非水相体系中海藻酸钠_壳聚糖微胶囊粒径及强度性能.pdfVIP

第 卷 第期 化 工 学 报 年月 檭檭檭檭檭 檭檭 檭檭檭檭檭 檭檭 殐 殐 殐 殐 研究论文非水相体系中海藻酸钠壳聚糖微胶囊粒径 及强度性能 侯丹丹，李会静，宋慧一，戴小敏，于炜婷，刘袖洞，马小军 （ 大连大学，辽宁 大连 ； 中国科学院大连化学物理研究所，辽宁 大连 ） 摘要：固定化技术是提高生物催化剂在非水相中活性和稳定性的一种很有工业应用潜力的手段。采用乳化内部 凝胶化与络合反应制备海藻酸钠壳聚糖 （ ）微胶囊作为固定化载体，筛选种有机溶剂构建了培养基有机 溶剂两相体系，模拟酵母细胞培养条件，将 微胶囊在培养基有机溶剂两相体系中振荡 ，种两相体系 对 微胶囊形态没有明显影响；在培养基癸二酸二丁酯两相体系中，当壳聚糖分子量在 、成膜 反应时间在 范围内变化时，分子量小 （ ）和成膜时间长 （ ）的 微胶囊粒径稳定，破碎 率较低、机械强度较大，适于用作进一步非水相细胞催化的固定化载体。两相体系中 微囊化酵母细胞活性 保持良好，能实现生物转化生产。 关键词：非水相； 微胶囊；粒径；强度 ： 中图分类号： 文献标志码： 文章编号： （ ） ， ， ， ， ， ， （ ， ， ， ； ， ， ， ， ） ： （ ） ， ， ， ， ， ， （ ） （ ） ， 收到初稿， 收到修改稿。 联系 人：刘 袖 洞，马 小 军。 第 一 作 者： 侯 丹 丹 （ ） ， 女，硕士。 基金项目：国家重点基础研究发展计划项目 （ ） ； 国家自然科学基金项目 （ ， ） ；大连市青年科技 人才基金 （ ） 。 ： ： ， ； ， ： （ ） ， （ ， ） （ ） ， ， ： ； ； ； 引 言 通过酶或微生物转化可以获得许多具有商业应 用价值的化合物，但是上述生物催化过程中多涉及 水溶性较差的底物或产物，会影响水相中的转化效 率或产生产物抑制 。基于有机溶剂、水有机溶 剂两相体系、超临界流体、离子液体等非水相介质 的生物催化已发展成为解决此类问题的一个有效方 法，具有明显的优势 。常见的水有机溶剂两相 反应体系最初是应用于酶催化 ，而有些细菌也能 在有机溶剂存在条件下生长，这使得有机介质中的 微生物细胞催化展示了良好的应用前景 。 作为生物催化研究领域新兴的重要方向，非水 相生物催化可提高水不溶化合物溶解度，改变热力 学平衡以利于产物合成，但生物催化剂在非水相体 系中活性和稳定性的保持与提高一直是亟待解决的 问题。除了筛选和构建新型耐有机溶剂生物催化 剂 ，吸附和包埋等固定化技术 在一定程度上 可以防止酶或细胞与有机溶剂直接接触，避免有机 溶剂的相毒性，有利于提高其在非水相中的活性和 稳定性；而且有利于分离和重复利用，是一种很有 工业应 用潜力 的手段。目前，海藻 酸 钠壳 聚 糖 （ ， ）微胶囊因生物相容性良 好、制备条件简单温和、性能适宜，已被用于细胞 移植、药物缓释、细胞高密度培养等生物医学领域 和固定化酶催化过程 ，但都是在水相环境中 的性能评价和研究结果。本文以非水相体系中 微胶囊固定化酵母细胞催化过程为研究目标，探索 了 微胶囊本身在非水相体系中的性能变化， 即：以培养基有机溶剂两相为研究体系，以乳化 内部凝胶化法制备 微胶囊，考察了制备条件对 两相体系中 微胶囊粒径和机械强度的影响规 律，该工作是保证囊内细胞活性和稳定性，进行 微胶囊固定化酵母细胞催化过程研究的基础。 材料与方法 材料与仪器 海藻酸钠：青岛晶岩生物科技开发有限公司； 壳聚糖：大连鑫蝶股份有限公司，脱乙酰度 ， 由中科院上海应用物理研究所通过射线照射获 得， 分别为 、 和 ； 培 养基 （ 酵母膏 ，蛋白胨 ，葡 萄糖 ） ；司班 （ ，化学纯） ；吐 温 （ 化学纯，国药集团化学试剂有限公司） ；液 体石蜡 （ 分析纯，天津市大茂化学试剂厂） ；冰乙 酸 （ 分析纯，天津市科密欧化学试剂开发中心） ； 油酸 （ 分析纯，天津市博迪化工有限公司） ；癸二 酸二丁酯 （ 分析纯，天津市光复精细化工研究所） ； 油酸乙酯 （ 分析纯，天津市光复精细化工研究所） ； 肉豆蔻酸异丙酯 （ 分析纯，阿拉丁试剂） ；酵母细 胞： （ 浙江工业大学药学院梅建 凤博士惠赠） 。 数控电动搅拌系统 （ 型， 德国 公司） ；激光粒度仪 （ ，美国 公司） ；生物倒置显微镜 （ 型， 日本 公司） ；全温振荡培养箱 （ ， 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司） ；玛瑙球 （ 辽宁省阜新市伟诚玛瑙器厂） 。 乳化内部凝胶化法制备 微胶囊 参照文献 方法，量取 浓度为 的海藻酸钠溶液，加入碳酸钙充分混匀作为水 相；将表面活性剂司班 在液体石蜡中充分分散 后作为油相。水油两相按一定比例混合后在电动搅 拌仪中以 速度搅拌乳化，形成稳定乳 液。再向其中滴加冰乙酸解离出 ，引发凝胶 化反应。依次用 （ 体积）吐温 水溶液、去 离子水清洗后，得到海藻酸钙凝胶珠。将海藻酸钙 凝胶珠与 壳聚糖溶液以 体积比混 合，反应一定时间即制备成 微胶囊，接着用 溶液清洗，再转入 柠 第期 侯丹丹等：非水相体系中海藻酸钠壳聚糖微胶囊粒径及强度性能 檬酸钠溶液，得到内部液化的 微胶囊。 微胶囊形态及粒径表征 将 海藻酸钙胶珠或 微胶囊加入到 的 培养基或者 培养基有机溶剂两 相体系中，放入全温振荡培养箱中振荡，隔一定时 间取样，分别用 （ 体积）吐温 水溶液和去 离子水清洗，在倒置显微镜下观察海藻酸钙胶珠及 微胶囊形态，并用 数码相 机拍照，每个样品随机抽取 个显微镜视野， 共获得不少于 个微胶囊图像，通过 软 件读取每个微胶囊的膜厚，求其平均值；利用激光 粒度仪检测胶珠和 微胶囊粒径及分布 （ ） ， 每个样品为个平行样。 微胶囊的机械强度表征 将 海 藻 酸钙 胶珠 或 微 胶 囊 加 入 培养基有机溶剂两相体系中，并且每个瓶中 加入 个直径的玛瑙球，振荡 后，在 显微镜下观察计算胶珠或 微胶囊破损率 （ 每组 个平行样） 。相同条件下，将相同量的胶珠或 微胶囊加入 的 培养基中振荡作为对照。 结果与讨论 有机溶剂的选择 对于水有机溶剂两相体系中的生物催化过程 研究，有机溶剂的选择非常关键，最基本的一个标 准是对生物催化剂有良好生物相容性。根据关联溶 剂物化性质与生物相容性之间关系的 法 ， 即：溶剂的 值，生物催化剂能保持高活性， 即生物相容性较好。本文选择了种在水中溶解度 较低且生物相容性较好的有机溶剂：油酸 （ 值 ，水溶解度 ） 、油酸乙酯 （ 值 ，水不溶） 、癸二酸二丁酯 （ 值 ，水 溶解度 ）和肉豆蔻酸异丙酯 （ 值 ，水溶解度 ）以及胶珠制备中 用的液体石蜡 （ 值 ，水不溶） ，并配成培 养基有机溶剂两相，模拟 微胶囊固定化酵母 细胞培养条件，考察了 微胶囊在两相体系中的 性能变化。 培养基有机溶剂两相中 微胶囊形态 按照 节的方法，分别将海藻酸钙胶珠和 微胶囊在振荡培养箱中振荡 ，取出清洗后 在显微镜下观测发现，在培养基有机溶剂两相中 振荡 后，海藻酸钙胶珠形态圆整，但是粒径 增加较为明显，与培养基中胶珠形态相比边缘变模 糊 （ 图） ；而 微胶囊形态圆整，粒径无明显 变化，边缘清晰 （ 图） ，表明在实验考察的范围 内，培养基有机溶剂两相对 微胶囊的形态没 有影响。这也说明海藻酸钠和壳聚糖之间络合形成 的聚电解质膜有利于 微胶囊的形态保持。 培养基有机溶剂两相中 微胶囊粒径 采用乳化内部凝胶化法制备海藻酸钙胶珠， 粒径分布在 （ 标准误差小于 ） 。由 图 培养基及培养基有机溶剂两相中振荡 后海藻酸钙胶珠形态 （ ） 化 工 学 报 第 卷 图 培养基及培养基有机溶剂两相中振荡 后 微胶囊形态 （ ） 图 培养基有机溶剂中振荡后海藻酸钙胶珠粒径变化 ； ； ； ； ； 图可以看出，无论在培养基还是培养基有机溶 剂中，随着振荡时间的延长，胶珠粒径增大，且在 时最大，约为培养前 倍， 后胶珠粒径 不再变化，这与 节中显微镜观测的结果一致。 文献 报道，海藻酸钙作为一种水凝胶，在遇到 一些非凝胶离子时，如遇到钠离子或镁离子等会发 生离子交换作用而发生体积膨胀的趋势，从而使海 藻酸钙凝胶稳定性下降。分析认为，应该是 培养基成分酵母膏中的钠离子干涉了胶珠中海藻酸 根与 之间的相互作用，使凝胶结构疏松，表 现为粒径增大，当离子交换平衡时，胶珠粒径不再 变化。另外，在油酸、油酸乙酯、液体石蜡、肉豆 蔻酸异丙酯与培养基构成的两相介质中，胶珠粒径 变化和培养基中胶珠粒径变化相比有显著性差异 （ ，） ；而在培养基和培养基癸二酸二 丁酯两相中，胶珠粒径变化无显著性差异 （ ，） ，表明癸二酸二丁酯对胶珠粒径没有 影响。考虑到癸二酸二丁酯具有生物相容性，所以 后续实验均选择癸二酸二丁酯为有机相。 本文选择了三种分子量壳聚糖 （分别为 ， ， ） ，分别与海藻酸钙胶珠成 膜 制备 微胶囊，考察了壳聚糖分子量对 培养基癸二酸二丁酯两相中 微胶囊粒径的影 响规律。由图可以看出，为 和 的壳聚糖制备的微胶囊，在两相体系中振荡后 粒径显著增大，随后又恢复至初始尺寸并保持稳 定；而为 的壳聚糖制得的微胶囊，在 振荡过程中，粒径基本保持稳定。这是因为，壳 聚糖分子量的大小不仅影响微胶囊膜厚，同时还影 响微胶囊的膨胀行为 。大分子量的壳聚糖虽然 有能力在海藻酸钙表面架桥，但是空间位阻大，扩 散进入海藻酸钙胶珠的深度不够，因而形成较薄的 微胶囊膜；相反，低分子量的壳聚糖能够充分进入 海藻酸钙胶珠内部，在三维网络中起到架桥的作 用，形成较厚的微胶囊膜。当微胶囊在两相中振荡 时， 培养基中钠离子与胶珠钙离子交换导致 第期 侯丹丹等：非水相体系中海藻酸钠壳聚糖微胶囊粒径及强度性能 图 壳聚糖分子量对培养基癸二酸二丁酯中 微胶囊粒径的影响 （ 成膜时间： ） （ ： ） 凝胶有膨胀趋势，表现为粒径增大，但随之会受到 微胶囊膜的束缚力作用，膜越厚束缚力越大，作用 力平衡的结果使微胶囊粒径逐渐恢复并保持稳定。 同时，在其他制备条件相同的情况下，考察了 成膜时间对培养基癸二酸二丁酯两相中 微胶 囊粒径的影响规律。图表明，当成膜时间为和 时制备的 微胶囊，在培养基癸二酸二丁 酯两相中随着振荡时间的延长，微胶囊粒径先增 大，然后减小，最后粒径保持不变；而成膜时间 的 微胶囊，其粒径基本保持稳定。这是因 为分子量相同时，成膜时间越长，壳聚糖与海藻酸 钙凝胶发生络合反应的程度越大，形成较厚微胶囊 膜，在振荡过程中，离子交换引起的凝胶膨胀力与 微胶囊膜束缚力之间平衡结果使微胶囊粒径逐渐恢 复并保持稳定。 培养基有机溶剂两相中 微胶囊机械强度 在微囊化细胞大规模培养过程中，微胶囊膜受 到搅拌桨的剪切作用，微胶囊间及微胶囊与反应器 间的相互冲击碰撞作用，高密度培养时由于微胶囊 体积的增加，在重力作用下，微胶囊彼此之间也会 产生挤压作用，如果微胶囊的机械强度太差，会导 致囊体破裂和细胞泄露。因此，微胶囊具有适宜的 机械强度性能是实现固定化细胞催化的一个重要前 提。本文采用球磨法 ，以破碎率为机械强度指 标，考察了壳聚糖分子量和成膜时间对 微胶囊 机械强度的影响。 从图可以看出，海藻酸钙胶珠和 微胶囊 无论是在培养基对照组，还是在培养基癸二酸二 丁酯两相体系中，其破碎率没有显著性差异，即两 相中的有机溶剂癸二酸二丁酯不影响微胶囊的机械 强度； 微胶囊的破碎率要小于海藻酸钙胶珠， 表明在两相体系中微胶囊的机械强度要优于海藻酸 钙胶珠。而且，随着壳聚糖分子量的减小， 微 胶囊在培养基癸二酸二丁酯中的破碎率减小，即 机械强度增大。 分析认为，虽然大分子量壳聚糖链节上荷正电 的氨基数目相对较多，但是由于链节空间尺寸较 大，导致其扩散进入海藻酸钙凝胶网络的阻力较 大，扩散速率和程度都较低，因此成膜反应主要在 海藻酸钙凝胶珠表面进行，形成的膜薄 （ 图） ， 化 工 学 报 第 卷 图 不同分子量壳聚糖制备 微胶囊 膜厚随成膜时间的变化 抗碰撞和剪切能力较弱；而小分子量壳聚糖具有较 低的空间阻力，容易扩散到海藻酸钙凝胶网络中， 且随着进入分子数目增多，提供的氨基数目也随之 增多，因此成膜反应在凝胶网络内部进行，形成的 膜厚 （ 图） ，抗碰撞和剪切能力较强。 乳化内部凝胶化法制备的海藻酸钙胶珠孔数 目少但孔尺寸较大 ，因此胶珠与壳聚糖的成膜 反应很快，考虑到微胶囊膜内外物质的传递，本文 考察了成膜时间为、 制备的 微胶囊 在两相中的机械强度。图显示， 微胶囊在培 养基和培养基癸二酸二丁酯两相中的破碎率同样 没有显著性差异；并且，随着成膜时间的延长， 微胶囊在培养基癸二酸二丁酯两相中的破碎率 减小，即机械强度增大。 分析认为，当胶珠与壳聚糖分子量等其他制备 条件相同时，随着成膜时间延长，壳聚糖扩散进入 凝胶网络与海藻酸钙凝胶发生络合反应的程度加 深，膜厚度随之增加，因此微胶囊的破碎率随成膜 时间延长而减小，即微胶囊机械强度增加。成膜时 间对非水相中微囊化细胞活性的保持以及物质的通 透性非常重要，减少成膜时间有利于膜内外物质的 传递。同时，成膜时间太短时，形成的微胶囊膜 薄，又不能有效地保持非水相中微囊化细胞的活 性。因此，在保证微胶囊机械强度的前提下应尽可 能减少成膜时间。 微胶囊用于非水相催化研究初探 在上述研究基础上，以具有生物催化活性的酵 图 成膜时间对培养基癸二酸二丁酯中 微胶囊破碎率的影响 母细胞为研究模型，考察其在培养基有机溶剂两 相中的生长与生物催化生产苯乙醇的情况。结 果显示，两相体系不影响微囊内酵母细胞的生长， 且微囊内细胞活性保持良好 图（） 。底物浓度 在 范围内，均呈现 苯乙醇的高转 化率 图（） ，初步验证了海藻酸钠壳聚糖微 胶囊体系用于非水相催化的可行性。 图 微囊化酵母细胞在培养基癸二酸二丁酯 两相中增殖的形态学 （ ） 和 生物转化生产苯乙醇产量 结 论 采用乳化内部凝胶化法制备海藻酸钙凝胶珠， 并与壳聚糖络合得到 微胶囊，以培养基有机 溶剂两相为研究体系，探索了 微胶囊在两相体 系中的性能变化。研究结果表明：在实验考察的 种有机溶剂中，培养基癸二酸二丁酯两相体系对 微胶囊形态、粒径、机械强度性能无显著性影 响；在实验考察的范围内，壳聚糖分子量越低、成 第期 侯丹丹等：非水相体系中海藻酸钠壳聚糖微胶囊粒径及强度性能 膜时间越长， 微胶囊在两相体系中性能越稳 定，当壳聚糖分子量为 ，成膜时间为 时制备的 微胶囊在培养基癸二酸二丁酯培养 中粒径比较稳定，破碎率较低，机械强度较大。以