环境和食品中农药残留快速检测技术研究进展.pdfVIP

化学通报 2006年 第69卷 w085 环境和食品中农药残留快速检测技术研究进展 徐溢 张玉志 范伟 张剑 徐平洲 (重庆大学化学化工学院 重庆 400044) 摘 要 在对比分析国内外农残检测现状的基础上，综述了目前的农残快速检测技术，针对其中的 发展较好和极具潜力的发光检测法、 酶抑制技术、 免疫分析技术以及传感器技术进行了详细的介绍和评述。 阐述了化学发光和生物发光技术、酶抑制检测技术，酶联免疫分析法以及生物传感器技术的原理、特点以 及应用进展。通过对这些技术的发展趋势的展望，指出发光分析技术的发展重点是发光试剂的开发，生物 传感器技术的发展重点是酶源的选择以及仪器的商品化， 而酶分析、 免疫分析等技术的发展重点是稳定性、 准确性、重复性的提高等。 关键词 农药残留 快速检测 化学发光 酶联免疫分析法 传感器 Progresses of Rapid Detection of Pesticides Residue in Environmental and Food Samples Xu Yi, Zhang Yuzhi, Fan Wei, Zhang Jian, Xu Pingzhou (Chemistry and Chemical Engineering College, Chongqing University, Chongqing 400044) Abstract According to analysis and comparison of internal and overseas actuality of the pesticides residue detection, the techniques of rapid detection of pesticides residue are described and reviewed in this paper. The technical methodologies, which have been well developed and be of practical applications, such as chemiluminescence determination, enzyme inhibition, enzyme-linked immunoassay and sensor, are introduced and evaluated in detail. The principles, characteristics and application of these techniques including chemical chemiluminescence and biological chemiluminescence, enzyme inhibition, immunoassay containing ELISA, sensor especially biosensor and so on were discussed. The trends of these technical methodologies are also prospected. The exploitation of the chemiluminescence regents in chemiluminescence, the choice of the enzyme source and the commercialization of the apparatuses of the biosensor, and the improvement of stability, accuracy and repeatability of the enzyme inhibition and immunoassay should be the potential important fields in relative researches. Key words Pesticides residue, Rapid detection, Chemiluminescence, Enzyme-linked immunoassay, Sensor 由于农药的广泛使用以及在此过程中存在的不合理使用及滥用现象，导致农药在环境以及食物 中残留量严重超标，由此引起的农药中毒现象和在国际农产品贸易中引发贸易争端时有发生。随着 社会经济的发展和人类生活质量的提高，农残检测引起了人们越来越多的关注，发展可靠、灵敏、 快速、实用的农药残留快速检测技术是解决农残问题的前提1。传统的农药残留检测方法有比色法 和容量法等， 存在选择性差、 灵敏度低等缺陷； 近年来发展较快的仪器分析方法有毛细管电泳(CE)2、 毛细管气相色谱(CEGC)3、液相色谱质谱(LC-MS)4等，这些方法能有效准确地测定样品中农残 含量，但往往需要昂贵的仪器，需要专业人员操作，费时费力，不适合现场实时快速检测。国内外 均先后发展了一些简单实用的农残快速检测技术，其中国外在免疫快速检测、生物和电化学生物传 徐溢 女，39 岁，副教授，从事分析化学的教学及研究工作。E-mail: 重庆市重点自然科学基金和应用基础研究基金资助项目(8985, 90428148) 2006-01-19 收稿，2006-03-24 接受 化学通报 2006年 第69卷 w085 2 感器技术等方面取得了较快进展，已经有用于农残检测的酶标试剂盒等相关实用化的产品系列。而 国内这方面的研究正在起步，在“十五”国家“食品安全关键技术”重大科技专项中实施了“蔬菜中 农药、 硝酸盐、 亚硝酸盐和重金属残留的快速低成本检测仪器和方法研究”， 并已经取得阶段性进展， 研制了 FITT2001 型农药残毒快速检测仪，开发了有机磷农药残留双光路现场检测仪、FDFY-I 型亚 硝酸盐速测仪器、FDFY-II 型硝酸盐快速检测仪和铅注射式快速分离器和农药、硝酸盐、亚硝酸盐、 铅等残留系列速测试纸/卡等。 本文对目前已经有的和正在发展的农残快速检测技术进行了综述，尤其是针对其中发展较好和 极具潜力的发光检测法、酶抑制技术、免疫分析技术以及传感器技术进行了详细的介绍和评述。 1 发光快速检测法 1.1 化学发光法 化学发光(CL)是在一些特殊的化学反应中吸收了反应所释放的化学能而处于电子激发态的反应 中间体或反应产物由激发态回到基态时产生的一种光辐射。化学发光体系在农药特别是有机磷农药 的检测方面得到较好的应用，先后发展了基于乙酰胆碱酶抑制5、基于碱性磷酸酯酶催化6、基于 过氧化物与吲哚反应7、基于鲁米诺与过氧化氢反应8的检测方法。 王建宁9对化学发光检测方法在农药分析中的应用做了较为详细的介绍，用 FIA-CL 对敌敌畏 和甲基对硫磷进行了测定，对有关反应的动力学行为和反应机理进行了研究，并设计了相应的发光 分析系统，测定了敌敌畏的发光曲线，得到敌敌畏的检出限为 0.008g/mL，甲基对硫磷的检出限为 0.02g/mL8,10。化学发光体系检测农残灵敏度高，一般检出限远低于环境最低限量指标，其主要不 足为重现性较差，而且待测体系中杂质也会对结果产生较大影响。 1.2 生物发光法 在有关生命体系中，利用发光细菌对农残进行检测。发光细菌在正常的生活状态下，体内的荧 光素在有氧参与时，经荧光酶的作用会产生荧光。当受到外界因素的影响，如受化合物的毒性作用 时，发光减弱，减弱程度与毒物浓度呈线性相关关系。袁东星11,12等建立了一种用发光细菌快速检 测蔬菜中有机磷农药残留的方法，分析了发光菌对蔬菜中六种有机磷农药的响应情况，探讨了检测 空心菜中甲胺磷农药残留的最佳参数，并在随后引入了流动注射分析体系，以明亮发光杆菌作为污 染物毒性检测的指示生物，探讨了有机磷农药、酸、碱、酚等污染物对发光细菌的毒性作用，研究 了相关参数对农药降解的影响。 Stefano 等13对其它传统发光菌分析方法进行了改进， 并对农药及其 它部分有害物质进行了分析测定，简化了仪器的使用，提高了分析速度。发光检测方法稳定、快速、 简便、重现性较好，但发光细菌的获得存在一定的困难，使其应用受到了限制。 2 酶抑制快速检测法 酶抑制法“快速检测”农药残留依据的是：有机磷和氨基甲酸酯类农药能抑制昆虫的中枢和周 围神经系统中 Ach-E 的活性，造成神经传导介质乙酰胆碱酯酶的积累，影响正常传导，使昆虫中毒 致死，正常情况下，酶催化乙酰胆碱水解，其水解产物与显色剂反应，产生黄色物质，如果样品中 农药残留量较高时，酶的活性将被抑制，基质就不被水解，当加入显色剂时就不显色或颜色变化很 小14。 目前基于酶抑制法的原理检测农药残留的主要技术有酶片、酶膜生物传感器、试剂盒快速以及 检测仪等。美国 1958 年就已研制出称之为酶片的商品来检测有机磷农药，灵敏度为 0.110g/mL。 Sigma 公司也有类似的检测试剂盒出售，国内深圳也有生化公司正式生产和销售称为“农药速测卡” 化学通报 2006年 第69卷 w085 3 的产品。 宋茹等15研制了一种简易快速、可定性和半定量测定蔬菜中常用的有机磷农药及氨基甲酸酯类 农药残留的快速检测方法，该方法准确度高，对所测定的各种农药有较低的检出限。何亦等16以戊 二醛为交联剂，制备了一种基于乙酰胆碱酶的酶膜生物传感器，将其用于毒死蜱的检测，并考察了 各种因素对传感器工作过程的影响，该酶膜传感器可定量检出 1.6420.52mg/kg 的毒死蜱。酶抑制 法最大的优点是操作简便、速度快和不需要昂贵的仪器，特别适合现场检测以及大批样品的筛选检 测，易于推广普及。但是灵敏度偏低，重复性、回收率还有待提高。可用于控制含较高农药残毒的 蔬菜上市，但酶抑制法的显色体系不稳定，随反应时间长短而有所差异，且检测限高，容易漏检， 不能定性和定量，酶活性也易受外界干扰而影响检测结果。 3 免疫分析快速检测法 免疫分析法(Immunoassay，IA)是一种以抗体作为生物化学检测器对化合物、酶或蛋白质等物质 进行定性和定量分析的分析技术，免疫分析方法很多，能用于农残快速检测的主要有：荧光免疫测 定技术、放射免疫测定技术以及酶免疫测定技术等。目前在农残快速检测中应用最多的酶免疫测定 技术是酶联免疫分析技术1719。 酶联免疫分析法(Enzyme-linked immunoassay， ELISA)的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗 体的酶标记，根据酶反应底物显色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放 大了免疫分析的结果，使测定具有极高的灵敏度，在应用中一般采用商品化的试剂盒进行测定，其 特点是将抗原或抗体制成固相试剂，在与标本中抗原或抗体反应后，只需经过固相的洗涤，就可以 达到抗原抗体复合物与其它物质的分离，简化了操作步骤20。邓安平等21,22曾使用酶联免疫吸附分 析法测定了水样和土壤中的阿特拉津，检出限分别为 0.0180.022g/L 和 0.0180.24g/L。Leif 等 23曾建立了一种灵敏而精确地检测土壤中敌草腈的代谢产物 BAM 的方法，检出限可以达到 0.02g/L。酶联免疫技术的样品前处理简单，纯化步骤少，大样本分析时间短，既适合于实验室检 测，又可用于现场筛选，具有分析速度快、经济、简便的特点，但抗体制备不易，而且不能完成多 种农药同时检测，限制了该技术的应用。 农药残留单克隆抗体免疫分析法是将单克隆技术引入酶免疫分析中建立起来的方法，其实质还 是利用抗体与抗原的特异性反应来检测农残含量，方法的核心是利用单克隆技术制备高特异性的抗 体。近年来，单克隆技术在农药免疫分析法中得到了广泛的应用，Lee 等24利用此技术建立了对有 机磷农药二嗪农的分析方法，有较低的检出限和较高的选择性，而且交叉反应可以忽略不计； Gonzlez-Martnez等25设计了可以测定有机氯农药毒死蜱的代谢产物的基于单克隆抗体技术的免疫 传感器自动分析系统(图 1)，对样品的检出限可以达到 1g/L 级别以下；Leif等26采用单克隆抗体免 疫分析技术建立了测定了莠去津等三类三嗪类农药的代谢物，检出限可以达到 0.01g/L，该方法可 直接用于水样中三种农药代谢物的测定而不需要样品前处理过程，从而缩短了分析时间；Antonio 等27利用单克隆酶免疫分析技术测定了黄瓜和草莓中的西维因等三种氨基甲酸酯类农药，并与传统 的 HPLC 技术进行了比较，相同条件下回收率较后者高，而且省去了样品净化步骤，省时省力。单 克隆抗体免疫分析有其独特的优势，杂交瘤技术的应用可以得到大量性质均一具有高特异性的单克 隆抗体 McAb，不易产生交叉反应，使检测具有较高的特异性，且不易被无关的抗体干扰，有较高 的灵敏度。McAb 可以用于制备免疫分析试剂盒，可以使操作简便、快速；但其不足也是显而易见 的，有些农药小分子不能制备出 McAb，另外，从制备人工抗原到纯化获得 McAb 周期长，操作也 不够简单28,29。 化学通报 2006年 第69卷 w085 4 图 1 免疫传感器检测流路系统示意图 Fig.1 Scheme of the immunoassay flow manifold 1 注射器模块； 2 阀模块； 3 计算机； 4 免疫检测系统； 5 荧光计； 6 积分器和记录仪 4 传感器快速检测法 生物传感器(Biosensor)是由一种生物敏感膜和电化学转换器两部分紧密配合、对特定种类的化 学物质或生物活性物质具有选择性和可逆响应的分析装置，其特点是集生物化学、生物工程、电化 学、材料科学和微型制造技术于一体，是一个典型的多学科交叉产物。按其生物功能，可分为电位 型和电流型酶传感器(Enzyme Biosensor)、免疫传感器(Immuno sensors)、微生物传感器(Microbial sensor)等。 Dzyadevych 等30曾利用基于乙酰胆碱酯酶抑制技术的电化学生物传感器。 实现了对有机磷和氨 基甲酸盐类农药的检测，并通过对比指出，与传统技术相比，该技术更合适对环境中有害物质的快 速检测。Mar 等31利用免疫类传感器对 DDT 的测定进行了深入的研究。生物传感器技术具有微型 化、响应速度快、样品用量少并可以插入生物组织或细胞内的特点，可实现超微量在线快速跟踪分 析，在农药残留分析上得到了广泛的应用，不足之处是酶类传感器受环境特别是温度影响大，且寿 命短，不易保存，准确性和重复性比较差，检测种类也比较单调。 除生物传感器外，近年来黄行九等3234利用化学传感器二氧化锡气体传感器实现了对乐 果、敌百虫、甲胺磷等多种农药残留的动态检测及定性定量分析，并解决了传统二氧化锡气体传感 器方法中存在的稳定性和选择性差的问题，为实现对农药残留的快速检测提供了一种新的选择。二 氧化锡气体传感器法具有低价格、高灵敏度的特点，但它针对的是农药气体样品的测定，在农药残 留现场、适时检测方面的应用尚需探讨。 另外，Suslick 等3537采用比色阵列传感器(图 2)分子识别和检测多种挥发性有机组分，该方法 是利用基底材料上涂覆或键合特殊的探针化合物，对混合组分中多种不同有机组分产生不同的颜色 响应，依据对显色阵列的统计和化学计量学分析，来识别和检测目标化合物。目前他们已经采用此 方法对茶叶中有毒有机组分进行了分析检测。这种检测新技术为农残快速检测提供了一个新的研究 方向。 图 2 显色传感器阵列检测显色效果示意图36 Fig.2 An illustration of detecting results by colorimetric sensor array 36 化学通报 2006年 第69卷 w085 5 5 发展趋势 目前， 虽然农药残留快速检测方法的研究取得了长足进展， 但实现真正意义上的农残样品现场、 实时分析尚需加大研究力度。发光分析技术中，发光试剂种类较少，能够测定的农残种类尚不广泛； 传感器技术中，测定有机磷的生物传感器实际上是胆碱酯酶传感器，专一性不高且酶源成本较高， 在商品化方面没有获得显著的突破，目前尚无法用生物传感器取代传统的化学分析测定有机磷的方 法；酶分析和免疫分析技术在稳定性、准确性、重复性等方面尚有待改进。因此，在环境和食品中 农药残留的快速检测领域，各种新技术的进一步开发和完善以及分析仪器的微型化、便携化、大众 化的研究，仍然是分析工作者的努力方向。 参考文献 1 黎其万，潘灿平. 西南农业学报, 2002, 17(2): 248252. 2 M Chicharro, A Zapardiel, E Bermejo et al. Talanta, 2003, 59(1): 3745. 3 J Bcltran, F J Lopz, M Forcada et al. Anal. Chim. Acta, 1997, 356(2): 125133. 4 K Granby, J H Andersen, H B Chritensen. Anal. Chim. Acta, 2004, 520(2): 165176. 5 A Roda, P Rauch, E Ferri et al. Anal. Chim. Acta, 1994, 294: 3542. 6 M S Ayyagari, S Kamtrkar, R Pande et al. Mater. Sci. Eng., 1995, C2: 191196. 7 S Albrecht, H Homak, H Brandk et al. A Fresenius J. Anal. Chem., 1992, 343: 175176. 8 J Wang, C Zhang, H Wang et al. Talanta, 2001, 54(6): 11851193. 9 王建宁. 青海农林科技, 2001, (2): 2829. 10 饶志明，王建宁，李隆弟 等. 分析化学, 2001, (4): 15. 11 袁东星，邓永智，林玉晖. 环境化学, 1997, 16(1): 7781. 12 袁东星，邓永智，樊敏. 环境化学, 1997, 16(5): 463469. 13 G Stefano, B Luca, R Aldo et al. Anal. Chim. Acta, 2002, 471(2): 113120. 14 程念政. 安徽化工, 2004(5): 4950. 15 宋茹，纪淑娟，李晶 等. 食品研究与开发, 2004, 25(2): 119121. 16 何奕，王琦琛，虞骥. 上海环境科学, 2003, 22(10): 687690. 17 王亮等，潘琇，徐婉莉 等. 食品科技, 2005, (10): 7477. 18 王军，朱鲁生，林爱军 等. 环境污染治理技术与设备, 2001, 2(1): 1724. 19 王彦，高志贤，戴树桂. 农业环境科学学报, 2003, 22(1): 125127. 20 张也. 食品科学, 2003, 24(8): 200204. 21 邓安平. 分析化学, 1998, 26(1): 2933. 22 邓安平，杨红. 分析化学, 1999, 27(6): 657660. 23 B Leif, K Claus, P Brian et al. J. Immuno. Methods, 2000, 240(2): 133142. 24 E K Lee, K J Yoo, P C Won et al. Anal. Chim. Acta, 2005, 530(1): 143153. 25 M Gonzalez-Martinez, R Puchades, A Maquieira