结球甘蓝-大白菜异源三倍体小孢子培养的研究.pdf

园 艺 学 报 2009, 36 (4) : 583 - 586 Acta Horticulturae Sinica 收稿日期: 2008 - 10 - 17;修回日期: 2009 - 03 - 24 基金项目:国家自然科学基金项目(30871713) ;河北省自然科学基金项目(C2005000222) 3 通讯作者Author for correspondence (E2mail:shensxhebau1edu1 cn) 结球甘蓝 大白菜异源三倍体小孢子培养的研究 张巍巍,申书兴 3 ,王彦华,陈雪平,轩淑欣,罗双霞,李晓峰 (河北农业大学园艺学院,河北保定071001) 摘 要:为创建结球甘蓝 大白菜异附加系,以大白菜二倍体(AA, 2n =2x =20)与结球甘蓝四倍体 (CCCC, 2n =4x =36)杂交获得的8个异源三倍体(ACC, 2n = 3x = 28)单株系为试材,进行游离小孢子 培养研究,获得再生植株,并对其进行了染色体数目鉴定和性状调查。结果表明,异源三倍体(ACC)的 小孢子诱导成胚的能力低于双亲;在NLN中添加15%的蔗糖和011 mgL - 1 62BA、012 mgL - 1 2, 42D、 0105 mgL - 1 KT的培养基上小孢子胚胎发生最高为010250个 蕾 - 1 , 8个株系间有差异,平均为010100 个 蕾 - 1; 胚胎再生率只有3313%。小孢子再生植株染色体数在1427条之间,田间性状表现多样。 关键词:结球甘蓝;大白菜;小孢子培养;胚状体;异附加系 中图分类号:S 63511; S 63411; Q 813 文献标识码: A 文章编号: 05132353X (2009) 0420583204 Studies on Isolated M icrospore Culture of the Allotriploid Hybrids Between Cabbage and Chinese Cabbage ZHANGWei2wei, SHEN Shu2xing 3 , WANG Yan2hua, CHEN Xue2ping, XUAN Shu2xin, LUO Shuang2xia, and L IXiao2feng (College of Horticulture, Agricultural University of Hebei, Baoding, Hebei071001, China) Abstract: Microspore culture of 8 allotriploid hybrids between diploid Chinese cabbage (AA, 2n =2x = 20) and autotetraploid cabbage (CCCC, 2n = 4x = 36) was perfor med in order to create the alien addition lines .The results showed that embryo production frequency of the allotriploid hybrids (ACC) was lower than their parents .In liquid medium NLN with 15% sucrose and 011 mgL - 1 62BA, 012 mgL - 1 2, 42D, 0105 mgL - 1 KT, the 8 lineswere different, the highest of embryo production was 010250 embryos per bud,the average was 010100 embryos per bud.The plant regeneration frequency of embryoidswas only 3313%.The chromosome number of plantlets derived from microspore culture varied from 14 to 27.The morphological characterswere diverse among the different plants . Key words: cabbage; Chinese cabbage; microspore culture; embryo; alien addition lines 异附加系是利用外源基因进行基因组研究的重要遗传材料,也是实现品种改良及创制易位系和代 换系的重要桥梁材料。结球甘蓝(B rassica oleraceaL.var .capitata L. ) 和大白菜B rassica com pestris L.ssp.pekinensis(Lour . ) Olsson同为十字花科(Cruciferae)芸薹属(B rassica ) , 是国际芸薹属基 因组研究计划的重要对象,因此,创建结球甘蓝附加大白菜染色体的异附加系对结球甘蓝基因组研究 和品种改良具有重大意义。本研究针对结球甘蓝大白菜异源三倍体(ACC)回交不易成功、结籽率 极低(Metz et al . , 1997;张玉成, 2008) ,不能满足创建异附加系要求的难题,利用异源三倍体减数 分裂不规则的特点,开展了结球甘蓝 大白菜异源三倍体(ACC)的小孢子培养,旨在为创建CC染 色体组附加A染色体组的单体或双体异附加系提供可行的途径。 园 艺 学 报36卷 1 材料与方法 试验材料为结球甘蓝 大白菜异源三倍体(ACC, 2n = 3x = 28) ,由本课题组以二倍体大白菜 (05 258, AA, 2n = 2x = 20)为母本,四倍体结球甘蓝(9502, CCCC, 2n = 4x = 36)为父本进行杂 交,经幼胚离体培养挽救获得。 将结球甘蓝 大白菜异源三倍体组培苗于2006年10月份进行扩繁, 11月中旬由MS培养基转接 到1 /2MS培养基上进行生根培养; 12月份移栽到阳畦,翌年四月初定植到田间,常规管理。 取材和小孢子培养时期的确定、小孢子分离和培养参考赵玉靖等(2007)、王汉中等(2004)的 方法,并稍做改进。以NLN为基本培养基,设10%、13%和15%蔗糖浓度,其中13%和15%蔗糖添 加012 mgL - 1 2, 42D; 15%蔗糖添加011 mgL - 1 62BA、012 mgL - 1 2, 42D和0105 mgL - 1 KT, 共6个处理。每皿2 mL,小孢子密度约10 5个 mL- 1。接种后先置 33 暗培养48 h,然后置25 继 续暗培养。此期间对小孢子的生长发育过程定期观察和照相, 2周后统计胚状体数,计算每花蕾出胚 数。当小孢子胚胎发育到子叶胚时,转到光照培养箱培养4872 h,待子叶胚变绿时,在无菌条件 下,将其接种于MS固体培养基上, 25 下进行植株再生。 将获得的小孢子植株移接到1 /2MS培养基上,待根长约1 cm时,切取根尖,置01002 molL - 1 的8 -羟基喹啉溶液中处理2 h,卡诺固定液固定。常规根尖压片法进行染色体制片,丙酸 铁 苏 木精 水合三氯乙醛染色液(PIHCH)染色, Olympus BH22光学显微镜观察,鉴定染色体数。 对小孢子植株生殖生长时期的长势、株高、叶形、叶色、叶表面特征、花形、花色、花大小、始 花期、育性等性状进行调查并照相。 2 结果与分析 211 不同蔗糖浓度对小孢子胚胎发生的影响 蔗糖作为小孢子培养的碳源和渗透压调节剂, 其浓度高低对培养成功与否至关重要。本试验结 果(表 1) 表明,基本培养基NLN添加10%的蔗 糖未诱导出胚状体,添加蔗糖浓度为15%时的小 孢子产胚率显著高于其他蔗糖浓度的产胚率。说 明较高的蔗糖浓度对结球甘蓝 大白菜异源三倍 体小孢子胚的发生和生长是有利的。 212 不同植物生长调节剂处理对小孢子胚胎发生 的影响 由表2可见,与不添加植物生长调节剂的对 照(表 1) 相比,基本培养基NLN中分别添加 13%、15%蔗糖的基础上,添加生长素2, 42D对 小孢子胚的发生没有影响;但在基本培养基NLN 添加15%蔗糖和生长素2, 42D的基础上再添加 细胞分裂素62BA和KT,则明显促进了小孢子胚 的发生,出胚率较前者提高了1倍,差异达到显 著水平。这表明生长素与细胞分裂素相互作用是 小孢子胚发生的一个关键因素。 表1 蔗糖浓度对小孢子胚胎诱导的影响 Table 1 Effect of sugar concentration on formation of m icrospores embryos 蔗糖浓度/% Sugar concentration 花蕾数 Number of flower buds 出胚数 Number of embryos 每花蕾出胚数 Embryos per bud 1060000 b 136002010033 b 156008010133 a 注:基本培养基NLN。表中不同字母表示处理间存在0105 水平显著差异。下同。 Note: Basic medium isNLN. Different letters in the Table indicate significant differences atP=0105.The same below. 表2 植物生长调节剂对小孢子胚胎发生的影响 Table 2 Effect of plant growth regulators on formation of m icrospores embryos 蔗糖 /% Sugar 2, 42D / (mg L - 1) 62BA / (mg L - 1) KT/ (mg L - 1) 蕾数 Number of flower buds 出胚数 Number of embryos 每花蕾 出胚数 Embryos per bud 13012003001010033 b 15012003003010100 b 15012011010560015010250 a 485 4期张巍巍等:结球甘蓝 大白菜异源三倍体小孢子培养的研究 213 小孢子胚胎的发育过程 对小孢子的胚胎发生及发育过程进行了观察。结果表明,培养34 d后大多数小孢子能够生长 膨大,但仅有个别小孢子能够继续生长,约67 d开始进行第1次分裂(图版, 1) , 13 d左右形成 肉眼可见的球型胚(图版, 2) ,进而形成心型胚,约20 d后开始出现子叶型胚,子叶型胚有短胚轴 (图版 , 3) 和喇叭口状(图版 , 4) 等类型。 本试验共取花蕾3 000个,诱导出小孢子胚30个,平均每花蕾出胚仅0101个。将30个小孢子胚 接种到MS固体培养基上,其中只有1个直接成苗, 9个经愈伤成苗(图版, 5) ,其它20个则褐化死 亡。 214 小孢子植株的染色体数 对获得的10个小孢子植株染色体数目进行了鉴定,染色体数从1427条不等(图版, 611) , 其中14、20、27条的各1株, 17、19条的各2株, 18条的最多, 3株。 215 小孢子植株的生殖性状调查 小孢子植株性状在田间表现多样,多数株系间在植株长势、株高、叶形、叶色、花色、花形、花 的大小、始花期和育性上均存在着较大差异。在育性方面,绝大部分小孢子株系花药空瘪,花粉很 少,少数小孢子株系的育性较好。在叶片特征方面,基生叶形状多种多样,叶片颜色有浅绿、绿、深 绿、墨绿不等,叶片质地也不相同(图版, 12 16) 。但不同株系性状表现又存在一些相似之处,如 基生叶多有12对翅状小叶,叶表面有毛,多具蜡质。不同植株间花期不一致,盛花期花的直径大 小变异范围在116215 cm之间,株高的变异范围在01251113 m之间。 图版说明: 1.小孢子第1次分裂; 2.球形胚; 3.短胚轴胚; 4.喇叭口状胚; 5.愈伤成苗; 611.染色体数14、17、18、19、20和 27; 1216.小孢子植株(染色体数17、18、19、20和 27) 。 Explanation of plates: 1.First diverse microspore; 2. Globular embryo; 3. Short2hypocotyls embryo; 4. Hydraulic embryo; 5. Sprout from cal2 lus; 6 - 11. 14, 17, 18, 19, 20, 27 chromosomes; 12 - 16.Plant (17, 18, 19, 20, 27 chromosomes). 585 园 艺 学 报36卷 3 讨论 异源三倍体植株在生产上一般没有直接的利用价值,但它却是用于基因效应研究、特别是异附加 系选育的重要遗传材料。异附加系的选育通常是以异源三倍体作母本与二倍体亲本回交,通过细胞学 鉴定等方法从回交子代中逐一进行筛选,如大白菜附加甘蓝(刘炜 等,2008)及菜薹附加芥蓝 (Wang et al . , 2008)等芸薹属植物的单体异附加系都是采用这种方法获得的,但该方法的应用需获 得较多的回交子代。芸薹属植物中基因组为AAC的异源三倍体与AA基因组的二倍体亲本回交比较 容易成功,然而基因组为ACC的异源三倍体与CC基因组的二倍体亲本回交则难以成功(Metz et al . , 1997) ;结籽率极低(张玉成, 2008) ,这给C基因组背景下的异附加系选育增添了困难。本研究中 利用异源三倍体(ACC)减数分裂不规则能产生各种非整倍体配子的特点,直接对其小孢子进行离 体培养,试图获得附加一条或两条染色体植株,但实际获得了附加518条染色体植株。这可能是由 于C、A基因组染色体具有较高的同源性,在减数分裂过程中A、C染色体组异源联会, A基因组染 色体不易丢失造成的;也有可能是获得的植株太少,n =1011的配子未能充分体现出来。 蔗糖浓度和植物生长调节剂是影响小孢子培养的两个重要因素。本研究中在基本培养基NLN中 添加13%蔗糖,对结球甘蓝 大白菜异源三倍体(ACC)小孢子进行诱导,其诱导率仅为010033 个 蕾 - 1 ;当提高蔗糖浓度和附加一定浓度的生长素和细胞分裂素时,明显促进了小孢子胚的发生, 但从总的培养效果看,诱导频率还是很低,为010250个 蕾 - 1。分析其原因 ,是三倍体减数分裂不 规则,产生的小孢子数量少、生活力低,严重影响了小孢子诱导成胚的能力。 以结球甘蓝 大白菜异源三倍体(ACC)为母本与二倍体甘蓝(CC)进行回交,结籽率极低, 通过小孢子培养,产胚率也低,这就为创建结球甘蓝 大白菜异附加系造成了困难。为了提高其结籽 率,作者正在尝试以二倍体甘蓝(CC)为母本与结球甘蓝 大白菜异源三倍体(ACC)进行反交, 以期得到较多的种子,为创建结球甘蓝 大白菜异附加系提供材料。 References Liu Wei, Shen Shu2xing, Wang Yan2hua, ZhangCheng2he, Xuan Shu2xin, Chen Xue2ping, LiXiao2feng, Luo Shuang2xia. 2008. A studyon ob2 tainment and identification of Chinese cabbage - cabbage addition lines . Acta Horticulturae Sinica, 35 (2) : 207 - 212.( in Chinese) 刘 炜,申书兴,王彦华,张成合,轩淑欣,陈雪平,李晓峰,罗双霞. 2008.大白菜 甘蓝异附加系的获得与鉴定.园艺学报, 35 (2) : 207 - 212. Metz P L J, Jacobsen E, Nap P, Pereira A, StiekemaW J. 1997. The impact on biosafety of the phosphinothricin2tolerance transgene in interspe2 cificB.rapaB.napushybrids and their successive backcrosses .Theoretical and Applied Genetics, 95: 442 - 445. Wang Han2zhong, Wang Xin2fa, Liu Gui2hua, Zheng Yuan2ben, Yang Qing . 2004.Studies on microspore culture of hybrid parents inB rassica napus. Chinese Journal ofOil Crop Scieves, 26 (1) : 1 - 4.( in Chinese) 王汉中,王新发,刘贵华,郑元本,杨 庆. 2004.甘蓝型杂交油菜亲本的小孢子培养技术研究.中国油料作物学报, 26 (1) : 1 - 4. Wang Xin2e, Zhang Cheng2he, Xuan Shu2xin, Man Hong, Liu Hai2he, Shen Shu2xing . 2008.