白含量的测定31.5.4 丙二醛含量的测定31.6 数据统计与分析42结果与分析42.1不同处理对sod含量的影响42.2不同处理对pod含量的影响42.3不同处理对可溶性蛋白含量的影响52.4不同处理对丙二醛含量的影响63 讨论和结论6致谢7参考文献7英文题名、摘要、关键词.7常春藤盐胁迫下对外源钙的响应园艺教育: 指导教师： 摘 要：通过试验，研究不同浓度的钙对常春藤在不同浓度的盐状况下生长及生理特性的影响。通过处理，测量丙二醛含量、过氧化物酶含量、超氧化物歧化酶含量和可溶性蛋白含量，结果表明，当nacl的浓度为120mmol/l常春藤全部致死，而外源钙没有起到缓解效果，但是随着nacl浓度在一定范围内增大，植物的丙二醛含量总体上升，过氧化物酶含量、超氧化物歧化酶含量和可溶性蛋白含量都呈现不同程度的减弱。而用不同浓度的ca（no3）2能够缓解盐对常春藤的生长的影响，ca（no3）2在一定范围内，浓度越大，对nacl胁迫的缓解效果越好。关键词：常春藤；盐胁迫；钙；缓解遂着城市化进程的加快和人们生活水平的提高，人们越来越重视我们赖以生存的环境。一方面是人们居住环境遭到了破坏，城市里变得拥挤，生活上变得压抑，使我们大家处于一种亚健康状态。另一方面，道路中经常弥漫着汽车尾气、施工灰尘、建筑噪音等等，都影响到我们正常生活。这些环境的破坏，需要我们去改善，其中植物对陶冶人的情操，改善人们生活质量发挥着巨大作用。常春藤作为一种常绿、攀援的藤本植物，它既能做为家庭绿化美化植物，改善家庭的空气质量，又能做为园林道路植物，吸收灰尘尾气美化城市道路，现在它的应用逐渐广泛，据此对常春藤的研究尤为重要。 常春藤原产于我国，分布于秦岭以南各省区，不仅是垂直绿化的主要树种之一，也是极好的木本地被植物，亦可盆栽。常春藤蔓枝密叶，是一种十分美丽的观叶常绿藤本花卉，是我国园林中垂直绿化的主要树种之一，又是极好的木本地被植物。常春藤为五加科常春藤属常绿攀援木质藤本, 具气生根, 匍生或附生。小枝无毛或有毛; 单叶, 革质,全缘3-5 裂, 具叶柄, 对生或互生花小, 伞形花序单生或数个组成短圆锥花序, 花有白色、淡白绿色、紫色等; 果球形, 成熟时为红色或黑色; 种子卵圆形。常春藤性极耐阴，也能生长在全光照环境中。能耐短暂-7的低温。对土壤和水分要求不严，但喜温暖、湿润、疏松、肥沃的土壤。园林用途中常盆栽或吊盆布置于室内或窗前、阳台，是一种良好的垂直观叶植物和地被植物。目前常春藤的耐盐性研究不多，对盐胁迫的应激机制和耐盐性的研究成为近年来植物研究中的一个热点1 ， 对常春藤的耐盐性研究在生产、应用、推广中具有很大的实用价值。植物在受到不同浓度的盐胁迫时都会表现出不同程度的伤害，据此选择不同程度的nacl对常春藤进行盐处理，寻求常春藤的盐胁迫忍耐程度。钙是植物必需的一种矿质营养元素，它对维持细胞壁、细胞膜以及膜结合蛋白的稳定性，调节无机离子运输，且作为细胞内生理生化反应的第二信使偶联外信号，调控多种酶活性等都具有重要的作用2。在植物适应环境的变化中钙起重要作用，当植物受到盐渍、低温、高温、厌氧、氧化胁迫等时,细胞质内游离钙浓度明显上升，启动基因表达引起一系列的生理变化,进而提高植物对逆境的适应性3 。因此可以从不同浓度的钙去研究植物，从而也能反映植物的抗逆性。1 材料与方法1.1 供试材料挑选生长好、没有发生病虫害的常春藤进行剪枝扦插培养，养活的苗做为实验材料。试验于2011年4月18号在安徽科技学院花卉基地进行。1.2 试验主要仪器仪器名称型号生产厂家冰箱干湿温度计低速离心机数显恒温水浴锅分光光度计电子天平电子分析天平生化培养箱 bcd-208k888-btgl-16ghh-6722-syp1200fa10004blrh-150青岛海尔股份有限公司安徽省芜湖市温度计厂北京雷勃尔离心机公司国华电器有限公司上海棱光技术有限公司上海精科天平上海精密仪器有限公司上海一恒科技有限公司1.3 试验主要药品药品名称标准生产厂家磷酸愈创木酚双氧水甲硫氨酸氮蓝四唑核黄素考马斯亮兰g-250三氯乙酸乙醇硫代巴比酸氯化钠丙酮磷酸氢二钠磷酸二氢钠edta-na2氢氧化钠arararararararar80%brararar1.4 试验设计1.4.1 试验准备 试验于2011年4月12号开始在安徽科技学院花卉基地进行。采用盆栽扦插苗，首先在日光温室的沙床内扦插；5月10日上盆移栽，每盆装800g洁净的河沙，盆里垫细网防止沙子从盆下漏掉。生长期间进行常规管理，施用适量的水肥，苗生长健壮之后待用。1.4.2试验设计 5个nacl浓度水平:0mmol/l，30mmol/l，60mmol/l，90mmol/l,120mmol/l, 4个ca(no3)2浓度水平:0 mmol/l,10mmol/l,20mmol/l,40mmol/l。总共20项处理，随机排列，做三次重复，盆栽，共60盆。1.4.3试验方法 2011年9月3号第一次进行处理，早上进行叶面喷施不同浓度的ca(no3)2溶液直到叶面滴水为止，下午用不同浓度的nacl盐溶液（溶剂是营养液）150ml进行浇灌，以后每次每盆定量施150ml盐溶液，3天后进行第二次处理，再隔3天第三次盐处理，处理后每两天取一次样，总取五次。1.5 测定方法41.5.1 测定sod（超氧化物歧化酶）的含量 采用氮蓝四唑法（nbt）法，称0.5g鲜样于预冷的研钵中，加1ml磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，研磨后再加缓冲液使终体积为5ml。取1.52ml于4000r/min下离心10min,上清液即为sod粗提取。取型号相同的试管，试管中加50l上清液(2支对照试管中各加磷酸缓冲液50l)，分别加3ml反应液，其中1支对照试管置于暗处，其余各管于4000lx日光下反应2030 min（要求各管受光情况一致，温度高，时间缩短，低时延长）。反应结束后，以不照光的对照管作空白，分别测定其它各管的吸光度值。计算公式：sod总活性（u/g）(（ack-ae）v)/(0.5ackwvt)sod比活力(unitsmg-1pr)= sod总活性/蛋白质含量1.5.2 测定pod(过氧化物酶)的含量 采用愈创木酚法，取0.5g鲜样，切碎，放入研钵中。加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆。将匀浆液全部转入离心管中，于3000rmp离心10min，上清液转入25ml容量瓶中。沉淀用5ml的磷酸缓冲液再提取2次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，低温下保存备用。用加热煮沸5min的酶液为对照，反应体系加入酶液后，立即于37。c水浴中保温15min，然后迅速转入冰浴中，并加入20%的三氯乙酸2.0ml终止反应，然后过滤（或5000r/min离心10min），适当稀释，470nm波长下测定吸光度。计算公式：pod总活性u/(g/min)（a470vt）/(wvst0.01) pod比活力（od470min-1g-1pr）总活性/蛋白质浓度1.5.3 测定可溶性蛋白的含量 采用考马斯亮兰g-250染色法，称取不同盐浓度处理的常春藤叶片各0.5g放入研钵中，加2ml的蒸馏水研磨成匀浆，转移到离心管中，再用6ml的蒸馏水分次洗涤研钵，洗涤液收集于同一离心管中，在室温下放置0.51h以充分提取，然后在4000r/min离心20min，弃去沉淀，上清液转入10ml的容量瓶，并以蒸馏水定容至刻度。另取2支具塞试管，分别吸取样品蛋白质提取液0.1ml，放入具塞刻度试管中，各加入5ml考马斯亮蓝g-250蛋白试剂，充分混合，放置2min后以空白为对照，用1cm光径比色杯在595nm的波长下比色。 计算公式：样品中蛋白质含量（mg/g鲜质量）=(xvtn)/(wvs1000)1.5.4 测定 mda（丙二醛）的含量： 称取不同盐浓度处理的常春藤叶片各0.25g，重复三次，加入5%tca5ml研磨后，剩下的匀浆在3000r/min离心10min。取上清液2ml，加0.67%tba2ml混合后在100。c水浴锅中煮沸30min，冷却后再离心一次，最后分别取上清液在450nm、532nm和600nm下测吸光度。计算公式：c（mol /l）=6.45（a532-a600）-0.56a4501.6 数据处理与分析 本论文文字和图表处理在word2003和excel2003下进行，试验数据用excel制图.2 结果与分析 21 不同处理对sod（超氧化物歧化酶）含量的影响图1 不同处理下超氧化物歧化酶含量变化情况 nacl浓度水平：a1：0mmol/l, a2:30mmol/l,a3:60mmol/l，a4：90mmol/l ca(no3)2浓度水平：b1：0mmol/l, b2:10mmol/l, b3:20mmol/l，b4：40mmol/l由图1（a1）可知，当植物没有受到胁迫时，随着ca(no3)2浓度的增加，sod含量先上升然后下降，这说明低浓度的ca(no3)2能促进生长而高浓度却抑制生长。由a2、a3和a4可知，当没有加入ca(no3)时，随着浓度的变大，逐渐呈下降趋势，但是随着ca(no3)2的加入，sod含量逐渐上升尤其当nacl的浓度在60mmol/l，钙的缓解效果更佳明显，当nacl的浓度为90mmol/l时，常春藤受到的盐胁迫严重，随着ca(no3)2的加入，不能起到缓解作用，但是随着天数的增加，常春藤对盐胁迫的程度逐渐有自身的调节作用。22 不同处理对pod（过氧化物酶）含量的影响过氧化物酶( pod)是一类由多基因编码含血红素的糖蛋白。它在清除 h2o2、 生长素谢、 木质素和木栓质形成、 抗病性、 抗盐性、 细胞死亡和细胞伸长等一系列生理过程中均具有重要的作用5。图2 不同处理下过氧化物酶含量变化情况nacl浓度水平：a1：0mmol/l, a2:30mmol/l,a3:60mmol/l，a4：90mmol/l ca(no3)2浓度水平：b1：0mmol/l, b2:10mmol/l, b3:20mmol/l，b4：40mmol/l由图2（a1）可以看出，当植物没有受到盐胁迫时，随着ca(no3)2浓度的增大，pod的含量总体呈上升趋势，但是随着天数的增大，pod的含量总体呈下降趋势，由图a2、a3和图a4可知，当没有加ca(no3)2时，随着nacl浓度增大增大，pod含量先上升然后下降，说明植物受到影响，但当加入不同浓度ca(no3)2时，植物体内pod的含量总体呈上升趋势，特别是ca(no3)2浓度为60mmol/l时，缓解效果特别明显。当nacl浓度为90mmol/l时，植物盐胁迫比较严重，加入ca(no3)2时不能起到缓解作用，然而随着天数的增加，pod的含量总体呈上升，说明盐胁迫随着天数的增加，逐渐得到缓解。2.3 不同处理对可溶性蛋白含量的影响图3不同处理下可溶性蛋白含量变化情况 nacl浓度水平：a1：0mmol/l, a2:30mmol/l,a3:60mmol/l，a4：90mmol/l ca(no3)2浓度水平：b1：0mmol/l, b2:10mmol/l, b3:20mmol/l，b4：40mmol/l由图3（a1）可知，常春藤在没有受到盐胁迫时，随着加入ca(no3)2浓度的变大，其可溶性蛋白含量先上升然后下降，说明低浓度的ca(no3)2对植物的生长有利而高浓度却抑制其生长。由图a2、a3和a4可知，没有ca(no3)2的加入，随着nacl的浓度的增大，可溶性蛋白含量逐渐下降，随着ca(no3)2的加入，可溶性蛋白含量逐渐上升，特别当nacl的浓度为60mmol/l时，加入ca(no3)2对常春藤有缓解作用，当ca(no3)2的浓度为20mmol/l对植物的缓解效果更加明显。由图a2和a3可知，可溶性蛋白含量先上升然后下降，这说明当加入ca(no3)2，随着天数的增加，钙对盐胁迫的缓解作用逐渐减弱，到第四天时，钙对常春藤盐胁迫的缓解作用最佳效果。2.4 不同处理对mda（丙二醛）含量的影响丙二醛(mda) 是膜脂过氧化作用的主要产物之一, 一般认为在植物体内积累是活性氧毒害的表现, 其含量是判断膜脂过氧化程度的一个重要指标 6 。通常利用它作为脂质过氧化的指标，表示植物对逆境条件的反映强度，通过测定丙二醛含量就能反映出细胞膜系统受害情况和抗逆性情况。由图4可知，常春藤在盐胁迫和缓解盐胁迫的mda含量变化情况。表现为随着nacl胁迫程度加重，mda含量总体呈现上升趋势;由a1图可知，在同一nacl浓度下,随着ca(no3)2浓度在一定范围内的加大，mda含量总体呈现下降趋势。由a2、a3图可知，随着nacl溶液的升高，加入ca(no3)2溶液，丙二醛含量有所下降，说明ca(no3)2溶液起到缓解作用。而且当nacl浓度为90mmol/l时,从a4图可知， ca(no3)2无法起到有效的缓解作用。nacl浓度在30mmol/l-60mmol/l时，随着天数的增加，到第四天时，适宜浓度的ca(no3)2对盐胁迫的缓解作用比较明显。3讨论与结论植物体内的可溶性蛋白质大多是参与各种代谢的酶类，测其含量是了解植物总代谢的一个重要指标。该试验结果显示，盐胁迫同样使常春藤叶片可溶性蛋白质含量下降，添加外源ca(no3)2后，常春藤叶片中可溶蛋白质含量明显增加，在ca(no3)2浓度为20 mmol/l时达到最佳效果。盐渍环境下，植物体内活性氧代谢的平衡受到影响，活性氧的产生增加，从而引起膜脂过氧化作用，而丙二醛(mda)是膜脂过氧化作用的主要产物之一7。在盐胁迫下，植物体内mda含量随着胁迫程度的加重明显增加，施加钙能抑制盐胁迫下植物体内mda的积累，说明钙能抑制膜脂过氧化作用，从而减轻膜脂过氧化对细胞的伤害8。该试验中，在nac1 胁迫下，常春藤叶片中mda 含量明显增加，而添加了不同浓度的ca(no3)2处理中，常春藤叶片中mda含量均有不同程度的减小。这说明施加外源钙能抑制常春藤叶片中mda的积累，从而增强常春藤在盐逆境下的适应性。高盐环境将诱导植物体内活性氧( ros)的产生,如超氧阴离子(o2-)、过氧化氢( h2o2)和羟自由基(oh-)9,10.而植物细胞内存在两条抗氧化途径清除ros危害,分别是酶促和非酶促10.其中超氧化物歧化酶( sod )、过氧化物酶(pod)属于酶促系统的两个重要组成部分.sod 可以清除活性氧自由基,防止膜质过氧化,pod可使体内某些氧化酶的毒性产物h2o2分解并阻止其对膜脂的攻击而发生过氧化作用10,11。该实验中，当没有加入ca(no3)2时，pod和sod含量随着nacl浓度的增大逐渐变小，但是随着天数的增大，pod和sod逐渐增大，说明随着天数的增加，使常春藤对盐胁迫有缓解作用。当加入ca(no3)2时，sod和pod含量逐渐上升，说明钙对常春藤盐胁迫有缓解作用，当nacl浓度为60mmol/l时，20mmol/l对常春藤的缓解作用最佳明显。而高浓度nacl（120mmol/l）使植物致死，ca(no3)2对浓度为90mmol/l的nacl的缓解作用不明显。致谢本毕业论文是在安徽科技学院生命科学学院园艺教学组张雪平老师的指导下完成的。张老师在整个论文指导和试验过程中给我的帮助很多，我由衷的感谢。在这里特此感谢张老师，还要感谢在实验过程中给予我无私帮助的各位同学。值此特向他们表示诚挚的谢意！参考文献：1 zhu j k. plant salt tolerance j. trends in plant science, 2001,6(2):6671.2 何龙飞，沈振国，刘友良.铝胁迫下钙对小麦液泡膜功能和膜脂组成的影响j.南京农业大学学报，2000，23(1)：10-13.3 冯文新,张宝红. 钙处理对盐胁迫下大豆种子萌发及其生理生化指标的影响j . 大豆科学,1997 , 1(1) :48.4 王学奎.植物生理生化实验原理和技术m.2版.北京：高等教育出版社，2006.5.5 毛桂莲,郑国琦,章英才,周孝程。不同钙盐对nacl 胁迫下枸杞愈伤组织耐盐性的影响j. 干旱地区农业研究,25(1)：131-1346giannopolitis c n , ries s k. superoxide dismutase i. occurrence inhigher plants. plant physiol , 1977 , 59 : 309314）7 赵可夫. 植物抗盐生理m. 北京: 中国科学技术出版社,1993:234-235.8 刘峰,张军,张文吉.氧化钙对水稻的生理作用研究j.植物学通报,200l,18(4):490-495.9 wang x m,ma y y,huang c h,et al. glucose一6一phosphate 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