淀粉液化芽孢杆菌抗菌脂肽发酵培养基及发酵条件的优化.pdfVIP

中国农业科学2 0 0 8 ， 4 1 ( 2 ) ： 5 3 3 5 3 9 S c i e n tia ARr i c ul t u r a S i n i c a 淀粉液化芽孢杆菌抗菌脂肽发酵培养基及发酵条件的优化 方传记，陆兆新，孙力军，别小妹，吕凤霞，黄现青 ( 南京农业大学食品科技学院，南京 2 1 0 0 9 5) 摘要：【 目的】提高淀粉液化芽孢杆菌 ( B a c i l l u s a m y l o l i q u e f a c i e n s ) 发酵产脂肽类抗菌物质的产量。【 方 法】采用 P l a c k e t t B u r m a n D e s i g n对影响 显 a m y l o l i q u e f a c i e n s E S 一 2 4产脂肽类抗菌物质产量的 1 3 个因子进 行筛选，在筛选结果的基础上，再运用 U n i f o r m D e s i g n( 均匀设计 )对关键 因子的最佳水平范围进行研究，通过 回归方程求解得到最高产量时各关键因子的最优组合。 【 结果】影响抗菌物质产量的关键 因子为葡萄糖、L 一 谷氨 酸钠、转速和温度；获得最佳产量时关键因子的最优组合为：葡萄糖( 4 2 g L ) 、L 一 谷氨酸钠 ( 1 4 g L 。 ) 、温度 ( 2 7 )、转速 ( 2 0 0 r m i n )，在此条件下，产量从优化前的4 8 4 g L 提高到 了6 7 6 g - L ，增长 了3 9 7 。 【 结论】 丑 a m y l o l i q u e f a c i e n s M S 一 2 4抗菌脂肽发酵培养基筛选与优化的过程 中，采用 P l a c k e t t B u r m a n D e s i g n和 U n i f o r m D e s i g n相结合的方法，效果显著，经济有效。 关键词：淀粉液化芽孢杆菌；抗菌脂肽；发酵；优化；均匀设计 Op t i mi z a t i on o f F er me n t a t i on Te c hn o l o g y f or L i p o p e p t i d e s Pr o du c i n g Ba c t e r i a Ba c i l l u s amy l o l i q u ef a c i e n s ES- -2- 4 F A NG C h u a n - j i ， L U Z h a o x i n ， S U N L i j u n ， B I E X i a o - me i ， L O F e n g - x l。 a ， HU ANG X i a n - q i n g ( C o l l e g e o f F o o d S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y , N a n j i n g A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y , N a n j i n g 2 1 0 0 9 5 ) A b s t r a c t ： O b j e c ti v e R e s e a r c h t e c h n o l o g y w a s e x p l o r e d i s t o i n c r e a s e t h e y i e l d o f l i p o p e p ti d e s p r o d u c e d b y b a c t e r i a B a c i l l u s a m y l o l i q ru e f a c i e n s E S 一 2 4 Me thod P 1 a c k e t t B u r ma n D e s i g n w a s u s e d t o e v a l u a t e the e f f e c t o f the t h i r t e e n f a c t o r s I n the f o l l o wi n g p h a s e o f the o p t i mi z a ti o n p r o c e s s ，Un i f o r m De s i g n wa s a p p l i e d t o g e t the o p t i mu m c o mp o s i ti o n o f the c r u c i a l f a c t o r s Re s u l t By s tati s ti c al a n aly s i s ， the s i g n i fi c a n t f a c t o r s a ffecti n g the y i e l d o f the ant i mi c r o b i al s u b s t a n c e we r e d e r mi n e d a s f o l l o ws ： g l uc o s e ，L mon os od i u m g l ut a ma t e ，t e mp e r a t u r e，r o t a t e d s p e e dAnd th e op timal c omp os i t i o n wa s 4 2 g- L- gl uc o s e ， 1 4 g- L。 L mo n o s od i u m g l u tama t e ， 2 7 “C an d 2 0 0 r mi n Th e p r o d u c ti o n o f the an t i mi c r o b i al s u b s t an c e i n c rea s e d f r o m 4 8 4 g - L t o 6 7 6 g L - ， wh i c h wa s 3 9 7 hig h e r than tha t o f the c o n t r o 1 Co n c l u s i o n P l a c k e t t Bu rm an d e s i g n and Umf o rm De s i g n we r e s i mu l t a n e o u s l y u s e d i n the o p ti mi z a ti o n o f the f e rm e n ta t i o n o f l i p o p e p t i d e s p r odu c i n g b a c t e r i a B a m y l o l i q u e f a c i e n s E S 一 2 4 ， w h i c h w a s p r o v e d t o b e e f f e c ti v ean dec o n o mi c a1 K e y wo r d s ： B a c i l l u s a m y l o l i q u e f a c i e n s ； L i p o p e p fi d e s ； F e rm e n ta ti o n ； Op ti mi z a ti o n ； Un i f o rm D e s i g n 0 引言 【 研究意义】细菌耐药性问题日趋严重，对抗药 性革兰 氏阳性病 原菌具有显著抗性 的脂肽 类抗 生素 】 成为人们研究 的焦点 。芽孢杆菌属 ( B a c i l l u s )的细菌 能够产生多种抗菌物质，包括脂肽类、肽类、磷脂类、 类噬菌体颗粒和细菌素等。其中脂肽类抗菌物质包括 表 面活性 素 ( s u r f c a t i n )、伊 枯草菌素 ( i t u r i n )和芬 荠素 ( f e n g y c i n )三大类L 2 J ，具有抗细菌 、真菌、病毒 和支原体的功能 3 】 ，在生物医药方面具有重要的应用 价值 。此外 ，抗菌脂肽在石 油工业 、食品、化妆 品和 农业上也有广泛 的应用 3 I4 】 。然而，较高的生产成本和 收稿日期：2 0 0 6 - 0 8 2 4 ：接受日期：2 0 0 6 1 1 - 0 3 基金项目：江苏省高新技术项目 ( B G 2 0 0 3 3 1 1 ) 作者简介：方传记 ( 1 9 8 1 一 )，男，安徽淮南人 ，硕士，研究方 向为发酵工程。T e l ：0 2 5 8 4 3 9 5 5 7 2 ：E - ma i l ：2 0 0 4 1 0 8 0 1 5 a u e d u c a 。通讯作者陆兆 新 ( 1 9 5 7 - )， 男， 江苏无锡人， 教授 ， 研究方 向为酶工程、 食品生物技术。 T e l ： 0 2 5 - 8 4 3 9 6 5 8 3 F a x ： 0 2 5 8 4 3 9 6 5 8 3 ： E - ma i l ： f mb n j a u e d u c a 维普资讯 5 3 4 中国农业科学 4 l 卷 较低的产量限制了抗菌脂肽的工业化生产，因此寻找 能够降低生产成本、提高抗菌脂肽产量的方法是目前 迫切需要解决的问题。 【 前人研究进展】抗菌脂肽 的 生物合成受发酵培养基组分和发酵条件的影响【 。许 多试验证明碳源、氮源和微量元素在抗菌脂肽生产的 过程中起着关键作用，尤其是微量元素，如 F e 2 + 和 Mn 2 + 。最新的研究表明，适量的添加 F e 和 Mn 能够 显著提高抗菌脂肽产量【 6 7 】 。除此之外 ，发酵条件如 p H、温度、转速和通气量也能够影响抗菌脂肽的生 产【 5 】 。 一般在优化过程中常采用数理统计的试验方法， RS e n 等【 8 9 】 采 用 响应 曲面法( r e s p o n s e s u rf a c e me t h o d o l o g y ) 分别对影响 s u r f a c t i n产量 的关键培养 基 组分、发酵条件 以及种龄和接种量进行了优化研究。 We i 等【 l 川 则通过 T a g u c h i me tho d( T a g u c h i 法)来优化 发酵培养基中微量元素的含量， 达到提高产量的目的。 【 本研究切入点】国内外对枯草芽孢杆菌 ( B a c i l l u s s u b t i l i s )发酵的优化研究较多，而系统地对淀粉液化 芽孢杆菌 ( B a c i l l u s a m y l o l 幻u e f a c i e n s )液体深层发酵 优化的研究鲜有报道。 【 拟解决的关键问题 】均匀设 计 ( U n i f o r m D e s i g n )具有显著降低试验组数、能够适 合多因素多水平试验设计的优点【 】 ，因而可以较好解 决上述 问题 ，本研究采用 U n i f o r m D e s i g n法对 B a m y l o l i q u e f a c i e n s液体深层发酵产抗菌脂肽类抗菌物 质 ( f e n g y e i n类 )的发酵工艺进行系统研究，通过合 理的试验设计来提高抗菌脂肽产量，减少试验规模， 以达到提高产量、降低成本的目标。 1 材料与方法 1 1 供试菌株及培养基 本试验于 2 0 0 6年 3月至 7月在南京农业大学进 行， 供试菌株淀粉液化芽孢杆菌( B a m y l o l i q u e f a c i e n s ) E S 2 4( 南京农业大学食品科技学院酶工程实验室保 藏)：种子液体培养基：牛肉浸膏 5 0 g ，蛋白胨 1 0 0 g ，酵母膏 5 0 g ，Na C 1 5 0 g ，葡萄糖 1 0 0 g ，蒸馏水 1 0 0 0ml ， p H 7 0 ； 基础发酵培养基：葡萄糖 2 0 0 g ，L - 谷氨酸钠 5 0 g， MgS O40 5 g， KC10 5 g， KH2 PO4 1 g， F e S O40 1 5 mg ， Mn S O 4 5 0 mg ， C u S O 4 0 1 6 m g ， 蒸馏水 1 0 0 0 ml ， p H 7 0。 1 2 培养方法 取斜面置于 3 7 “ C培养箱活化 2 4 h ， 从新鲜斜面挑 取一环接种于种子培养基 ( 2 5 0 ml摇瓶，装液量 5 0 m1 )，摇床 ( 2 8 “C， 1 6 0 r mi n )培养 24 h ，从种子液中 以一定的接种量接种于发酵培养基 ( 2 5 0 ml 摇瓶，装 液量 5 0m1 )，在一定的条件下 ( 表 1 、表 2 )摇床中 培养 3 6 h 。 1 3 脂肽类抗菌物质的提取 提取的方法参考文献【 1 2 】 并作了一定的修改：将 发酵液于 1 0 0 0 0 g冷冻离心 1 5m i n ，取 1 ml 上清液 置于 2ml 离心管中，真空浓缩干燥 ( 2 5 “C)，在干燥 样品中加入 1 ml 7 0 甲醇水溶液提取 2 0 m i l l ， 1 0 0 0 0 Xg 冷冻离心 5 m i n ，离心获得甲醇提取液，提取液再经 0 2 2岬尼龙树脂过滤，过滤后的滤液即脂肽类抗菌 物质的粗提液，保存在 4 C冰箱待用。 1 4 脂肽类抗菌物质含量的测定 定量的方法参考文献【 1 3 】 并进行了一定的修改： 脂肽 类抗 菌物质通 过 H P L C ( Cl 8 ，4 6 m mX2 5 0 mm0 5 m，AG I L E N T 1 1 0 0 s e r i e s )进行分析检测， 流动相为水和 乙腈 ，梯度洗脱 ( 0 N5 0 m i n ，H2 0 1 0 0 N0 ， A c e t o n i t r i l e 0 N 1 0 0 ) ， 流速为 0 2 ml - mi n 一 ， 紫外检测波长 2 2 5 n m ( G1 3 1 4 A VWD，J P 2 4 0 2 0 5 1 3 ， A G I L E N T)。 脂肽类抗 菌物质 纯品可以通 过 H P L C层 析获得 。峰面积 ( )和抗菌物质浓度 ( ) ， )的标准 曲线 为：y = 4 E 0 5 x 0 0 0 0 4 ( 尺 = 0 9 9 9 6 )。通过 该方 程可以计算出脂肽类抗菌物质的质量浓度 ( g L )。 1 5 试验设计 1 5 1 影 响 发 酵工 艺 的关键 因子 筛 选 采 用 P l a c k e t t B u r ma n D e s i g n 1 4 分别对影响发酵工艺的 l 3 个因子进行筛选， 其中X l X 8 为发酵培养基组分， X 9 一 X 1 3 为发酵条件。试验设计和数据分析皆采用 J MP软 件 ( v e r s i o n 4 0 5 ，S AS I n s t i t u t e I n c )，每组试验 3次 重复，结果取平均值。试验设计及结果见表 1 。 1 5 2 发酵工艺的优化设计 采用均匀试验设计表 U1 5 ( 1 5 5 2 ) 对筛选出的4个关键因子： 葡萄糖 ( 1 ， 1 5水平 )、L 一 谷氨酸钠 ( x 2 ，1 5水平 )、温度 ( x 3 ，5 水平 )、转速 ( x 4 ，5水平 )进行混合均匀设计 。各 因 子的取值范围分别为：0 1 4 2 g L 一 、0 奶1 4 g L一 、2 6 3 8 、1 2 0 r l mi n x 4 2 0 0 r rai n ，响 应值为脂肽类抗菌物质含量。试验结果为 3次重复的 平均值，数据的分析和二次多项式回归方程的建立均 采用 D P S数据处理系统【 】 。 均匀设计因素水平编码见 表 2 。 2 结果与分析 2 1 影响抗菌脂肽产量的关键 因子 通过 J MP软件 ( v e rsi o n 4 0 5 ，S A S I n s ti t u t e Inc ) 维普资讯 2期 方传记等：淀粉液化芽孢杆菌抗菌脂肽发酵培养基及发酵条件的优化 5 3 5 表 2 均匀设计因素水平编码表 Ta b l e 2 F a c t o r s a n d l e v e l s o f t h e Un i f o r m De s i g n U1 5 ( 1 5 5 2 ) 试验编号T r i a l No 葡萄糖G l u c o s e x 1 L - 谷氨酸钠L - mo n o s o d i u m g l u t a ma t e x 2 温度T e mp 却 转速 R o t a t e d s p e e d弘 维普资讯 一5 3 6一一 中国农业科学 4 l 卷 对 P l a c k e R - B u r ma n D e s i g n设计的试验 ( 表 2 )进行数 据分析，通过方差分析得到影响抗菌脂肽产量的各因 素的效应评价结果 ( 表 3 )。 共有 5个因素达到极其显著水平 ( P 0 0 1 )，显 著程度从大到小依次为：装液量 ( P = 0 0 0 0 2 )、葡萄 糖 ( P - O O 0 1 4 ) 、 转速 ( P = 0 0 0 1 8 ) 、 温度 ( P = 0 0 0 4 3 ) 、 L 谷氨酸钠 ( P = o O 0 5 1 )，其它各因素均不显著 ( P 0 0 5) 。 因 此 ， 以 上5 个 因 素 为 影 响 表 3 各因素的效应评价 Ta b l e 3 E ffe c t t e s t so f t h ef a c t o r si n f l u c i n gt h ey i e l do f l i p o p e p t i d e s a m y l o l i q u e f a c i e n s E S 一 2 4产脂肽类抗菌物质发酵工艺 的关键因子。从各因素对抗菌脂肽的影响来看 ( 图)， 葡萄糖 ( X 1 )、L 谷氨酸钠 ( X 2 )、转速 ( x1 2 )与抗 菌脂肽的产量均呈正相关， 而温度( x 9 ) 和装液量( X 1 ) 呈负相关。本试验中低水平 ( 一 1 )和高水平 ( 1 )的金 属离子浓度对抗菌脂肽产量的影响很小，说明这些因 素的水平范围接近最优值。 2 2 发酵工 艺的优 化 t J 卜 H 壬 _ _ 卜 畸 卜 州 卜 一 - l + _ _ t 一 r 。 I I I I l I I I I I I I I l I I l - l I I I I I I I I - - I I l I I - I l 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 - 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 - 1 0 1 1 0 1 - 1 0 1 1 0 1 - 1 0 1 局 五 噩 局 局 。 l 2 3 图 抗菌脂肽产量预测趋势图 F i g P r e d i c ti o np r o f il ef o r they i e l do f fi p o p e p fi d e s 2 2 1 均匀设计及其回归方程的建立均匀试验设 计及其响应值见表 4 ，所使用的二次多项式模型为： 4 Y = 属+ 砒 + + P ( 1 ) i ffi l l S i S j 4 利用D P S数据处理软件对表4中的数据进行二次 多项式逐步回归分析，得到方程： y =3 5 2 4 7 0 2 8 6 x2 1 5 8 6 x 3 0 0 7 3 x 4 + 0 0 0 0 3 xl Z - 0 01 5 2 +0 01 9 5 x3 +0 O 0 5 x l x 2 +O 0 03 x 2 x 4 + 0 0 01 5 x 3 x 4 R2 _-0 9 5 8 ： ： 1 8 1 5 7 ， P - 0 0 D 2 6 ( 2 ) 方差分析的结果 ( 脚 0 0 2 6 ) 说明回归方程极其显著； 相关系数为 0 9 5 8 ， 表明该方程的预测值与实际值之间 拟合度好 ( 表 5 )，能够很好体现脂肽类抗菌物质生 产过程中各因素与产量之间的关系。因而，选取该方 程 为优化所用 的方程 。 2 2 2 最优发酵工艺 利用上述建立的回归方程【 方 程 ( 2 )】 ，通过 D P S软件处理得出最优发酵工艺为： 葡萄糖 4 2 g L 、L - 谷氨酸钠 1 4g L 、温度 2 7 、转 速 2 0 0 r mi n ，其它各因素的取值分别为：Mg S 0 4 0 5 维普资讯 培养基中其它组分为：Mg S O 4 0 5 g L 、KC 1 0 5 g -L 、K H2 P O4 1 g L 一 、F e S O 4 O 1 5 mg L 、Mn S O 4 5 0 mg L 、C u S O 4 0 1 6 mg L ，p H 7 0 ，接种量 4 ，装液量 5 0 ml 2 5 0 ml ，发酵时间 3 6 h Th eo t l l e re l e me n t s o f t l lef e nn e n t a _t jo nme d i a a r e a sf o l i o ws ： Mg S O4 0 5 g - L。 1 g -L一、KC 1 0 5 g - L一、KH2 PO41 g L 、F e S O40 1 5mg L- 1 、 M n SO4 5 0mg L- l 、 Cu S O4 0 1 6 mg L p H 7 0 ， i n o c u l u m s i z e 4 ， b r o t h c o n t e n t 5 0 ml 2 5 0 ml ， f e r me n t a ti o nt i me 3 6 h 表 5 抗菌脂肽产量的实测值和模型预测值 Ta b l e 5 Ac t u a l a n dp r e d i c t e dv a l u e s f o r t h e y i e l do f l i p o p e p t i d e s g L、 KC1 0 5 g L- l KH2 PO4 1 g L、 Fe S O4 0 1 5 mg L、 Mn S O 4 5 0 mg L 、C u S O 4 0 1 6 mg L ，p H 7 0 ，接种 量 4 ，装液量 5 0 ml 2 5 0 ml ，摇床中培养 3 6 h 。此时 获得 的最 高产量 为 6 7 6 g L ，而使用对 照 ( 基础发酵 培养基见 1 1 ，发酵条件：温度 2 8 、转速 1 6 0 r ra i n ， 接种量 4 ，装液量 5 0 ml 2 5 0m l ，摇床中培 养 3 6 h ) 获得 的产量为 4 8 4 g L ，优化后 比优化前产量提高 了 3 9 7 。 3 讨论 本次试验 中，装 液量 ( P = 0 0 0 0 2 )对抗 菌脂肽 产 量的影响程度最大， 并且具有负效应， 即装液量越小， 越有利于抗菌脂肽的产生。装液量反映的是通气量的 多少 ，也就是说通气量 是影 响抗 菌物质产 量的重 要因 素；据研究 1 6 1 表明抗菌脂肽是通过非核糖体途径合成 的，由组件 ( mo d u l e s )组成 的多酶复合体催化 的，环 境因素对抗菌脂肽合成的影响很大，本次试验也证明 了这一点。其次为葡萄糖 ( P - 0 0 0 1 4 )，葡萄糖是发 酵培养基中惟一的碳源，碳源是脂肽类抗菌物质脂肪 酸链合成时所必需的 ，因而对脂肽类抗菌物质 的产量 也有较大的影响。在实际生产过程中，装液量不能太 低，否则会降低生产能力 ，基于上述原 因，在优化 的 过 程中最终只把葡萄糖、L 一 谷氨酸钠 、转速和温度 作 维普资讯 5 3 8 中国农业科学 4 1 卷 为影响产量的关键因子。 R S M ( 响应曲面法)是一种优化生物过程的综合 技术，能够对影响生物过程的因子水平及其交互作用 进行优化和评价，被广泛应用在发酵工程领域 ” 】 。近 些年来， 有关抗菌脂肽发酵优化研究的文献中， 研究 者们大都采用了响应 曲面法。笔者分别从优化效果和 试验规模，对 R S M 和 U n i f o r m D e s i g n进行了比较。 沈娟等 1 B 对 R S M 优化发酵培养基进行了研究，结果 表明通过优化， 产量从 1 3 0 g ml 提高到了1 4 9 g - m l ， 产量提高了 1 4 1 。而本研究中采用 U n i f o r m D e s i g n 优化后，产量从优化前的 4 8 4 g - L - 提高到了 6 7 6 g - L ，增长了 3 9 7 ，沈娟等【 l B 试验设计中，5因素 5 水平需要 3 2组试验，R a mk r i s h n a 与 S e n 5 在 s u ff a c t i n 的生产过程中采用 R S M ( 响应曲面法) 对发酵条件优 化过程中，4因素 5水平需要 3 O组试验，而利用均匀 设计安排试验 4因素 1 5水平仅用了 1 5组试验，试验 次数减少了一半。由此可见，与 R S M 相比，U n i f o r m De s i g n不仅试验规模更小，而且效果更显著，达到了 提高产量，降低成本的目标。 4 结论 本文采用 P l a c k e t t B u rm a n De s i g n 和均匀设计相结 合的方法对 置 a m y l o l iq u e f a c i e n s E S 2 - 4产脂肽类抗菌 物质的液体深层发酵工艺进行了优化，获得最高产量 时的液体深层发酵工艺为：葡萄糖 4 2 g - L 、 L 谷氨酸 钠 1 4 g 、Mg S O 4 0 5 g 、 KC 1 0 5 g L 、K H 2 P O 4 1 g - L、 Fe S O4 O 1 5 mg 、 M n SO4 5 0 mg L、 Cu S O4 0 1 6 mg ，p H 7 0 ，温度 2 7 、转速 2 0 0 r mi n ，接 种量 4 ，装液量 5 0 ml 2 5 0 ml ，摇床中培养 3 6 h ，此 条件下的产量为 6 7 6 g - L - 。 ，比优化前提高了3 9 7 。 此外， 通过试验表明P l a c k e t t B u r ma n De s i gn 和均匀设 计相结合的方法在优化发酵工艺时具有可行性。 1 1 A k i m R L a y b a k M J B a c t e r i c i d a l a c t i v i ti e s o f t wo d a p t o my c i n 【 2 】 reg i me m a g a i n s t c li ni c a l s t r a i n s o f g l y c o p e p t id e S ta p h y l o c o c c u s a u r e us， v a n c o my c in r e s i s t a n t E n t e r o c o c c usf a e c i u m ， an dmc t h i c i l l i n res i s t a n t S t a ph y l o c oc c u s a u r e u si s o l a t e si n an i n v i t r o p 】m皿 啕c c d y n a mi c mo d e l w i t h s ti mu l a t e d e n d o c a r d i al v e g e t a ti o n s A n t imi c r o b ial A g e n t s a n d C h e m o t h e r a p y ， 2 0 0 1 ， 4 5 ( 2 ) ： 4 5 4 - 4 5 9 Ko u mo u t s i C h en XH， He un eA， L i e s e g ang H Hi t z e mth G F mn k e 只Va t e r J ， Bo r r i s sR S t r u c t u r a l andf u n c ti o n a l c h a r a c t e riz a ti o no f g e n e c l u s t e r s d i r e c t i n g n o mi b o s o ma l s y n the s i s o f b i o a c t i v e c y c l i c l i pop e p ti d e s i n B a c i l l u s a m y l o l iq u e f a c i e n s s t r a i n s F Z B 4 2 J o u r n a l o f B a c t e r i o l o g y ， 2 0 0 4 ， 1 8 6 ( 4 ) ： 1 0 8 4 1 0 9 6 【 3 】 S ing h P C a me o t r a S S P o t enti a l a p p li c a t i o n s o f m i c r o b i a l s u r f act a n t s in b i o me d i c a l s c i e n c e s T r e n d s i n B i o t e c h n o l o gy ，2 0 0 4 ，2 2 ( 3 ) ： 1 4 2 1 4 6 4 】 Y e h M S ， We i Y H C h a n g J S B i o r e act o r d e s i g n f o r e ltha n c ! c a r r i e r - a s s i s t e d s u r f act i n p r o d u c t i o n wi th Bac i l l us s u b fi l i s Pr o c e s s Bi o c hemi s t r y ， 2 0 0 6 ， 4 1 ： 1 7 9 9 1 8 0 5 【 5 】 S e n R ， S wa mi n a t h an T A p p li c a ti o n o f res p o nse - s u rf a c e me tho d o l o g y t o e v a l u a t e the o p t i mu m e n v ir o n me n ta l c o n d i ti o ns for the e n h an c e d p r o d u c tio n o f s u r f act i n Ap pl l i e d Mi c r o b i o l o gy a n d Bi o t e c h n o l o gy ， 1 9 9 7 ， 4 7 ： 3 5 8 3 6 3 【 6 】6 We i Y H WangLF ， Ch ang J S ， Ku n g S S I d e n t i f i c a ti o n o f ind u c e d a c id i fic a tio n in i r o n e n r i c h ed c u l t u res o f Ba c i ll u s s u b t i l i s d u r i n g b i o s u r f act a n t f e r me n t a ti o n Jou r n a l o f B i o s c i e n c e a n d B i o e n g i n e e ri n g ， 2 0 0 3 ， 9 6 ( 2 ) ： 1 7 4 1 7 8 7 1 We i Y H C h u I M Mn 2 imp r o v e s p r o d u c ti o no f s u r f act i nb y B aci l l us s u b t il i s Bi o t e c h n o l o gy L e t t e r s , 2 0 0 2 ， 2 4： 4 7 9 - 4 8 2 【 8 】 S e n R R e s p o n s e s u r f ace o p t i mi z a t i o n o f the c ri ti c al me d i a c o mp o n e n t s for the p r o d u c t i o n o f s u r f acti n Jou r n a l of C hem i c a l T e c h n o l o gy a n d Bio t e c h n o l o gy ， 1 9 9 7 ， 68 ： 2 6 3 2 7 0 【 9 】 S e n R S w a m i n a t h a n T R e s po nse s u rfa c e mo d e l i n g and o p t i mi z a ti o n t o e l u c i d a t e an d an a l y z e the e ffe c t s o f ino c u l u m a g e an d s iz e o n s u ffact i n p r o d u c ti o n Bi oc he mi c a l En g i n e e rin g Jo u r n a l ,2 0 0 4 ，2 1 ： 1 41 1 4 8 【 1 0 】 We i Y H ， L a i C C ， C h ang J S Us ing T a g u c h i e x p e r i me n ta l d e s i gn me tho d s t o o p ti mi z e t r a c e e l e me n t c o mpo s i ti o n for e n h a n c e d s u r f a e ti n p r o d u c ti o n b y Ba c i ll u s s u b fi l i s ATCC 2 1 3 3 2 Pr oc e s s Bi oc he mi s t r y ， DOI ：1 0 1 0 1 p r o c b i o 2 0 0 6 0 7 0 2 5 【 l 1 】We n S H，Z h ang T ，T an T WOp t imi z a t i o n o f the a mi n o aci d c o mpo s i tio n in g l u t a t h i o n e f e r me n t a ti o n Pr oc e s s Bi oc he mi s t ry， 2 0 0 5 ， 4 0 ： 3 4 7 4 3 4 7 9 【 1 2 】S u n L J ，L u Z X ，B i e X M，L u F X， Yang S I s o l a ti o n and c h a r ac t e r i z a tio n o f a c o - p r o d u c e r o f f e n g y c i n s an d s u r f act i n s ， e n d o p h y d c B a c i l l u s a m y l o l i q u e f a c i e n s E S - 2 ， f r o m S c u t e l la r i a b a i c a l e n s i s Ge o r g i 删Jou r n a l of Mi c r o b i o l o g y a n d Bi o t e c h n o l o g y ， 2 0 0 6 ， DOI 1 0 1 0 0 7 I s 1 1 2 7 4 一 O O 6- 9 1 7 0 - 0 【 1 3 】 B i e X M， L u Z X， L u F X ， Z e n g X X S c r e e n i n g the ma i n f act o r s a ffe c t i n g e x t r a c tio n o f the an t i mi c mb i al s u bs t a nc e f r o m Bac i l l us s p f mb J u s