甘蓝与大白菜的原生质体融合.pdf

安徽农业科学J o u r n a lo f A n h u iA g i S c i 2 0 0 9 。3 7 ( 8 ) ：3 4 4 8 3 , 4 4 9责任编辑李菲菲责任校对丁冬梅 甘蓝与大白菜的原生质体融合 梁丹1 ，丁丹1 ，Y - k 旭1 2 +( 1 辽宁师范大学生命科学院，辽宁大连1 1 6 0 2 9 ；2 辽宁省植物生物技术重点实验室，辽宁大连1 1 6 0 2 9 ) 摘要 目的 研究两种近缘物种原生质体的最佳融合条件： 方法 利用培养好的甘蓝与白菜的幼苗在果胶酶与纤维素酶的作用下 分离出原生质体，再利用P E G 融合液将这2 种原生质体融合。 结果 用6 甘露醇+ 8 纤维素酶+ 2 果胶酶处理材料，酶解4h 后， 可以获得大量的游离原生质体，大部分原生质体呈圆形，散乱地游离在原生质体溶液各处。利用3 0 P E G 融合液及0 1m o L L C a C I 。溶 液( 舍9 甘露醇，p H 值9 5 ) 将这两种原生质体融合可以获得稳定的、可育的细胞杂种植株，可以直接作为育种的种质材料。 结论J 该研究为远缘杂交和进一步研究原生质体的培养及再生奠定了基础。 关键词甘蓝；大白菜；原生质体融合 中图分类号S6 3 4 3文献标识码A文章编号0 5 1 7 6 6 l l ( 2 0 0 9 ) 0 8 0 3 4 4 8 0 2 P r o t o p l a s tF u s i o no fB r a s s i c ao l e r a c e aa n dB r a s s i c ap e k i n e n s i s L L N GD a ne ta l ( C o l l e g eo fL i f eS c i e n c e L i a o n i n gN o r m a lU n i v e r s i t y 。D a l i a n 。L i a o n i n g1 1 6 0 2 9 ) A b s t r a c t O b j e c t i v e T l ea i mw a st os t u d yt h eo p t i m u mf u s i o nc o n d i t i o no fp r o t o p l a s tf r o m2r e l a t i v es p e c i e s M e t h o d ，1 1 l ep r o t o p l a s t s w e r es e D a r a t e df r o mt h ec u l t u r e ds e e d l i n g so fB r a s s i c ao l e r a c e aa n dB r a s s i c ap e k i n e n s i sw i t ht h ef u n c t i o no fp e e t i n a s ea n de e l l u l a s ea n dt I l e2 p r o t o p l a s t sw e r ef u s e db yP E Gf u s i o nl i q u i d R e s u l t Ag r e a td e a lo ff r e ep r o t o p l a s t sc o u l db eo b t a i n e db yu s i n g6 m a n n i t o l + 8 c e l l u 。 1 0 s e + 2 p e c t i n a s et ot r e a tt h em a t e r i a lf o r4h M o s tp r o t o p l a s t sw e r er o u n da n dd i s s o c i a t e di n t h ep r o t o p l a s ts o l u t i o ni r r e g u l a r l y U s i n g 3 0 P E Gf u s i o nl i q u i da n d0 1m o L LC a C I ，s o l u t i o n ( c o n t a i n i n g9 m a n n i t o l ，p Hv a l u e9 5 ) f o rp r o t o p l a s tf u s i o nc o u l do b t a i n s t a b l ea n d f e r t i l ec e l lh y b r i dp l a n t sa n dt h ep r o t o p l a s tc o u l db eu s e da st h eg e r m p l a s mm a t e r i a l sf o rb r e e d i n g C o n c l u s i o n T h er e s e a r c hl a i dt h ef o u n d a t i o nf o rd i s t a n th y b r i d i z a t i o na n df u r t h e rs t u d yo ft h ec u l t u r ea n dr e g e n e r a t i o no fp r o t o p l a s t K e yw o r d sB r a s s i c ao l e r a c e a ：B r a s s i c ap e k i n e n s i s ；P r o t o p l a s tf u s i o n 大白菜与甘蓝是我国主要的蔬菜作物，近十几年对其研 究有很大的进展。白菜与甘蓝的原生质体融合在理论和实 践上都有很大的意义，在植物遗传工程和育种研究上具有广 阔的应用前景。原生质体融合是植物同源、异源多倍体获得 的途径之一，它不仅能克服远缘杂交有性不亲和障碍，也可 以克服传统的通过有性杂交诱导多倍体植株的困难。 植物原生质体是除去细胞壁后为质膜所包围的“裸露细 胞”，是开展基础研究的理想材料。其中，酶解法分离原生质 体是一个常用的技术。植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素 和果胶质组成，因而使用纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成 分，除去细胞壁。目前许多化学、物理学和生物学方法可诱 导原生质体融合，现在被广泛采用并证明行之有效的融合方 法是聚乙二醇( P E G ) 法、高C a 、高p H 值法和电融合法( 由于 试验条件限制，该试验采用P E G 法) 。 P E G 是一种高分子化合物，2 0 一5 0 的浓度能对原生 质体产生瞬间冲击效应，使原生质体很快发生收缩与粘连， 再用高C a 高p H 值法进行清洗，使原生质体融合得以完成。 笔者将利用白菜与甘蓝的下胚轴与子叶在果胶酶与纤 维素酶的作用下分离出原生质体，冉利用P E G 融合液使原 生质体融合。 1 材料与方法 1 1 材料试验用大白菜和甘蓝种子来源于大连市种子公 司。所需溶液配制如下：6 甘露醇溶液( O 7m m o l L K H 2 P 0 4 ，1 0 0m m o l LC a C l 2 2 H 2 0 。6 甘露醇) ，1 8 甘露醇 溶液( 0 7m m o l LK H ，P 0 4 ，1 0 0m m o l LC a C I ，2 H ，O ，1 8 甘 露醇) ，2 果胶酶溶液，2 纤维素酶溶液，8 纤维素酶溶 液，P E G 融合液( 3 0 P E G ，0 3m o l L 葡萄糖，3 5m m o l L 基金项目 作者简介 收稿E t 期 辽宁省教育厅资助项目( 0 5 1 2 1 3 ) = 梁丹( J 9 8 2 一) ，女噩宁北镇人硕士研究生，研究方向：植 物学。通讯作者。 2 0 0 8 1 2 3 l C a C l ：2 H ：O ，0 7m m o L LK H 2 P 0 4 ) ，6 C P W 洗液( 1 5 0 0 m s LK H 2 P 0 4 ，2 0 2m s LK N 0 3 ，14 8 0 0m s LC a C l 2 。2 H 2 0 ， 2 4 6 0m g LM g S 0 4 7 H 2 0 ，9 甘露醇，用T r i s 调p H 值到 6 0 ) ，高C a 高p H 值溶液( O 1m o l LC a C l 2 2 H 2 0 ，6 甘露醇 溶液，用T r i s 调p H 值到9 5 ) 。 1 2 方法 1 2 1 播种及幼苗的培养。精选饱满的白菜、甘蓝种子，用 0 1 升汞表面消毒1 0r a i n ，再用无菌水洗涤4 次，将种子接 入1 2M S 培养基中。置于温度( 2 5 4 - 2 ) 。光照度10 0 0I x ， 光照1 4 1 6h d 的条件下培养7d 左右。 一 1 2 2lr I I l 体系酶液的配制。根据文献资料，设立几个不 同的组合建立1r n l 酶液体系。在小烧杯当中分别加入甘露 醇溶液和果胶酶溶液及纤维素酶溶液，准备用于酶解子叶和 下胚轴的细胞壁。“。 1 2 3 材料处理。用剪子和镊子剪碎甘蓝的子叶放进建立 好的lr r I l 酶液当中进行酶解；再剪下大白菜的下胚轴放入一 个小的培养皿当中，并用镊子固定住下胚轴的一端，用刀片 从下胚轴的中间割破，然后用剪子剪碎并放人建立好的1I I l l 酶液体系中进行酶解。 1 2 4 酶解。设立几个不同的时间段酶解原生质体，并用 倒置显微镜观察原生质体状态。 1 2 5 过滤。将酶解完全的大白菜的下胚轴原生质体和 甘蓝的子叶原生质体分别放入1 5 0 目、3 0 0 目的尼龙膜中进 行过滤，以除去未完全消化的残渣。因为大白菜下胚轴和 甘蓝子叶的原生质体大小不同，所以要用不同目的尼龙膜进 行过滤。 1 2 6 洗涤。将过滤好的原生质体分别放入2 个离心管当 中配平后在6 0 0r r a i n 下离心5m i n ，弃上清取酶液，留少许 上清液，以免挂壁的原生质体干死。再加3m l1 6 C P W 洗 液在6 0 0r m i n 下离心5m i n ，吸去上清液。 1 2 7 纯化。分别将大白菜下胚轴原生质体和甘蓝子叶原生 万方数据 7 卷8 期梁丹等甘蓝与大白菜的原生质体融合 3 4 4 9 质体平铺在2 0 及1 8 蔗糖溶液下，在6 0 0r m i n 下离心3 m i n ，去细胞碎片及不完整原生质体，使得原生质体得到纯化。 1 2 8 聚集。取下胚轴和子叶上层溶液于一个离心管中， 在6 0 0r r a i n 下离心1 0r a i n ，去上清，混匀剩下的少许溶液滴 在培养皿中间，静置1 0 1 5m i n ，使原生质体可以沉淀。 1 2 9 原生质体融合的诱导。向原生质体溶液周围滴加 P E G 融合液，静置1 0 1 5m i n ，使原生质体粘连在一起，然后 继续向原生质体溶液周围滴加高p H 值高c a 溶液( p H 值 9 5 ) 使原生质体融合。大约4 5h 内可以通过倒置显微镜 观察到原生质体的融合现象“。 2 结果与分析 2 1 酶解条件的优化建立不同浓度配比的l1 1 1 l 酶液体系 ( y 甘露醇：V 纤维素：V 果胶酶= 2 ：1 ：1 ) 后处珲材料，发现 1 8 甘露醇由于浓度大渗透势变大，导致细咆破裂，而6 甘露醇则与细胞液浓度一致，能够维持细胞状态。2 纤维 素酶由于浓度不适宜，导致细胞酶解不完整；8 纤维索酶， 2 果胶酶则可以较完整地酶解材料，获得完整原生质体。 最终获得优化体系：6 甘露醇+ 8 纤维素酶+ 2 果胶酶。 2 2 酶解时间的优化在确定酶液成分及浓度后，要对酶 解时间进一步确定，以每小时为单位，设置几个时间梯度进 行观察。结果发现，2 3h 酶解不充分，游离的原生质体很 少；而在4 5h 的时候酶解比较充分，可以获得大量的游离 原生质体；在7h 以后，原生质体开始出现破裂现象。最终获 得最佳酶解时间为4h 。 2 3 原生质体分离结果在材料酶解4h 后，去少许溶液进 行观察原生质体状态，大部分均呈圆形，散乱地游离在原生 质体溶液各处，单个观察如图1 所示。 注：A ：白菜下胚轴原生质体；B ：甘蓝子叶原生质体。 N 吐e ：A H y p o c o t y lp r o t o p l a s t so fc a b b a g e ；B C o t y l e d o np m t o - p l t so fc a b b a g e 图1 游离的原生质体 F i g 1 F r e ep r o t o p l a s t S 2 4 原生质体融合结果两种原生质体加入P E G 融合液后， 只发生粘连，在洗涤过程中才发生膜融合。核融合通常于融合 体第一次有丝分裂过程中发生，原生质体融合如图2 所示，： 3 讨论 该试验利用P E G 法将大白菜与甘蓝原生质体进；t i t 融 合。首先利用培养好的甘蓝与白菜的幼苗在果胶酶与纤维素 酶的作用下分离出原生质体，再利用P E G 融合液将这两种原 生质体融合，为进一步的原生质体培养及再生奠定了基础。 注：A 。融合处理后2 0h 细胞的状态；B ，融合处理后2 5h 细 胞的状态。 N o t e ：A C o n d i t i o no fc e l l s2 0h o u r sa f t e rf u s i o np r n c e s s ；B C o n d i t i o no fc e l l s2 5h o u r sa f t e rf u s i o np r o c e s s 图2 原生质体融合过程 F i g 2 F u s i o np r o c e s so fp r o t o p l a s t s 由于不同的材料所用酶种类、酶量、酶解时间及渗透势 不同，所以要对分离条件一一进行优化筛选。通过观察发 现在9 甘露醇+ 1 纤维素酶+ l 果胶酶，6 5h 的酶 解时问的条件下，原生质体的产量及质量较高。 现在广为使用的原生质体融合方法有聚乙二醇( P E G ) 法、高c a 高p H 值法和电融合法。在试验中观察到，P E G 法 与高C a 高p H 值法结合使用能够让原生质体更好地融合， P E G 使原生质体发生粘连。而高C a 高p H 值溶液则町以起到 刺激作用，使粘连的原生质体发生融合。 该试验是近缘物种间的原生质体融合，这种融合方式可 以获得稳定的、可育的细胞杂种植株，可以直接作为育种的 种质材料。通过该试验，可以为远缘杂交奠定基础，远缘不 亲和的物种间的原生质体融合，可以获得常规有性杂交得不 到的无性杂交植株，这不仅克服了远缘杂交不亲和性，还可 以扩大变异范围，产生新的种质。 参考文献 I 孙敬三，梓耀林植物细胞I j 程实验技术 M 北京：科学出版社，1 9 9 5 2 何q k 华，胡芳名谢碧霞，等枣树原生质体分离条件的研究 J 中南 林学院学报，1 9 9 9 1 9 ( 1 ) ：2 0 2 3 3 佚名清华学掌教学软什库【E B O L 2 0 0 4 1 1 - 0 1 h t t p ：1 6 6 1 1 1 3 0 1 6 1 ：8 0 0 0 k e j i a n m a t e r i a c e l V e x p e f m e n t 4 B H A R T E N D UV A