黄芩总黄酮提取技术及其抑菌活性研究.pdf

时珍国医国药 2 0 0 9年第2 0卷第 6期L I S H I Z H E N M E D I C I N E A N D M A T E R I A M E D I C A R E S E A R C H 2 0 0 9 V O L 2 0 N O 6 药理药化 黄芩总黄酮提取技术及其抑菌活性研究 曾超珍 ， 刘志祥，韩磊 ( 中南林业科技大学生命科学与技术学院， 湖南 长沙4 1 0 0 0 4 ) 摘要： 目的 研究黄芩中的黄酮提取方法和抗菌活性。方法 利用超声波技术通过正交实 验提取黄芩中的黄酮， 杯碟法对 其进行抗菌活性的研究。结果 超声波最佳的提取条件为功率2 3 5 W， 6 0 乙醇， 料液比为1 ：2 0 ， 提取时间为9 m i n ， 黄酮 提取率为 1 0 3 5 。该提取液对金 色葡萄球茵、 枯草杆菌、 大肠杆菌、 黑曲霉、 青霉都有明显的抑菌效果， 最低抑菌浓度分 别为： 1 0 ， 2 0 ， 1 0 ， 0 5 ， 1 0 m g m l ； 最小杀 菌浓度为： 1 0 ， 2 0 ， 2 0 ， 2 0 ， 1 0 m g m l 。结论 超 声波技术是提取黄芩 黄酮的高效方法， 黄芩具有较强的抗茵活性。 关 键词 ： 超声波提取； 黄芩； 黄酮； 抑菌活性 中图分类号： R 文献标识码 ： B 文章编号 ： 1 0 0 8 - 0 8 0 5 ( 2 0 0 9 ) 0 6 1 3 4 2 - 0 1 黄芩 S c u t e l l a r i a b a i c a l e n s i s G e o r g i 为常用中药之一， 是唇形科 植物黄芩的干燥根。其有效成分主要为黄酮类化合物。据报 道， 黄芩黄酮是一类生物活性较强的天然产物， 具有抗菌、 抗病 毒、 抗炎、 抗氧化、 抗肿瘤 、 降血压等作用 。超声波具有加速 药材中有效成分溶解、 缩短提取时间、 提高有效成分的提取率等 优点 ， 因此 ， 本文通过正交实验探讨超声波提 取黄芩黄酮 的最 佳提取条件， 为大规模高效生产黄芩黄酮提供了有力的理论依 据。黄芩黄酮的体外抗菌的研究较少， 本研究将最佳提取条件下 的黄酮提取液对一些细菌 和真菌进行了抑菌实验 ， 旨在开发一种 天然的抑菌剂， 并为临床用药提供理论依据。 1 材料 黄芩购于湖南长沙康尔佳药店， 粉碎过4 0目筛， 8 0 烘干备 用。芦丁对照品购于中国上海医药化学试剂公司； 供试菌种金色 葡萄球菌、 枯草杆菌 、 大肠杆菌、 黑曲霉、 青霉由本实验室保存并 培养 。 2 方法 2 1 提取方法 超声波提取法： 称取黄芩粉5 0 g ， 采用 k( 3 ) 按表 1 方法进 行超声波提取， 提取液过滤， 合并滤液， 定容至 1 0 0 m l ， 摇匀备用。 表 1 因素水平 对 比实验 ： 煎煮法 ： 称取黄芩粉 5 0 g ， 加水 1 0 0 m l ， 浸泡 3 0 mi n ， 煮沸后， 文火煎 6 0 m i n ， 过滤， 共煎煮两次， 合并滤液， 定容至 1 0 0 m l ， 摇匀备用。连续 回流提取法： 称取黄芩粉 5 0 g ， 加 6 0 乙醇 1 0 0 m l ， 水浴 回流 9 0 m i n ， 过滤 ， 共提取两次 ， 合并滤液 ， 定容至 1 0 0 m l ， 摇匀备用 。 2 2 标准 曲线的制作 称取在 1 0 5 C下干燥恒重 的芦丁对照 品 1 0 m g ， 用 9 5 的乙醇溶解 ， 摇匀 ， 定容至 1 0 m l 使之成为浓度为 1 m g m l 的芦丁标准品溶液， 作为储备液备用。量取上述溶液 0 ， 0 1 ， 0 2， 0 3 ， 0 4 ， 0 5 ， 0 6 m l ， 分别加水至3 m l ， 加 5 的亚硝 收稿 日期 ： 2 0 0 8 - 0 5 - 0 6 ； 修订日期 ： 2 0 0 8 -08 1 9 基金项 目： 中南林业科技 大学青年基金项 目( N o 0 6 0 0 7 B) ； 中南林业科技 大学林木遗传育种 学科资助 作者简介 ： 曾超珍 ( 1 9 7 8 一 ) ， 女( 汉族 ) ， 广 西岑 溪人 ， 现 任 中南林业科技 大 学生命科 学与技术 学院讲师 ， 硕 士学位 ， 主要从 事药用植物 的教 学、 科研 工 作 1 3 4 2 酸钠溶液 0 5 m l ， 放置6 m i n ， 加 1 0 的硝酸铝溶液0 5 m l ， 摇匀 ， 放置 6 m i n ， 后加 5 的氢氧化钠溶液 2 5 m l ， 混匀， 放置 1 5 m i n 后蒸馏水定容 1 0 m l ， 用紫外分光光度计在 5 1 0 n m处测其吸光 度 ， 得到回归方程为 ： A= 9 9 3 3 9 C一 0 0 0 1 7 3 ( R = 0 9 9 7 5 ) 。 2 3 黄芩黄酮的抑菌实验 采用杯碟法测定其抑菌作用， 取浓度 1 0 。 1 0 C F U m l 的各种待试菌悬液0 2 m 1 ， 与相应灭菌培养基 l 5 m 1 混合制成混 菌平板 ， 凝 固后 ， 在平板 上等距离放入 4个灭菌 牛津杯 ， 每个 菌设置 3个重复 ， 一个无菌生理盐水 为对照 ， 取 0 1 m l 黄酮提取液加入牛津杯中， 细菌3 7 o C， 真菌2 8 培养 1 8 2 4 h 后， 移去牛津杯， 量取抑菌圈直径， 直径越大抗菌活性越强。 2 4 最低抑菌浓度( MI C ) 和最小杀菌浓度( MB C ) 的测定 用无 菌水将黄芩黄酮提取液稀释， 终浓度分别为 4 ， 2 ， 1 ， 0 5 ， 0 2 5 m g m l 。取 2 m l 提取稀释液至 1 5 m l 培养基 ， 混匀后 ， 倒入平板 ， 凝固后加入 1 0 0 1 0 一1 0 C F U m l的菌液， 涂布均匀， 放至 3 7 2 8 培养 2 4 h 后观察结果。菌落被完全抑制的最高稀释 度提取物浓度即 MI C 。培养 4 8 h后 ， 菌落被完全抑制的最高稀 释度提取物浓度为 MB C 。 表 2 正交实验结果 实验号 因素 提取率 ( ) 6 9 7 6 7 2 7 2 6 0 5 4 5 9 0 6 o 0 51 9 81 0 5 7 6 8 6l 5 5 5 8 48 9 2 4 利用 L q ( 3 ) 正交实验法优化黄芩黄酮提取条件结果( 见表 2 ) ， 各因素对实验结果影响顺序为 CABD， 即乙醇浓度对 黄酮提取率的影响效果最为显著 ， 其次是超声波功率。最佳提取 条件为 c ： D ， ， 即在功率为 2 3 5 W， 料液比为 1 ：2 0 ， 6 0 乙 醇， 提取时间为9 ra i n条件下黄芩提取液黄酮含量最高。以该最 佳提取条件进行验证实验， 黄芩黄酮提取率为 1 0 3 5 ， R S D= 0 7 0 ( n= 6 ) ， 因此该最佳提取条件是可行的。 2 5 提取方法 的比较 结果见表 3 。由表 3可知 ， 超声波提取方 法的提取率明显高于其它两种方法， 且提取时问最短 ， 提取溶剂 用量最少。 一 6 8 O 8 c 一 2 2 3 0 2 ” B一 2 。2 3 2 醯 6 6 7 1 A一 。2 2 2 ，加 一 5 7 7 2 2 3 4 5 6 7 8 9 乜 b R L I S H I Z H E N M E D I C I N E A N D M A T E R I A M E D I C A R E S E A R C H 2 0 0 9 V O L 2 0 N O 6 时珍国医国药 2 0 0 9年第 2 0卷第 6期 表 3 不同的提取 方法与黄酮含量的关系 提取方法 黄酮含量( ) 煎煮法 回流法 超声波法 8 2 5 8 9 O 1 0 3 5 2 6 抑茵圈的确定 结果见表 4 。由表 4可以看出黄芩黄酮提 取液对金色葡萄球菌、 枯草杆菌、 大肠杆菌、 黑曲霉、 青霉都有较 强 的抑菌效果 。而且对细菌的抑制效果强于真菌。 表 4黄芩黄酮提 取液 的抑茵效果 供试菌种 直径 1 mm 金色葡 萄球菌 枯草杆菌 大肠 杆菌 黑曲霉 青霉 CK 1 6 1 1 5 4 1 4 5 7 3 8 ， 7 O 以上结果均为 3个重复试验的平均值 2 7 最低抑菌浓度和最低杀菌浓度的确定 结果见表 5 。由表 5 可知， 黄芩黄酮对金色葡萄球菌、 枯草杆菌、 大肠杆菌、 黑曲霉、 青 霉的最低抑菌浓度分别 1 0 ， 2 0 ， 1 0 ， 0 5 ， 1 0 m g m l ； 最小杀 菌浓度为 1 0 ， 2 0， 2 0 ， 2 0， 1 0 m g ml 。 3讨论 目前 ， 黄芩总黄酮的提取方法有水煎煮法 、 乙醇提取法 、 超声 波法、 超滤法、 微波提取法、 高速逆流色谱法、 亚临界水提取法等 多种方法 。 本实验用水煎煮法 、 乙醇 回流提取法 、 超声波提取 表 5 黄芩黄酮最低抑菌浓度和最小杀菌浓度 实验号C 黄 m 酮 g 浓 m 度 l-， 1 4 2 2 3 1 4 0 5 5 0 2 5 金色葡萄球菌 枯草杆菌 大肠杆菌黑曲霉 2 4 h 4 8 h 2 4 h 4 8 h 2 4 h 4 8 h 2 4 h 4 8 h 一 4 -4- 一 - - + + + + + + 一 + + + + + + + + + 青霉 2 4h 48h “ 一 ” 表不无菌生长 ； “+” 表不有 菌生长 法比较黄芩总黄酮的提取率， 结果表明， 超声波提取法的效率最 高， 达 1 0 3 5 ， 提取时间最短。黄酮类化合物是药用植物的一 大类有效成分， 具有多种生物活性， 主要的作用之一是抑菌或杀 菌。本实验结果表明， 黄芩黄酮对真菌的有一定的抑制作用， 是 一 种天然的抑菌剂， 有望用于食品保藏 ， 抗菌消炎等， 为黄芩的综 合利用开辟了新的途径 。 参考文献 ： 1 宋双 红 ， 张 媛 H P L C测 定不 同产 地黄芩 中黄 酮化合 物 的含量 J 中国中药杂志 ， 2 0 0 6， 3 1 ( 7) ： 5 9 8 2 关 晓燕 ， 杨洁 黄芩药 理研 究概 况 J 中国医药信 息 ， 2 0 0 6， 2 3 ( 4 )： 2 1 3 姚干 ， 何宗玉 ， 方积年 黄芩总 黄酮提取及 纯化工艺 的研 究 J 中成药 ， 2 0 0 6， 2 8 ( 1 1 )： 1 5 6 8 4 曾超珍 ， 刘 志祥 ， 吴耀辉 ， 等 超声波提取甘草黄酮及其抑菌活性研 究 J 时珍国医国药 ， 2 0 0 7，1 8 ( 1 0 ) ： 2 4 0 2 5 王梅芳 ， 武坚锐 ， 杨小玲 ， 等 黄芩总黄酮提取工艺的优化 J 基层 医学论坛 ， 2 0 0 6， 1 0 ( 1 1 )： 9 6 6 文献综述 运用功能磁 共振成像观察大脑 中的针刺效应 赵凌 ，游 自立 ， 唐 ( 1 成都中医药大学针灸推拿学院， 四川 成都6 1 0 0 7 5 ； 勇 ，梁繁 荣 2 电子科技大学生命学院 ， 四川 成都6 1 0 0 5 4 ) 摘要：功能磁共振成像( f M R I ) 作为一种无创的、 实时监测的、 无有害辐射的现代神经影像技术已经广泛运用于大脑针 刺效应研究的诸多方面， 其应用前景还可从科研设计更加严谨、 密切结合疾病状态、 结合 多种手段深化研究内容等方面 加 以拓展 。 关键 词 ： 功能磁共振成像 ； 针刺效应； 神经影像 中图分类号 ： R 2 4 5 文献标识码 ： B 文章编号 ： 1 0 0 8 - 0 8 0 5 ( 2 0 0 9 ) 0 6 1 3 4 3 -03 针灸作为治疗疾病的手段已经有二千余年的历史， 其临床疗 效已逐渐被国际社会公认。世界卫生组织 ( WH O) 确认并推荐 4 3种疾病属于针灸治疗的优势病种。阐明针灸治疗疾病的机理 是明确临床疗效的基础， 同时也促进着临床的发展。针灸学理论 认为， 针刺是通过在人体某些腧穴上采用一定的刺激方法来激发 “ 经气” ， 使发挥传导感应 、 运行气血、 协调阴阳、 调整虚实的作 用， 从而达到治疗疾病的目的。结合现代研究结果， 人们普遍推 测， 针刺激发了人类复杂的本体感觉， 调控着对疼痛的知觉和认 收稿 日期： 2 0 0 8 _ 0 8 6 ； 修订 日期 ： 2 0 0 8 1 0 2 3 基金项目： 国家“ 9 7 3 ” 重点基础研究发展 计划( N o 2 0 0 6 C B 5 0 4 5 0 1 ) ； 国家 自然基金项 目( N o 3 0 7 7 2 8 3 5 ) 作者简 介： 赵凌( 1 9 8 0 ) ， 女 ( 汉族 ) ， 四川成 都人， 现任成 都 中医药大学 讲师 ， 硕 士学位 ， 主要从事针 灸治疗脑血 管疾病研究工作 通讯作者简 介： 梁繁 荣( 1 9 5 6 ) ， 男( 汉族 ) ， 湖 南人 ， 现 任成都 中医药大 学针灸推拿学院教授， 博士生导师， 硕士学位， 主要从事经穴特异性研究 工 作 知； 针刺产生效应的基础可能与大脑和相关的中枢神经系统网络 有关 。功能磁共振成像 ( F u n c t i o n a l Ma g n e t i c R e s o n