高温气相色谱分析甘油酯的研究.pdf

2 0 1 1 年 第3 6卷 第 7期 中国油脂 7 5 高温气相色谱分析甘油酯的研究 王丽丽 ， 汪 勇 ， 胡长鹰 ， 张云 ( 1 暨南大学 食品科学与工程 系， 广州5 1 0 6 3 2 ； 2 安捷伦科技有限公司， 上海 2 0 0 1 3 1 ) 摘要 ： 建立了高温气相 色谱分析油脂样品 中脂肪酸和甘油酯含量的方法。采用保留时间定性 ， 外标 法定量， 定性定量准确。得到的脂肪酸、 单甘酯、 甘油二酯、 甘 油三酯的标准 曲线， 在质 量浓度范围 O 5 2 0 0 m g mL内峰面积与被测物质量浓度线性 关 系良好。加样回收试验表明， 平均加样回收 率在 9 5 6 9 一1 0 5 7 8 之 间， R S D在 0 2 7 2 9 8 之 间。用该方法分析各种脂肪酸和甘油酯 均有较好的精密度和重复性。 关键词： 高温气相 色谱 ； 甘油酯； 毛细管柱 中图分类号： T S 2 2 5 ； T Q 6 4 6 文献标志码 ： A 文章编号 ： 1 0 0 3 7 9 6 9 ( 2 0 1 1 ) 0 7 0 0 7 5 0 5 Ana l y s i s o f a c y l g l y c e r o l s by h i g h t e m p e r a t u r e g a s c hr o ma t o g r a ph y W ANG L i l i ，W ANG Yo n g ，HU Ch a n g y i n g ，ZHANG Yu n ( 1 D e p a r t me n t o f F o o d S c i e n c e a n d E n g i n e e r i n g ， J i n a n U n i v e r s i t y ， G u a n g z h o u 5 1 0 6 3 2 ， C h i n a ； 2 A g i l e n t T e c h n o l o g i e s C o ， L t d ， S h a n g h a i 2 0 0 1 3 1 ， C h i n a ) Abs t r a c t ： A hi g h t e mp e r a t u r e g a s c h r o ma t o g r a p h y me t h o d wa s d e v e l o p e d f o r a n a l y z i n g t h e c o n t e nt o f f a t t y a c i d( F F A)a n d a c y l g l y c e r o l s i n o i l s s a m p l e s F F A a n d a c y l g l y c e r o l s w e r e i d e n t i fi e d b y t h e r e t e n t i o n t i me w i t h s t a n d a r d s a n d q u a n t i fi e d b y e x t e r n a l s t a n d a r d me t h o d， wh i c h w a s t u rne d o u t t o b e c o r r e c t T h e c a l i b r a t i o n c u r v e s o f F F A， m o n o a c y l g l y c e r o l( M A G) ， d i a c y l g l y c e r o l( D A G) a n d t r i a c y l g l y c e r o l( T A G) b u i l t b y t h e h i g h t e mp e r a t u r e g a s c h r o ma t o gra ph y s h o we d a g o o d l i n e a r c o rre l a t i o n a t c o n c e n t r a t i o n r a n g e o f0 5 2 0 0 mg mL Re c o v e r y e x p e r i me n t s s h o we d t h e a v e r a g e r e c o v e r i e s o f FF A a n d a c y l g l y c e r o l s we r e a t r a n g e o f9 5 6 9 一1 0 5 7 8 wi t h RS D a t r a n g e o f0 2 7 一2 9 8 Th e me t h o d h a d g o o d p r e c i s i o n a n d r e p r o du c i b i l i t y Ke y wo r d s： h i g h t e mp e r a t u r e g a s c h r o ma t o g r a p h y；a c y l g l y c e r o l s；c a p i l l a r y c o l u n l n 脂肪酸甘油酯根据甘油骨架上结合的脂肪酸数 目不 同分类 ， 包括甘油三酯 ( T r i a c y l g l y c e r o l ， T A G) 、 甘油二酯 ( D i a c y l g l y c e r o l ， D A G) 和单 甘酯 ( Mo n o a c y l g l y c e r o l ，M A G) 。其 中T A G是天然油脂的主要成 分 ， M AG 、 D A G是天然油脂代谢 的中间产物 ， 也是一 类 主要的食品乳化剂。甘油和脂肪酸的酯化合成反 应包含一 系列 反应 过程 ， 反 应体 系 中 F F A、 MA G、 收稿 日期 ： 2 0 1 0 0 8 2 4； 修 回 日期 ： 2 0 1 1 0 4 0 8 基金项目： 国家“ 8 6 3 ” 计划项 目( 2 0 1 0 A A 1 0 1 5 0 5 ) ； 国家 自然 科学基金项 目( 3 1 0 0 0 7 9 3 ) ； 粤港关键领域重 点突破项 目 ( 2 0 0 9 A 0 2 0 7 0 0 0 0 3 ) ； 广东省科技计划项目( 2 G O 9 B 0 8 0 7 0 1 0 6 3 ) 作者简介： 王丽丽( 1 9 8 6 ) ， 女， 在读硕士， 粮食、 油脂及植物蛋 白工程专业( E m a i l ) w a n g l i l i _ 6 5 9 1 6 3 c o l a 。 通信作者 ： 汪勇， 副研究员， 博士。 D A G、 T A G同时共存 ， 为深人研究酯化过程 ， 必须对 这些组分进行全面分析 ， 以进行反应动力学等方面 的研究 。 关于甘油酯种类和纯度 的分析方法很多 ， 如化 学法( 高碘酸法测单甘酯 ) 、 柱层析法、 酶法、 薄层色 谱法( T L C ) 、 气相色谱法 ( G C) 、 高效液相色谱法 ( H P L C) 、 质谱 法 ( MS ) 、 核磁共振法 ( N MR) 等 。薄 层色谱 法操 作 设备 简单 ， 但是 比较 耗时 J 。化 学 法 、 柱层析法易出错、 耗时长、 劳动强度大， 酶法易引 起水解时酰基转移 ， 导 致错误鉴定脂肪 酸 的位置 。 所以这几种方法已很少使用 J 。仪器分析法具有 灵敏度高、 时间短 、 进样量小、 高效等优点 ， 是 目前脂 类分析较为常用的方法。 甘油酯沸点高 ， 具有难挥发的特性。一般对甘 油酯类难挥发物质通常以高效液相色谱法或衍生化 76 C HI N A 0I L S AND F A TS 后经气相色谱测定 J 。而采用高效液相色谱法， 不 需对样品进行预处理， 可以将甘油酯组分按照类型 分离 ， 但是操作仍然比较复杂 ， 分析成本较高。 气相 色谱技术是 有机物分析 的最有效手段之 一 ，由于其独特 、 高效、 快速 的分离特 性 ， 已成为物 理 、 化学分析不可缺少 的重要工具。随着高温气相 色谱柱 的发展 ， 使得使用气 相色谱法分析高沸点 的 甘油酯成为可能 。本文通过高温气相色谱程序升温 法 ， 对 F F A、 MA G 、 D A G、 T A G分别定性分 析， 并利用 外标法定量。较高的色谱分析温度可以缩短分析时 间， 测定方法快速简便 ， 且不需要对样 品进行衍生 化 。 1 材料与方法 1 1 材 料 、 仪 器 A g i l e n t 7 8 2 0 A气相色谱仪 ： 安捷伦科技 有限公 司； MD一8 0型分子蒸馏设备 ： 广州汉维有 限公司 ； 大豆油 ： 嘉里 粮油 有 限公 司； 磷 脂 酶 A 1( L e c i t a s e U l t r a ， 酶活力 1 0 0 0 0 U mL ) ： 丹麦诺维信公司 ； 油酸 ( 含量大于 9 9 ) 、 一油酸甘油酯 ( 含量大于 9 9 ) 、 二油酸甘油酯( 含量大于 9 7 ) 、 三油酸甘油酯( 含 量大于 9 9 ) ： S i g ma 公司； 正己烷 ： 色谱纯； 甘油( 纯 度 9 9 5 ) ： 分析纯 ； 其他试剂均为分析纯。 1 2 酯化反 应合 成甘 油 酯混合 物 取 8 1 0 4 g甘 油 于 夹 层 烧 杯 中， 依 次 加 入 1 7 4 mL 磷脂酶 A 1 、 1 5 4 4 m L去离子水、 1 1 2 0 0 g F F A。在反应温度 4 0、 搅拌速度 3 0 0 r mi n 、 真空 ( 压力 5 0 0 0 P a ) 下反应 1 2 h 。反应结束后 ， 将反应 液在 3 0 0 0 r mi n下离心分层 ， 上层是酯化反应合成 的甘油 酯 混合 物 ( 酯 化产 物 ) ， 主 要成 分 为 F F A、 MA G、 D A G、 T A G。将上层进分子蒸馏进料罐 ， 脱水 脱气后在蒸馏 柱温 1 6 5 o C、 压 力 0 3 P a 、 刮膜转速 2 5 0 r m i n下分子蒸馏收集轻相( F F A和 MA G) 和重 相 ( D A G和 T A G) 。 1 3色谱柱 选择 试验 将酯化产物配成 2 0 0 mg m L的样品溶液 ， 选 用 D B一1 7 h t 毛细管柱和 D B一1 h t 毛细管柱在以下 色谱条件下分别进样 2 ， 比较不同色谱柱的色 谱图。 1 3 1 色谱柱 D B一1 7 h t 毛细管柱( 3 0 m 0 3 2 mm 0 1 5 m) 的色谱条件 进样 口： 3 5 0 o C， 分 流 比： 2 0： 1 ； 检测器： 3 6 0 o C； 柱 温 ： 1 0 0 o C保持 0 m i n ， 6 0 o C m i n升温至 1 8 0 保 持 0 m i n ， 1 5 m i n升温至 3 0 0 o C 保持 0 m i n ， 以5 o C ra i n升 温至 3 2 0 保留7 m i n ，以 1 0 ra i n升温至 3 5 0 ， 保 留5 m i n ， 以 1 0 o C m i n升温至 3 6 0 ， 保 留 1 0 m i n ； 载 气 ： 高纯氮气 ， 流速 4 4 1 m L m i n ； 空气流速： 3 0 0 m i n ， 氢气流速： 3 0 m lJm i n 。 1 3 2 色谱柱 D B一1 h t毛细 管柱 ( 3 0 m 0 2 5 mm 0 1 I x m) 的色谱条件 进样 口： 3 8 0 ， 分流比： 2 0： 1 ； 检测器 ： 4 0 0 ； 柱 温： 1 0 0 保 持 0 m i n ， 5 0 c I = m i n 升 温 至 2 2 0 保 持 0 m i n ， 1 5 ra i n升温至 2 9 0 保持 0 m i n ，以 4 0 m i n升温 至 3 2 0 o C保 留 8 m i n ，以 2 0 o C m i n升温 至 3 6 0 o C， 保留 1 2 mi n ；载气 ： 高纯氮气 ， 流速 4 4 1 m L rai n ； 空气流速 ： 3 0 0 mL m i n ； 氢气流速 ： 3 0 mL m i n 。 1 4甘 油酯混合 物分 析 1 4 1 标准曲线绘制 将各标准品配成 2 0 0 、 1 0 0 、 5 0 、 2 5 、 1 0 、 0 5 mg m L的标准溶液 ， 用气相色谱在 1 3中选择的较 优色谱条件下分析不同质量浓度的标准溶液 ， 以标 准溶液质量浓度为横坐标 ， 各物质特征峰面积为纵 坐标做标准 曲线 。 1 4 2 样品组成的分析测定 分别将大豆油、 酯化产物、 分子蒸馏酯化反应合 成产物 的轻相和重相 配成 2 0 0 m g mL的样 品溶 液， 利用 1 3中较优色谱条件分析各样品组成， 通过 标准 曲线 得到样 品中 F F A、 M A G、 D A G 、 T A G 的含 量 ， 每个样品测定 3次求得平均值 。 1 4 3 加样 回收 将酯化产物配成 2 0 0 mg m L的样品溶液 ( A) ， 与其他一定质量浓度的标准溶液 ( B 、 B 、 B 、 B ) 分 别按一定比例配成待测定样 品， 测定各样品中 目标 物质的质量浓度 ， 分别计算加样 回收率和 R S D。 2 结果与讨论 2 1 色谱柱 的 选择 酯化产物选用不同色谱柱进行气相色谱分析 ， D B一1 7 h t 色谱柱的气相色谱 图见图 1 ， D B一1 h t 色 谱柱的气相色谱图见图 2 。由于脂肪酸和甘油酯类 化合物具有一定极性和很高 的碳数 与沸点 ， 因此要 求色谱柱必须耐高温， 且具有 良好惰性的高温低流 失柱 J 。D B一1 7 h t 和 D B一1 h t 色谱柱均可 以完整 地分离脂肪酸和甘油酯。P a i k a l 6 等利用 D B一1 7 h t 色谱柱分析 了微海藻油中的甘油三酯和脂肪酸。由 图 1 、 图2比较可知， D B一 1 7 h t 色谱柱在分析样品中 MA G和 D A G成分时出峰 比较多 ， 主要原因是 ： 根据 相似相溶原理 ， 利用中等极性的 D B一1 7 h t 色谱柱分 析中等极性物质 MA G和 D A G时 ， 与非极性柱相 比 作用力强 ， 选择性高 ， 具有更高的灵敏度。但是在分 析样品中 T A G成分 时出峰时 间长 ， 基线漂移大 ， 峰 形较宽。D Bl h t 色谱柱 耐受温度达 4 0 0， 为非 极性柱 ， 而甘油酯具有一定极性 ， 甘油酯与固定相易 分离 ， 所以分析甘油酯 时出峰较快 、 时间较短 、 峰形 2 0 1 1 年 第 3 6卷 第 7期 中国油脂 7 7 窄。综合比较 ， D B一1 7 h t 色谱柱更适合专门用 于具 体分析 M A G 、 D A G等物质， D B一1 h t 色谱柱适用于 分析甘油酯 中各种成分的含量 。另一方面柱温对柱 效的影响比较复杂 ， 温度升高 ， 传质阻力减小 ， 有利 于提高柱效 ， 分 子扩散增 加 ， 又使 柱效降低“ J 。所 以为了提高柱效同时缩短分析 时间， 本文选择直接 陋 鹫 恒 鹫 利用非极性柱 D Bl h t 分析未衍生化处理的甘油酯 混合 物 ， 运 行 时 间 3 0 m i n 。而 F a g a n 等 使 用 D B一 1 7 h t 色谱柱分析牛奶 中的 M A G 、 D A G两种甘 油酯成分需运行 4 4 m i n 。D Bl h t 色谱柱缩短 了分 析时间。 时间 mi n 图 1 D B一 1 7 h t 色谱 柱的气相色谱 图 O 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 1 6 1 8 2 0 2 2 2 4 2 6 2 8 ， 时 间 mi n 图 2 D B l h t 色谱柱 的气 相色谱图 2 2脂肪酸和甘油酯分析 根据 F F A 、 MA G、 D A G、 T A G各标准物在相同色 谱条件下的保留时间对甘油酯混合物样品进行定性 分析。各标 准 品 的 出 峰顺 序 依 次 为 F F A、 MA G、 DAG、 TAG。 2 3标 准 曲线及加 样 回收 油酸、 一油酸甘油酯 、 二油酸甘油酯 、 三油酸甘 油酯标准物的标准 曲线分别见图 3图 6 ， 利用外标 法对各标 准物 进行 定量 分 析， 在质 量浓 度 0 5 质量浓度 ( m g m L ) 图3 油酸( F F A) 标准曲线 2 0 0 mg m L 范围 内均具有很好 的线性关 系。酯化 产物溶液( A) 与其他一定质量浓度的标准溶液( B 、 B 、 B 扑B ) 分别按一定 比例配成不同质量浓度的溶 液 ， 通过 分析 测定 得到 不 同质量 浓度 F F A、 MA G、 D A G、 T A G 标 准 品 平 均 加 样 回 收 率 分 别 在 9 5 6 9 1 0 5 7 8 之 间， R S D( 相对标 准偏 差 ) 在 0 2 7 2 9 8 之间 ， 具体分析测定结果见表 1 表 4 。R S D和加样 回收率 数据表 明， 本方法对脂肪 酸和甘油酯分析有良好 的精密度和重复性 。 恒 鹫 质量浓度 ( m g m L ) 图 4一油酸甘油酯( MAG) 标准 曲线 O 8 6 4 2 O 8 6 4 ， 1 l 7 8 CHI NA 0 I L S AN D F AT S 2 0 1 1 V o I _ 3 6 No 7 旧 骘 质量 浓度 f mgmL ) 图5二油酸甘油酯( D A G) 标准 曲线 恒 鹫 质 量浓度 f mgmL ) 图 6 三油酸甘油酯 ( T AG) 标准 曲线 表 1 F F A标 准品加样 回收 率及 R S D 注： 酯化产物中 T A G质量分数为 1 1 0 9 。 2 4 甘 油 酯样 品 中各 成分含 量 的测 定 通过以上建立 的方法分别 测定 大豆油 、 酯化产 物 、 分子蒸馏分离酯化反应产物 的轻相和重相中的 F F A和甘油酯的含量 ， 结果见表 5 。由表 5可知， 本 试验 中脂肪酸和甘油 的酯化 反应 主要 生成了 M A G 和 D A G， 通 过 1 6 5 、 0 3 P a分子蒸 馏后 ， F F A和 2 0 1 1年 第 3 6卷 第 7期 中国油脂 7 9 MA G主 要 存 在 于 轻 相 中 ， 其 中 MA G 含 量 为 6 2 6 4 ， D AG主要存在于重相 中， 含量为 7 3 3 7 。 可见本方法可以准确地测定酯化反应产物以及 分子蒸馏分离酯化反应产物的轻相和重相中的 F F A 及甘油酯含量 ， 从 而监控酯化反应产物 的组成 以及 优化分子蒸馏 的分离条件。 表 5 本方法测定的不同样品F F A和甘油酯含量 3结论 ( 1 ) 选用合适的耐高温毛细管柱在适 当的色谱 条件下 ， 通过高温气相色谱在较短的时间 内可实现 未衍生化的甘油酯混合 物的分析 ， 获得的色谱 峰信 息丰富， 分离效果好 ， 各种物质保留时间稳定。 ( 2 ) 标准 曲线和加样 回收试 验表 明， 在质量浓 度 0 52 0 0 m g m L范 围具有 很好 的线性 关 系。 F F A、 MA G、 D A G 、 T A G标 准 品平 均 加 样 回收率 在 9 5 6 9 一1 0 5 7 8 之间， R S D在 0 2 7 一 2 9 8 之 间。本方法对各种脂肪酸和甘油酯分析均有较好的 精密度和重复性 。 ( 3 ) 本文建立 的气相 色谱分析方法可 以准确测 定酯化反应合成的甘油酯混合物中甘油酯含量的变 化 ， 从而可监控酯化反应产物 的组成 以及优化分子 蒸馏 的分离条件。 致谢 ： 感谢安捷伦 2 0 1 0大学项 目# 2 1 8 1对本研 究的 支持 ! 参考文献： 1 L 0 s K，C H E O N G L Z， A R I F I N N， e t a 1 D i a e y l g l y c e r o l a n d t r i a c y l g l y c e r o l a s r e s p o n s e s i n a d u a l r e s p o n s e S l l lf a c e o p t i mi z e d p r o c e s s f o r d i a c y l g l y c e r o l p r o d u c t i o n b y l i p a s e c a t a l y z e d e s t e r i fi c a t i o n i n a p i l o t p a c k e d b e d e n z y me r e a c - - t o r J J o u r n al o f A g r i c u l t u r a l a n d F o o d C h e m i s t r y ， 2 0 0 7 ， 55： 55 9 5 5 60 3 2 F A G A N P ，wU E s u N D E R A C，WA T K I N S P D e t e r m i n a t i o n o f mo n o a n d d i a c y l g l y c e r o l s i n m i l k l i p i d s J J o u r n a l o f C h r o ma t o g r a p h y A，2 0 0 4， 1 0 5 4： 2 5 12 5 9 3 G U N S T O N E F D L i p i d s y n t h e s i s a n d m a n u f a c t u r e M B o c a Ra t o n：C RC P r e s s ，1 9 9 9： 2 9 73 3 4 4 邹建凯辛癸酸甘油酯的气相色谱 质谱分析 J 香料 香精化妆品， 2 0 0 2 ( 6 ) ： 1 61 7 5 李长秀， 唐忠， 杨海鹰气相色谱法测定生物柴油样品 中脂肪酸甲酯和脂肪酸甘油酯的含量 J 分析测试学 报 ， 2 0 0 5 ， 2 4 ( 5 ) ： 6 6 6 8 6 P A I K A M J ， K I MB H， L E E B J ， e t a 1 S e p a r a t i o n o f t r i a c y l g l y c e r o l s a n d f r e e f a t t y a c i d s i n mi c r o a l g a l l i p i d s b y s o l i d - p h a s e e x t r a c ti o n for s e p