补加前体L-蛋氨酸对高密度发酵生产S-腺苷-L-蛋氨酸的影响.pdfVIP

2 2卷2期 2 0 0 6年 3月 生物工程学报 C h i n e s e J o u r n a l o fB i o t e c h n o l o g y V0 1 2 2 No 2 Ma r c h 2 0 0 6 补加前体 L 蛋氨酸对高密度发酵生产 S 腺苷 L 蛋氨酸的影响 Effe c t o f Fe e d i ng Pr e - L m e t h i o n i ne o n Hi g h- c e l l - d e n s i t y Fe r m e n t a t i o n f o r S- a de n o s y l - L- m e t h i o n i n e Pr o d u c t i o n 刘沛溢， 董函竹， 谭天伟 L I U P e i Yi ，DONG Ha n Zh u a n d T AN T i a n We i 北京化工大学 生命科学 与技术学 院， 北京 l o o 0 2 9 C o l le g e o fL if e 诂 a n d T e c h n o l o g y， B e ij i n g U n i v e r s i t y o fC h e m i c a l T e c h n o lo gy ， B e ii n g 1 0 0 0 2 9 ， C h n a 摘要将高密度发 酵技 术成功应用于 S - 腺 苷一 【 广 蛋 氨酸 的生产。考察 了补 加前体 【 广 蛋氨酸 的量 以及补 加策 略对酿 酒酵母 G I 4发酵生产 S 腺苷 【 广 蛋氨 酸的影响。实验发现补加前体 【 广 蛋氨酸能明显促进 S 腺苷 【 广 蛋氨酸的积 累。 同时还发现不 同的 补加策略时茵体 浓度 以及 s 腺 苷 【 广 蛋氨 酸的产量和 浓度有 不 同的影响 。确 定 了补加 L - 蛋氨 酸不应低 于 0 7 s 1 0 g茵体 干重。 比较 了五种不 同的补 加前体 【 广 蛋氨 酸的方式。结果表 明在 茵体 干重达到 高密度 的情 况下( 1 2 0 g L ) 补 加前体 【 广 蛋氨 酸进行 转 化生产 S 腺苷 【 广 蛋氨酸能达到比较好 的效果： 一次性补加 9 g L - 蛋氨 酸， S A M 的积 累量在 补加后 的 1 8 h达 到最 高， 为 4 3 l L ； 采取流加方式补 加 L - 蛋氨 酸， 流加速率为 2 g h ， 共流加 5 h ， 流加 结束 2 8 h后 S A M达到最高积 累量后者 达到 4 9 8 L 。两者最终 的 生物 量 均 可 达 到 1 3 0 g L以 上 。 关键词 s 腺苷一 【 广 蛋氨 酸，高密度发酵 ， 中图分类号T Q 9 2 2 文献标识码A 补 加 策 略 ，酿 酒 酵母 文章编号 1 0 0 0 3 0 6 1 ( 2 0 0 6 ) 0 2 0 2 6 8 0 5 A b s t r a c t T h e y i e l d o f S - a d e n o s y l L - m e t h i o n i n e ( S A M)b y s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e f e r m e n t a t i o n w a s a ff e c t e d b y t h e s t r a t e g y o f f e e d i n g L - me t h i o n i n e T h e e ff e c t s t h a t f e e d i n g s t r a t e g i e s a n d t h e a mo u n t o f p r e c u r s o r L - me t h i o n i n e h a d o n t h e p r o d u c t i o n o f S AM b y s a c c h a r o my c e s c e r e v i s i a e G1 4 w e re i n v e s t i g a t e dTh e res u l t s s h o w e d t h a t f e e d i n g L - me t h i o n i n e c o uld o b v i o u s l y i mp r o v e the a c c u mula t i o n o f S AM ，a n d b o t h t h e b i o ma s s a n d S AM y i e l d r e l l e d h e a v i l y o n d i fi e ren t f e e d i n g s t r a t e g i e s I n o u r wo r k，i t wa s fou n d tha t t o t a l a mo u n t o f L - me t h i o n i n e a d d e d s h o u l d b e n o l e s s tha n 0 7 g p e r 1 0 g r a ms o f d r y c e l l we i g h t F i v e d i ff e ren t f e e d i n g s t r a t e g i e s h a d b e e n i n v e s t i g a t e d i n o u r e x perime n t ，a n d s u c h c o mp a ris o n i n d i c a t e d t h a t f a v o r a b l e res u l t s c o uld be a c h i e v e d as the b i o m a s s rea c h e d t h e s t a t u s o f h i g h c e ll d e n s i t y( 1 2 0 g L ) I f 9 g r a m s o f t h e p re c u rso r L - m e t h i o n i n e w a s i n t r o d u c e d o n c e a n d f o r a l l ，t h e a c c u mu l a t i o n o f S AM rea c h e d ma x i mu m o f 4 31 s L a t t h e 1 8 t h h o u r a f t e r a d diti o n ；i f the p rec u rso r a mi n o a c i d W as f e d a t a r a t e o f 2 g h i n 5 h， ma x i mu m y i e l d o f 4 9 8 g L Was a c h i e v e d a t t h e 2 8 th h o u r aft e r f e e din g Th u s h i g h c e ll d e n s i t y f e rm e n t a t i o n c a n be s u c c e s s f ull y a p p l i e d t o S AM p r o d u c t i o n b y S a c c h a r o my c e s c e r e v i s i a e w i t h t h e c o n s e q u e n c e o f o v e r 1 3 0 g L o f b i o mass g a i n e d u s i n g the a bov e t wo s t r a t e g i e s Ke y wo r d s S - a d e n o s y l L - me t h i o n i n e，h i g h c e ll d e n s i t y f e r me n t a t i o n，f e e d i n g s t r a t e g y，s a c c h a r o my c e s c e r e v i s i a e Re c e i v e d： D e mb e r 7， 2 0 0 5；Ac c e p t e d：J a n u a r y 5，2 0 0 6 T h is w o r k w a s s u p p o r t e d b y t h e g r a n t s f r o m t h e N a ti o n a l N a t u r a l S c i e n c e F o u n d a t i o n o f C h i n a( N o 2 0 3 0 6 0 0 2 ) ， the Hi T e c h R e s e a r c h and D e v e l o p m e n t P r o g r a m ( “ 8 6 3 ”P r o g r a m)o f C h i n a( N o 2 0 0 2 A A 2 1 7 0 2 2 ) * C o r r e s p o n d i n g a u tho r T e l ： 8 6 - 1 0 6 6 4 1 6 6 91 ：E ma i l ：twt a n ma i l b u c t edu c n 国家 自然科学基金 资助项 目( N o 2 0 3 0 6 0 0 2 ) ， 国家高技术研究发展计划( 8 6 3 ) 项 目( N o 2 0 0 2 A A 2 1 7 0 2 2 ) 资助。 维普资讯 刘沛溢等 ： 补加前体 L蛋氨酸对高 密度发酵生产 腺苷一 L蛋氨酸 的影响 S 腺 苷 L 蛋 氨 酸 ( S a d e n o s y l - L - m e t h i o n i n e ， S A M e 或 S A M) 是一种广泛存 在于活体细胞 内的生物小分 子 ， 分子 量为 3 9 9 。细胞 内的 S A M是 由 A T P： 蛋氨 酸 腺苷 转 移 酶 ( MA T ) 催 化 等 分 子 的 L - 蛋 氨 酸 和 A T P 合成得到的。S A M是 甲硫键型高能化合物 ， 其合 成是一 个高 能耗过 程 ； A T P既 是 S A M 合成 的关 键性 前体 之一 ， 又 为 S A M 的合 成提供 必要 能量 ， 在 S A M 合成 中起着 十分关 键 的作用 。 S A M对人体生理功能发挥着重要作用， 作为基 团的提供 者 和 酶 的诱 导 剂参 与 多 种 关 键 的生 化 反 应 ， 如脂类 ， 核酸， 蛋白质的甲基化 ， 对保持细胞膜质 的流动性以及肝脏内谷胱甘肽的水平具有重要的作 用 。在临床 中用于肝病b 和抑郁症b 的治疗 ， 对 关节炎 、 纤维 性肌痛 和偏 头疼 也 有很好 的作 用 。 因此具有十分广阔的市场前景。 S A M 的生 产制备 方法 主 要 有化 学 合 成 法 、 发 酵 法和酶 促转化 法三种 。文献报 道酵母 细胞 可 以有 效 地积累 S A M， 采用发酵法通过在培养基中加入前体 L 蛋氨 酸来合 成 是 目前 工 业 规 模 生 产 S A M 的 主 要 方法 ， 但 酵 母 的 发 酵 水 平 不 高 ， 一 般 在 1 0 0 0 3 0 0 0 m egL ， 在相对 大量 的 L 广 蛋 氨酸存 在 条件 下 ， 酵 母 细 胞 无 论 生 长 、不 生 长 都 可 积 累S A M，如 S a c c h a r o m y c e s ， C a n d i d a， H a n s e n u l a等 。其 中 ， 酿 酒 酵母 属微生 物具有 较高 的过量 积 累 S A M 的能力 ， 是 最常 用 的微 生 物 。 目前 对 S A M 的生 产研 究 还 处 于 初级 阶段 。S c h l e n k等 用 从 富 含 L 蛋 氨 酸 的面 包 酵母 中提取 S A M， 取得 了一定 的进展， S A M含量 达 到5 O egg ( D C W) ， 但生物量很低 ， 无法形成可行 的生 产工 艺 。Ma r t h e w s等 则 利 用 基 因 工 程 手 段 ， 将 S A M合成 酶 的基 因片段 克 隆 到 E c o l i ( m e t K ) 中 表 达 ， 从 中提取酶 用于 S A M 的合 成 ， 尽管 产 物纯 度 高 ， 但 成本非 常 昂贵 ， 不适 合 工 业 化生 产。 国 内学者 近 年来 也 开展 了有 关 S A M 的研 究 ， 与 国 外 相 比， 国 内 的研究 尚处于 实验 室水平 上 。刘 慧等 利 用 啤酒 厂 废 酵母联 产 S A M 和谷胱 甘肽 ( G S H) ， S A M和 G S H含 量分别 达 到 4 5 egg ( D C W) 和 1 8 e g g ( D C W) ， 生 物 量 为 3 5 g L 。王远山 训等人从土壤中筛选 的酵母菌株产 量达到 8 6 1 m g L 。陈小龙等 川 对培养基和发酵条件 进行 优化 ， S A M 积 累量 达到 1 9 4 6 m egL 。李 东 阳等 人 刘 在 P i c h i a p a s t o r i s 表 达酿 酒 酵 母 s a m 2基 因 ， 发 酵 7 d后 产 量 为 1 7 2 egL 。但 国 内还 尚无 S A M 规 模 化生产的报道 ， 对 S A M的研究仍是当前急需解决的 问题 。 本 文将 高 密 度 发 酵 平 台技 术 成 功 应 用 于 S A M 发酵 ， 考察了补加前体 L 广 蛋氨酸的策略和补加量对 S A M积累的影响。通过在菌体高密度 的条件下以 速率为 2 g h流加前体 L 蛋氨酸 5 h ， S A M的积累量可 达到 4 9 8 g L 。进一步证实 了高密度发酵平 台技术 的通用性 ， 并 为 S A M工 业化 奠定 了一定 的基 础 。 1 材料和方 法 1 1菌株 酿酒酵母 S A M 0 4 G 1 4由本实验室保藏。 1 2 培 养 基 1 2 1 斜 面培 养 基 ： 麦 芽 汁 1 O L 、 酵母 粉 3 egL 、 蛋 白胨 5 egL 、 葡萄 糖 1 0 egL 、 琼 脂 2 0 egL 。 1 2 2 种子 培 养 基 ： 葡 萄糖 3 O | ； L 、 酵母 粉 6 egL 、 磷 酸氢二 铵 3 g L 、 硫 酸 镁 0 8 egL 、 磷 酸 氢 二 钾 l egL 、 磷 酸 二氢钾 1 L 。 1 2 3 发酵培养基 ： 葡萄糖 5 O g L 、 酵母粉 1 5 egL 、 麦 汁 6 0 L 、 磷 酸 氢 二 铵 1 O g L 、 硫 酸 镁 5 egL 、 玉 米 浆 1 6 egL 、 磷 酸 氢 二 钾 l egL 、 磷 酸 二 氢 钾 l egL 、 z 1 0 m egL 、 1 0 m g L 、 C u “6 m egL和 Mn “6 m egL 。 1 3 分 析方 法 1 3 1 细 胞 干 重 ( D r y C e l l We i g h t ) D C W 的测 量 方 法 ： 取 一定 体积 的发 酵液 经 4 0 0 0 d ra i n离 心 1 0 ra i n后 收集菌体 ， 用去离子水洗 2次后 1 0 5 c I ： 下烘 2 h后称 重 ， 计 算 出细胞 的质量 浓度 。 1 3 2 葡萄糖 浓 度 的测 定 ： 用 酶膜 法 ( 生 物 传感 分 析 仪 S B A 4 0 C ， 山东省农 科 院) 。 1 3 3 S A M 含 量 的测 定 ： 发 酵 液 离 心 ( 4 0 0 0 d ra i n ) 1 0 ra i n ， 收集菌体， 蒸馏水洗后用 1 5 m o l L的高氯酸 室温 破 碎 1 5 h 。离 心 ( 4 0 0 0 d ra i n ) 1 0 ra i n收 集 上 清 液 ， 适 当 稀 释 后 采 用 高 效 液 相 色 谱 法 定 量 分 析 。 H P L C条件 ： A g i l l e n t C l 8 柱 ( 2 5 0 n m4 6 m m) ； 流 动相 ： 0 0 1 m o l L的 甲酸 铵 ， 用 甲 酸 将 p H 值 调 至 3 0 ； 流 速： 1 0 m L m i n ； 检测 波 长： 2 5 6 n m； 柱温 ： 2 5 ； 进样 量 ： 5 p t L 。标 准 品 ( 购 自 S I G M A公 司) 峰 面 积 与 浓 度 关系作 出标准曲线 ， 样品在 2 5 6 n m的峰面积代入标 准 曲线换 算得 到 S A M 的含量 。 1 4 发酵 罐培 养 全 自动发酵罐 5 L ( 上海保兴) 中装液量 2 L ， 接 种量 1 0 ( 体积分数) ， 前 2 h搅拌转速为 2 0 0 d ra i n ， 之后按每小时提高 1 0 0 r m i n逐 步提高到 6 h的 6 O O d ra i n ， 以后 一直 维 持在 6 0 0 r m i n ， 通气 量 为 2 L m i n ， 温度控制在 3 0 C， p H值采用氨水控制在 5左右， 外 接 乙醇在 线测 定仪 ( 华 东理 工 大学 ， 上海 ) 。 当底糖 浓度 低于 1 L时 开始流 加 葡萄糖 。底糖 消 耗完 后 ， 维普资讯 2 7 0 C h i n e s e J o u r n a l o fB i o t e c h n o l o g y生物工程学报2 0 0 6 ， V o 2 2 ， N o 2 通过控制流加葡萄糖的速率 ， 维持 乙醇含量逐步下 降 ， 葡 萄 糖 积 累 量 不 高 于 l g L来 达 到 高 密 度 发 酵 ” 。实 验结果 由 3 次 的平 均值 得到 。 2 结果 2 1 不 补加 前体 L 。 蛋 氨酸 的发酵 不补加前体 L - 蛋氨酸考察 S A M的积累， 通过维 持乙醇的低积累率 来达到高密度发酵。实验 结 果见 图 1 。 0 l 0 2 U 3 U 4 0 50 图 1 无前体 蛋氨酸高 密度 发酵生产 S A M F i g1 His h c e l l d e n s i t y f e r me n t a t i o n f o r SAM p r o d u c t i o n wi t ho u t L- me t h i o n i n e 在没有前体 L - 蛋氨酸的条件下 ， S A M的积累量 很低 ， 最 高 为 0 4 2 g L 。生 物 量 可 以 达 到很 高 ， 发 酵 结束 时为 1 3 0 3 g L 。 2 2前体 补加量 对 S 积 累量 的影响 在摇瓶培养 2 4 h后 ， 对 于每 l O g干重菌体的发 酵液分别加入 0 1 1 5 g L - 蛋氨酸 ， 转化 2 4 h后测量 S A M 积 累量 ， 见 图 2 。 E 们 -0 2 00 0 2 04 06 0 8 l 0 l 2 1 4 1 6 L - me t h io n i n ( g 1 0 g DCW) 图 2 补加前体的量对 S A M积 累的影响 F i g2 Effe c t o f L -me t hio n i n e c o n c e n t r a t i o n o n S AM p r o du c t i o n 从图 2可以看到， 不同补加量对 S A M积累的影 响， 在补 加 L 广 蛋氨 酸的 量达 到 0 7 1 0 g菌 体干重 时 ， S A M积累量基本不变。考虑到高密度发酵干重 达 到 1 3 0 g L 。所 以补 加 L 广 蛋 氨 酸 总 量 量 不 应 低 于 9 g。 2 3前体 补加 时 间 对 生物 量 。 S A M 积 累量 和 S A M 含量 的影 响 摇瓶考察 03 0 h内不 同时间补加前体 L 广 蛋氨 酸( 0 7 g l O g菌体干重 ) 对 S A M 积累量的影响。结 果 见图 3 。 | 卜 -b i oma s s E 笔 墨 图 3 不同时间补加前体 L蛋氨酸对生物量 ， S A M积 累量 和含量 的影响 F i g3 Effe c t o f t h e a d d i t i o n t i me o f L - me t lMo n i n e o n b i o ma s s ，S AM y i e l d a n d S AM c o n c e n t r a t i o n 由图 3可以得到 ： 生物量随着补加时间的后移 而 明显 增加 ， 这 是 由于 L 广 蛋 氨酸 影 响细胞 生 长和 增 殖所造成的。而 S A M 积累量随着补加时间的后移 先呈 明显 增加 趋势 ， 在 2 5 h时补 加 L - 蛋 氨酸 S A M积 累量 达到最 高 ， 2 5 h后有 明 显 的下 降趋 势 ， 原 因可 能 是 S A M合 成酶 总量 随细胞 数量 增加 而 增加 ， 而后 期 酶活下降。S A M含量随补加时间后移呈下降趋势。 由图 3的信息 ， 提 出下面 5种在发酵罐上 的补 加 策略 ： ( 1 ) 在 培 养 基 中加 入 L 广 蛋 氨酸 ； ( 2 ) 在 发 酵 前期 ( 底糖耗尽后 ) 流加 L 广 蛋氨酸 ； ( 3 ) 在菌体达 到 高密度时一次性补加( 0 7 g l O g干菌体) ； ( 4 ) 在菌体 密度达到 比较高水平 ( 6 0 g L ) 时进行流加 ； ( 5 ) 在高 密度菌体条件下进行流加。 2 4 在培 养基 中加入 L 蛋氨酸 在培养基中加入 5 g L 蛋氨酸。至 5 0 h发酵结 束 。图 4表示 了培养基 中加入 L 广 蛋氨酸后 的实 验 结果 。 由图 4可 以看 到 S A M 的 积 累 量 是 逐 渐 升 高 又 缓 慢 下降 的 ， 原 因可能 是生 物量 的 增加 与 S A M 的 积 累都是耗能过程 ， 所 以当菌体生长能量不足时会分 解 S A M而 释放其 中的能 量。最 高产 量达 到 1 5 1 0 ，s g 0 目 g甚0 u 苫 加 m 舳 印 如 一 ， 8 g0 I丑 一 ， 8 ) ， 们 O 8 6 4 2 O O O O O O u 0 焉扛u a 芒8 8 三0 ， 【1 0 丹 暑 8叠 8 1 0 磊 暑叫 如加m舳为如们如加 m O 一 嚣g 维普资讯 刘沛溢等 ： 补加前体 I 广 蛋 氨酸对高 密度发酵 生产 S - 腺苷- I 广 蛋氨酸 的影响 2 7 l 溟 焉 鲁 8 8 磊 舌 z O U I U 2 0 jU 40 U 图 4 培养基 中加入 I 广 蛋氨酸 F i g4 F e r me n t a t i o n wi t h L - me t hi o n i n e i n c u r t u r a l me di a g ， L ， 此 时生物 量 为 5 8 g ， L 。生 物 量 仅 有 不补 加 蛋 氨酸实 验 的 4 4 6 ， 可 见蛋 氨 酸 对 于菌 体 生 长有 很 大 的抑 止作用 。 2 5 在 发酵初 期 ( 底糖耗 尽 时 ) 流 加 L 蛋氨酸 由图 3可 以看 到 ， 发酵 初期 补加 L - 蛋 氨 酸 ， S A M 含量较后 期 高 4 0 左 右 。 考虑 到 L 一 蛋 氨 酸 对 菌 体 生 长 的抑 止 ， 选 择 发 酵 初 期 流 加 低 浓 度 的 L 一 蛋 氨 酸 。在 底糖 低于 1 g ， L时 ， 以 0 1 g h流加 L蛋 氨酸至 发酵结 束 ， 实验结 果见 图 5所示 。 漠 8 参 l O U I U 2U 3 0 40 5 0 O U 7 0 踟 图 5在发酵初期流加 I 广 蛋氨酸 Fi g5 L - me t h i o n i ne wa s f e d a t a r a t e o f0 1 g h i n t h e i n i t i a l p e r i o d o f f e rm e n tat i o n 从 图 5看 到 ， 发 酵 3 6 h后 ， S A M 最 高 产 量 达 到 1 9 7 g L ， 此 时生 物量 为 5 7 7 g L ， 与图 1 相 比 ， 生 长滞 后 1 2 h 。最 终 生 物 量 比不 补 加 L蛋 氨 酸 的实 验 低 3 8 1 。S A M积 累量达 到最 高后也 有 比较 明显 的分 解 趋势 。 2 6 在 菌体达到 高密度时一次 性补加前 体 L 蛋 氨酸 在菌体 密 度 达到 1 2 0 g L时 ， 按 每 1 0 g 菌 体 补加 0 7 g L - 蛋氨酸 计 ， 一次性 补加 9 g L蛋 氨 酸 。实验 结 果 如 图 6 所 示 。 漫 量 晷 磊 毒 U I U 2 0 - 4 0 40 U o u ， U 图 6 高密度条件下一次性补加 L - 蛋氨酸 Fi g 6 L - me thi o ni n e a d d ed o n c e f o r a l l u n d e r the c o n d i t i o n 0 f h i g h c e l l d e n s i t y 在 补加前 体 L蛋 氨酸 前 ， S A M 积 累量 增 长很 缓 慢 ， 当生 物量 达 到 1 2 0 g干菌 体 时 ， S A M 积 累量 仅 有 0 4 g L 。加 入 前 体 L蛋 氨 酸 后 S A M 积 累量 迅 速 增 长 ，补加 L 一 蛋 氨酸 1 8 h后 ， S A M 积 累 量 达 到 最 高点 4 3 1 g ， L ， 生物量最终达到 1 3 0 g L 。达到最高点后有 明显下 降 的趋 势 ， 原 因可 能 是 菌 体 达 到 生 长 极 限 ， S A M合成酶数量不再增加， 而 S A M转甲基酶开始起 主导作 用 “ J 。 2 7 在菌体 密度达 到比较高水 平 ( 6 o g ， L) 时进 行 流加 菌体密度 达 到 6 0 g ， L时 流加 L蛋 氨酸 ， 速 率 为 0 7 g h 。流加直至发酵结束 ， 维持过量 的 L 一 蛋氨酸 以防止 S A M 的分解 。发 酵结果 如 图 7所示 。 漫 鲁 8 8 磊 参 们 l O 0 1 0 2 O 3 O 4 O 5 O 6 0 7 O 图 7 在菌体密度达到 比较高水平 ( 6 0 g L ) 时进行 流加 Fi g7 L- me thi o n i n e Wa S fed a t a r a t e o f O 7 g h wh e n the c e ll d e n s i ty r e a c he d 6 0 g L 一 5 4 3 2 l O ， u o 焉扫 目 。 口 o 。冀o 。 三0 加 m O 加 m 加 m O 一 ， 暑 一 ， s 吕。 菌 。 D 1 葛扫 口 0 口 o 0冀8 n l0 如 加 m O 加m 0 一 ， 暑 一 ， s 吕。 苗 。 ) I苗扫矗0 皇 o 0冀8 n l0 加 m 5 O 加 m 0 一 ， 暑 一 ， s 暑D I 更， u o 一 营 g0 口 o 0 8n l0 棚 啪 伽 加 一 一 ， s g0 I 维普资讯 C h i n e s e J o u r n a l o fB i o t e c h n o l o g y生物工程 学报2 0 0 6 ， V o 1 2 2 ， N o 2 在菌体 密 度 达 到 比较 高 水 平 ( 6 0 g L ) 时进 行 流 加 ， S A M 最 高 积 累 量 达 到 2 1 3 g L ， 生 物 量 达 到 8 3 g L 。可 以 看 到 ， 当 L 一 蛋 氨 酸 流 加 后 的 3 0 h到 6 0 h ， S A M积 累 量 很 快 提 升 至 2 1 3 g L ， 生 物 量 增 长 很 缓 慢 ， 从 6 2 g L提 升 至 8 1 g L ， 蛋 氨酸 对 细 胞 增 殖 的 限 制 作用也 比较 明显 。 2 8 在 高密 度条件 下进 行流加 分解趋 势很 明显 。而 流加 前 体 L 广 蛋 氨 酸 ， S A M 积 累 量增高缓慢 ， 在流加结束后 2 8 h达到最高点， 达到最 高点后分解也 比较缓慢 ， 原因可能是采用流加方式， S A M 积 累 比较 慢 ， 细 胞 对 S A M 有 比 较 好 的 适 应 能 力 。 R E F E R E N C E S ( 参 考文献 ) 0 l 0 Z U 3 0 4 0 5 0 6 0 0 8 0 90 t h 图 8 高密度条件下流加 I 广 蛋氨酸的发酵结果 F i g8 L - me t h i o n i n e wa s f e d a t a r a t e o f2 g h i n 5 h o u r s u n d e r t h e c o n d i t i o n o f h i g h c e l l d e n s i t y 补 加 前 体 时 已 经 达 到 很 高 的 菌 体 密 度 ( 1 2 0 g L ) ， L 一 蛋氨 酸加入 后 S A M快 速积 累 ， 在 开始 流加后 的 2 8 h后达 到最 高值 。在 流 加后 ， 菌体 基本 停 止 生 长 ， 最 终生 物量 为 1 3 2 g L ， S A M积 累量 达到 4 9 8 g L 。 达到最 高 点后 ， 分 解趋 势 比较缓慢 。 3 结论 在发 酵法生 产 S A M 的过 程 中 ， L 一 蛋 氨酸 是 必需 的前体 ， 其 补 加量 对 S A M 的产 量 、 含 量 以 及 生物 量 都有很 大 的影 响。本 文 首 先确 定 了补 加 L 一 蛋 氨酸 的量不应 低于 0 7 g 1 0 g 菌体 干重 。然后 对五 种补 加 策略 的 比较 发 现 L 一 蛋 氨 酸 在 菌体 达 到 高 密度 以后 再 加入发 酵体 系 ， 进 行 转 化 生 产 S A M， 可 以避 免 L 一 蛋 氨酸对 菌体 生长 的抑止 。在 菌体 达到高 密度条 件 下 一次性 补加蛋 氨 酸 效果 比较好 ， S A M积 累量 达 到 4 3 1 g L ， 菌体 干重 达 到 1 3 0 g L 。在 高 密度 条 件 下 流 加效果最 为 明显 ， S A M最 高 积 累 量 为 4 9 8 g L ， 生 物 量 1 3 2 g L 。 比较 图 6和图 8 ， 可 以发 现 ， 同样 是 高 密 度发酵 ， 一次 性补 加前体 L 蛋 氨酸 S A M 积 累量增 高 很迅 速 ， 在 补加 1 8 h 后 即达 到最高 点 ， 达 到最 高点 后 7 8 9 1 O 1 1 1 2 1 3 1 4 S c h l e n k F，Z y d e k CR，E h n i n g e r DJ e t u1 I 1 le p r o d u c t i o n o f S a d e n o s y l l me t h i o n in e a n d S a d e n o s y l - l e t h io n i n e b y y e a s t En z y mo fog a，1 9 6 5 ， 2 9： 2 8 3 S h i o mi N， F u k u d a H ， Mu r a t a K e t u1 I mp r o v e me n t o f S a d e n o s y l m e t h i o n i n e p r o d u c ti o n b y i n t e g r a t i o n o f t h e e thi o n i n e r e s i s ta n c e g e n e i n t o c h r o mo s o me s o f t h e y e a s t S a c c h a r o m y c e s c e r e v is i a eA p p l Mi c r o b io Z B i o t e c h n o 1 1 9 9 5 4 2： 7 3 07 3 3 L u S CRe v i e w urti c le：S - Ad e n o s y l me thi o n i n e I n t e r J B ioc h e m c e l l Bio，2 0 0 0， 3 2： 3 9 l一3 9 5 C h a r le s S LRo l e o f S - a d e n o s y l - L - me t h i o n i n e i n t h e t r e a t me n t o f l i v e r d i s e a s e s J H ep a t o fo g y ，1 9 9 9 ， 3 0 ( 6 ) ： l 1 5 5一l 1 5 9 G o b b i J ， J an i r i L， Cian e o n i P e t u1 An t i d e p r e s s a n t a c t i v i t y o f S - a d e n o s y l- L - me t h i o n i n e ( S AMe) ： E ff e c t s o n n e u r a l r e s p o n s e s t o e x c i t a t o r y a m i n o a c i d s B io fo g c dd P s y c h a t r y，1 9 9 7 ， 4 2 ( 1 ) ： 6 8 S c h l e n k F，Z y d e k C R， E h mn r DJ e t u1 I 1 l e p r o d u c t i o n o f S a d e n o s y l - 1 - me thi o n i n e an d S - a d e n o s y l - l e t h i o n i n e b y y e a s t En z y mo l o g i a， 1 9 6 5， 2 9： 2 8 3 S h io z a k i S， S h i mi z u S， Ya ma d a H S - Ad e n o s y l - L - me thi o n i n e p r o d u c t i o n b y S a c c h a r o my c e s s a k e ： o p t i mi z a t i o n o f the c u l t u r e c o n d i t i o n s f o r t h e p r o d u c t io n o f c e l l s wi th h i s h S - Ad e n o s y l - L - me t h i o n i n e c o n t e n t A g r ic u l t u r a l Biofog i c ul C h e mi s t r y ，1 9 8 9，5 3 ： 3 2 6 93 2 7 4 Ma r t h e ws RG， Ne i d h a r d t F C Ab n o r ma l i n d u c t i o n o f h e a t s h oc k p r o t e i n s i n a n E s c her i c h i n a c o l i mu ta n t d e f i c ie n t i n A d e n o s y l m e t h i o n in e s y n t h e t a s e a c t i v i t y J B t e r i o l ， 1 9 8 8 ， 1 7 0 ( 4 ) ： 1 5 8 21 5 8 8 L i u H，L i n J P，C e n PL e t u1 C o - p r